LncRNA TTN-AS1調(diào)控miR-139-5p/PDK1/AKT/Caspase-3信號通路促進(jìn)鼻咽癌的生長和轉(zhuǎn)移

劉春江，司峰志

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科，新疆 烏魯木齊 830092)

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，起源于鼻黏膜上皮組織[1]，雖然鼻咽癌細(xì)胞對放療敏感，但由于鼻咽癌的發(fā)生部位隱匿，在早期不容易被發(fā)現(xiàn)及診斷，患者往往在確診時已處于中晚期，為腫瘤的治療帶來一定的困難；中晚期鼻咽癌患者5年生存率不足50%、嚴(yán)重威脅患者生命健康[2-3]。因此，深入研究鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)意義重大。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是近年來被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控腫瘤病理過程且具有成為腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)潛力的非編碼RNA[4]，可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。在鼻咽癌中，lncRNA FAM225A可通過調(diào)控miR-590-3p/miR-1275促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[6]，lncRNA SNHG7可調(diào)控上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)鼻咽癌的生長[7]。LncRNA TTN-AS1(TTN-AS1)可調(diào)控多種腫瘤，如TTN-AS1結(jié)合miR-376a-3p可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展[8]，TTN-AS1可通過激活DGCR8促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[9]，但是TTN-AS1在鼻咽癌中的作用目前尚不明確。因此，本文探究TTN-AS1對鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制，以期為鼻咽癌的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鼻咽癌細(xì)胞系TW03、C666-2、CNE2，鼻咽上皮細(xì)胞系NP69，人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T購自中科院上海細(xì)胞庫；PrimeScript RT reagent Kit、Power SYBR Green試劑盒購自日本TAKARA公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自沈陽萬類生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；PDK1抗體、Caspase-3抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、GAPDH抗體購自美國Cell signaling Technlongy公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

TW03、C666-2、CNE2、NP69細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)于10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞復(fù)蘇后置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)80%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將CNE2細(xì)胞分為si-NC組、si-TTN-AS1組、si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組、si-TTN-AS1+PDK1組，使用Lipofectamine 2000試劑盒，si-NC組和si-TTN-AS1組分別轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA Negative Control和TTN-AS1 siRNA，si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組共轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA和miR-139-5p inhibitor，si-TTN-AS1+PDK1組共轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA和PDK1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR

根據(jù)TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，取1 μg的總RNA使用PrimeScript RT reagent Kit將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA使用Power SYBR Green試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：50 ℃尿嘧啶DNA糖基化酶激活2 min；95 ℃熱啟動DNA聚合酶2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，共40次循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后設(shè)置95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s進(jìn)行PCR產(chǎn)物曲線溶解。記錄各孔Ct值，使用2-ΔΔCt法以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算TTN-AS1的表達(dá)量，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-139-5p的表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

使用StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測TTN-AS1與miR-139-5p的結(jié)合位點(diǎn)，TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-139-5p與PDK1的結(jié)合位點(diǎn)。采用Lipofectamine 2000試劑盒將TTN-AS1過表達(dá)質(zhì)粒(TTN-AS1 WT)、突變質(zhì)粒(TTN-AS1 MUT)，PDK1過表達(dá)質(zhì)粒(PDK1 WT)和PDK1突變質(zhì)粒(PDK1 MUT)轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，然后將miR-NC和miR-139-5p mimic轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光酶活性。

1.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況

各組細(xì)胞按照每孔接種2×103/100 μL的密度平行接種于4塊96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在接種0 h、24 h、48 h、72 h時，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，在酶標(biāo)儀 450 nm波長處檢測各孔吸光度值(OD值)。

1.7 Transwell小室檢測細(xì)胞遷移與侵襲能力

各組細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基重懸后，接種至Transwell小室或鋪有Matrigel膠的小室中，稀釋CNE2細(xì)胞至1×105/mL，每個小室中接種100 μL，小室置于24孔板中，每孔加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出小室，底部用無水甲醛固定后用結(jié)晶紫染色10 min，清洗，晾干后于顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

各組細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次，收集1×105個細(xì)胞并用100 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸。每管加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL PI工作液。另準(zhǔn)備兩支新的流式管，每管加入5 μL FITC-Annexin V或PI，用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)，室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL PBS，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA蛋白裂解液試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒定量后，將Loading buffer與蛋白樣品1∶1混合，沸水浴5 min后，取10 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V 30 min，120 V恒壓分離60 min，隨后250 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)過封閉后與PDK1、p-AKT、AKT、Caspase-3、GAPDH一抗4 ℃共孵育過夜，清洗后與山羊抗兔二抗共孵育90 min，清洗后使用ECL試劑盒進(jìn)行曝光并拍照，使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TTN-AS1在鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，鼻咽癌細(xì)胞系TW03、C666-2、CNE2中TTN-AS1表達(dá)顯著高于鼻咽上皮細(xì)胞系NP69(P<0.05)，CNE2細(xì)胞中TTN-AS1表達(dá)最高(圖1a)，因此選擇CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-RNA進(jìn)行后續(xù)研究。相比于si-NC組，si-CCN-AS1組CNE2細(xì)胞中TTN-AS1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖1b。

a：qRT-PCR檢測TTN-AS1在TW03、C666-2、CNE2、NP69細(xì)胞中的表達(dá)；b：qRT-PCR檢測si-NC組和si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞中TTN-AS1的表達(dá) *：與NP69比較，P<0.05；#：與si-NC組比較，P<0.05圖1 qRT-PCR檢測TTN-AS1在各鼻咽癌細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后CNE2細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 TTN-AS1靶向調(diào)控miR-139-5p

StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測TTN-AS1與miR-139-5p的結(jié)合位點(diǎn)如圖2a所示；雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染TTN-AS1 WT和miR-139-5p mimic后其相對熒光強(qiáng)度顯著低于轉(zhuǎn)染TTN-AS1 WT和miR-NC的細(xì)胞(P<0.001)，而共轉(zhuǎn)染TTN-AS1 MUT和miR-139-5p mimic的HEK 293T細(xì)胞與共轉(zhuǎn)染TTN-AS1 MUT和miR-NC的HEK 293T細(xì)胞比較，細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度無顯著變化(P>0.05)，見圖2b；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞中miR-139-5p mRNA表達(dá)顯著高于si-NC組(P<0.001)，見圖2c；說明TTN-AS1可調(diào)控miR-139-5p的表達(dá)。

a：StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測TTN-AS1和miR-139-5p的結(jié)合位點(diǎn)；b：雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證TTN-AS1和miR-139-5p的靶向關(guān)系；c：qRT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-139-5p mRNA表達(dá) *：與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，P<0.001；#：與si-NC組比較，P<0.001圖2 TTN-AS1靶向調(diào)控miR-139-5p

2.3 miR-139-5p靶向調(diào)控PDK1

TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-139-5p與PDK1結(jié)合位點(diǎn)如圖3a所示；雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PDK1 WT和miR-139-5p mimic后其相對熒光強(qiáng)度顯著低于轉(zhuǎn)染PDK1 WT和miR-NC的細(xì)胞(P<0.001)，而CNE2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染PDK1 MUT和miR-139-5p mimic與共轉(zhuǎn)染PDK1 MUT和miR-NC比較，細(xì)胞的相對熒光強(qiáng)度無顯著變化(P>0.05)，見圖3b；Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-139-5p mimic組CNE2細(xì)胞中PDK1蛋白表達(dá)顯著低于miR-NC組(P<0.001)，見圖3c，說明miR-139-5p可調(diào)控PDK1蛋白的表達(dá)。

a:TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-139-5p和PDK1的結(jié)合位點(diǎn)；b:雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-139-5p和PDK1的靶向關(guān)系；c:Western blot檢測細(xì)胞PDK1蛋白表達(dá) *：與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，P<0.001；#：與miR-NC組比較，P<0.001圖3 miR-139-5p靶向調(diào)控PDK1

2.4 TTN-AS1調(diào)控miR-139-5p/PDK1影響鼻咽癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力

CCK-8檢測結(jié)果顯示，相比于si-NC組，si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)，si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+PDK1組CNE2細(xì)胞增殖能力均顯著高于si-TTN-AS1組(P<0.05)，見圖4。細(xì)胞遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示，si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著少于si-NC組(P<0.05)，si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+PDK1組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著多于si-TTN-AS1組(P<0.05),見圖5。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞凋亡水平顯著高于si-NC組(P<0.05)，si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+PDK1組細(xì)胞凋亡水平均顯著低于si-TTN-AS1組(P<0.05)，見圖6。

*：與si-NC組比較，P<0.05；#：與si-TTN-AS1組比較，P<0.05圖4 CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖能力

*：與si-NC組比較，P<0.05；#：與si-TTN-AS1組比較，P<0.05圖5 Transwell小室檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力

*：與si-NC組比較，P<0.05；#：與si-TTN-AS1組比較，P<0.05圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡細(xì)胞

2.5 TTN-AS1調(diào)控miR-139-5p/PDK1/AKT/Caspase-3信號通路

Western blot檢測結(jié)果顯示，相比于si-NC組，si-TTN-AS1組CNE2細(xì)胞中PDK1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，p-AKT水平顯著下調(diào)(P<0.001)；相比于si-TTN-AS1組，si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+PDK1組CNE2細(xì)胞中PDK1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，Caspase-3蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)，p-AKT水平顯著上調(diào)(P<0.001)，說明TTN-AS1調(diào)控miR-139-5p/PDK1/AKT/Caspase-3信號通路(圖7)。

1:si-NC組;2:si-TTN-AS1組;3:si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組;4:si-TTN-AS1+PDK1組 *：與si-NC組比較，P<0.001；#：與si-TTN-AS1組比較，P<0.001圖7 TTN-AS1調(diào)控miR-139-5p/PDK1/AKT/Caspase-3信號通路

3 討論

鼻咽癌是一種常見的耳鼻喉惡性腫瘤，發(fā)病部位多為鼻咽腔頂部和側(cè)壁，目前鼻咽癌的治療方式主要為放療和化療，但是治療效果并不理想，仍存在腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后較差等問題，因此需要探究更多鼻咽癌診斷和治療的新靶點(diǎn)[10-11]。LncRNA是一類長度超過200 nt的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后以及蛋白翻譯等過程中調(diào)控病理生理進(jìn)程[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及血管新生、免疫逃逸、化療耐藥等[13]；亦有研究指出，lncRNA具有腫瘤臨床診斷和治療的潛力[14]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展受多種lncRNA的調(diào)控，如lncRNA PVT1可通過激活KAT2A乙酰轉(zhuǎn)移酶和穩(wěn)定HIF-1α促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖[15]；Liu等[16]研究表明，lncRNA SNHG5通過調(diào)控miR-1179/HMGB3信號通路促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)展；Wang等[17]研究表明，下調(diào)lncRNA SNHG7可抑制ROCK1的表達(dá)，進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；而Hu等[18]的研究表明，lncRNA SNHG7通過調(diào)控miR-514a-5p/ELAVL1軸促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

TTN-AS1是一種促癌基因，位于2號染色體，長度1 077 bp，可通過海綿吸附的方式調(diào)控多種miRNA[19]，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如TTN-AS1可以作用于miR-376a-3p促進(jìn)大腸癌的進(jìn)展[20]；TTN-AS1可通過作為miR-376b-3p的競爭性內(nèi)源RNA促進(jìn)胃癌進(jìn)展[21]；TTN-AS1調(diào)控miR-134-5p/PAK3信號通路影響P21信號通路和AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路，進(jìn)而調(diào)控人大腸癌細(xì)胞的放療敏感性[22]。本研究結(jié)果顯示，TTN-AS1在鼻咽癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于其在鼻咽上皮細(xì)胞系中的表達(dá)，鼻咽癌細(xì)胞CNE2中轉(zhuǎn)染TTN-AS1 siRNA抑制TTN-AS1表達(dá)后，CNE2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低，細(xì)胞凋亡能力顯著增加，說明抑制TTN-AS1表達(dá)可抑制鼻咽癌的進(jìn)展。

LncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的重要機(jī)制是作為內(nèi)源性RNA與miRNA結(jié)合，降低組織及細(xì)胞中靶miRNA豐度，減弱miRNA對mRNA結(jié)合作用及抑制mRNA翻譯，從而提高miRNA靶蛋白表達(dá)水平[23]，如TTN-AS1靶向抑制乳腺癌細(xì)胞中miR-140-5p表達(dá)[24]；TTN-AS1也可抑制miR-1271表達(dá)從而影響前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[25]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TTN-AS1可靶向miR-139-5p，miR-139-5p可靶向結(jié)合于PDK1 mRNA的3’UTR區(qū)，TTN-AS1可調(diào)控miR-139-5p/PDK1信號通路，且si-TTN-AS1+miR-139-5p inhibitor組和si-TTN-AS1+PDK1組細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力均顯著高于si-TTN-AS1組，細(xì)胞凋亡水平顯著低于si-TTN-AS1組，說明TTN-AS1可調(diào)控miR-139-5p/PDK1信號通路從而影響鼻咽癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

AKT信號通路是調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的經(jīng)典信號通路，該通路的激活可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖；PDK1是AKT上游的激活劑，可促進(jìn)AKT的蘇氨酸308位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)而激活A(yù)KT[26]。有研究表明，microRNA-503可通過靶向PDK1/AKT信號通路抑制非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展[27]，提高PDK1表達(dá)可激活PI3K/AKT/mTOR信號傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的抗輻射和去分化表型[28]。本研究結(jié)果顯示，TTN-AS1可通過抑制miR-139-5p促進(jìn)PDK1表達(dá)進(jìn)而激活A(yù)KT信號通路。Caspase-3是腫瘤中的促凋亡基因，AKT/Caspase-3信號通路可調(diào)控多種細(xì)胞凋亡，如抑制PI3K/AKT/Caspase-3信號通路可抑制高糖誘導(dǎo)的人髓核細(xì)胞凋亡[29]。本研究結(jié)果顯示，抑制TTN-AS1后Caspase-3表達(dá)上調(diào)，抑制TTN-AS1并同時抑制miR-139-5p或上調(diào)PDK1表達(dá)均可使Caspase-3表達(dá)下調(diào)，說明TTN-AS1可通過miR-139-5p/PDK1信號通路調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本課題組認(rèn)為抑制TTN-AS1可通過調(diào)控miR-139-5p/PDK1/AKT/Caspase-3信號通路抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。