CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

于海穎，路永強(qiáng)，張 魯，劉國(guó)世*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107）

基因編輯（gene editing or genome editing）是指通過(guò)生物技術(shù)手段對(duì)生物體的特定基因進(jìn)行精確改造，包括對(duì)目的基因進(jìn)行刪除、替換、插入單個(gè)核苷酸或某段DNA序列，以達(dá)到改變生物遺傳信息和性狀的目的。自2015年開(kāi)始，基因編輯領(lǐng)域迎來(lái)高速發(fā)展時(shí)期，廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥領(lǐng)域、環(huán)境保護(hù)等方面。目前，基因編輯系統(tǒng)主要有三類(lèi)，其中包括鋅指核酸酶（Zin-finger nuclease，ZFN）、類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/Cas9。這些基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使動(dòng)物基因定點(diǎn)修飾技術(shù)取得突破性進(jìn)展。

CRISPR由一個(gè)可以“剪開(kāi)”特定DNA序列的蛋白質(zhì)和一個(gè)可以定位基因的“GPS向?qū)А苯M成，通過(guò)單鏈向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）與靶標(biāo)互補(bǔ)配對(duì)，招募Cas9蛋白對(duì)基因組進(jìn)行切割［1-2］。CRISPR系統(tǒng)最初來(lái)自釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），即A群鏈球菌（group A Streptococcus，GAS）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），本是原核生物用來(lái)標(biāo)記和抵御病毒入侵的一種免疫防御機(jī)制。作為第三代人工核酸內(nèi)切酶基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因高效、便捷、適應(yīng)范圍廣泛，具備完全取代ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)的潛力［3］。自2013年首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物以來(lái)，基因編輯動(dòng)植物在生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)育種、醫(yī)學(xué)研究、人源化器官生產(chǎn)和臨床疾病治療等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價(jià)值［4-6］。

豬作為一種重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)制、基因水平、蛋白質(zhì)功能乃至機(jī)體大小方面均與人類(lèi)十分相似，是研究人類(lèi)生命活動(dòng)基本規(guī)律、重大疾病及新藥研發(fā)的理想模式動(dòng)物之一［7-8］。同時(shí)，隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)豬肉的瘦肉率、肌內(nèi)脂肪、酸堿度和肉色等品質(zhì)性狀的要求逐步提高。為滿(mǎn)足市場(chǎng)和人們的需求，基因編輯成為潛在的突破性技術(shù)。文章對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在豬遺傳育種、人類(lèi)疾病模型建立和異種器官移植等方面進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展和生物醫(yī)藥研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9技術(shù)在豬育種中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的豬育種手段，如純系選育和配套雜交，需要耗費(fèi)大量的人力和物力，培育理想經(jīng)濟(jì)性狀所需周期長(zhǎng)并存在優(yōu)良性狀難以聚合、改良目標(biāo)性狀不確定性較大等問(wèn)題，極大地限制了豬遺產(chǎn)改良的進(jìn)展。基因編輯技術(shù)能夠?qū)ωi進(jìn)行快速定向的遺傳改良，短時(shí)間內(nèi)就能獲得自然狀態(tài)下經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期選育才能獲得的表型，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)育種的不足。2015年，Ruan J.等［9］利用包括CRISPR/Cas9在內(nèi)的多種基因編輯技術(shù)在豬基因組的H11位點(diǎn)插入9.4 kb長(zhǎng)的外源DNA片段，證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯效率最高，為后續(xù)制備高效安全的轉(zhuǎn)基因豬奠定了基礎(chǔ)。目前，科學(xué)家們將CRISPR/Cas9技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer，SCNT）相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了特定性狀的精準(zhǔn)改變，已完全顛覆現(xiàn)有的豬遺傳改良路徑和品種選育效率，為豬育種提供了全新的思路。

1.1 提高肉品質(zhì)

我國(guó)肉豬地方品種多，普遍具有繁殖力強(qiáng)、肉質(zhì)好、抗病和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是飼料利用率和瘦肉率較低，飼養(yǎng)周期長(zhǎng)，飼料報(bào)酬低。我國(guó)每年都需要從國(guó)外進(jìn)口大量?jī)?yōu)良品種種豬和精液。國(guó)外豬種的特點(diǎn)是體格大、屠宰率和瘦肉率高，因此，很多農(nóng)戶(hù)選擇飼養(yǎng)外國(guó)豬種，而我國(guó)地方豬種的群體數(shù)量近年來(lái)呈顯著下降趨勢(shì)。近年來(lái)，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)豬的多種生產(chǎn)性能進(jìn)行分子水平的改良，培育出眾多具有優(yōu)良性狀的品種。

肌肉生長(zhǎng)抑制素（myostatin，MSTN）基因是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠抑制骨骼肌細(xì)胞增殖與分化的基因，該基因突變會(huì)導(dǎo)致豬肌肉異常增長(zhǎng)或產(chǎn)生雙肌臀表型［10］。2015 年，Wang K.K.等［11］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)MSTN基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得肌纖維數(shù)目和肌肉生長(zhǎng)速率顯著增加的基因編輯豬，最終表現(xiàn)出特定的雙肌臀表型。在動(dòng)物上MSTN基因編輯導(dǎo)致的基因失活等同于自然變異，這有利于轉(zhuǎn)基因食用動(dòng)物商業(yè)化獲得公眾和監(jiān)管機(jī)構(gòu)的更多支持。解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）是一種在棕色脂肪組織中特異表達(dá)的線(xiàn)粒體內(nèi)膜蛋白，能夠參與棕色脂肪的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)和能量代謝，以維持機(jī)體的能量代謝平衡。在進(jìn)化過(guò)程中現(xiàn)代家豬的祖先在2 000年前丟失該基因，Zheng Q.T.等［12］利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)UCP1基因在豬白色脂肪組織中的特異表達(dá)，顯著降低了基因編輯豬的脂肪率和背膘厚度，并顯著提高了瘦肉率，這不僅有利于新生仔豬抵御寒冷環(huán)境，更有助于挽救寒冷地區(qū)畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失。豬胰島素樣生長(zhǎng)因子2（insulin-like growth factor 2，IGF2）是胰島素類(lèi)激素家族的重要成員之一，廣泛參與機(jī)體眾多生理代謝過(guò)程，在肌肉發(fā)育和脂肪沉積等方面發(fā)揮重要作用，另外也參與動(dòng)物細(xì)胞的增殖、分化等活動(dòng)［13］。2018年，Xiang G.H.等［14］利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)IGF2內(nèi)含子3中一個(gè)保守的SNP位點(diǎn)進(jìn)行編輯，得到在體重、胴體率和瘦肉率等方面都顯著高于野生型的新品種，首次證明通過(guò)編輯基因組非編碼區(qū)能夠顯著提高牲畜的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性狀，這為精確育種提供了全新的思路和策略。

中國(guó)生豬出欄量、消費(fèi)量均位于世界各國(guó)之首，肉豬養(yǎng)殖在中國(guó)畜牧業(yè)中具有重要地位。因此，建立新的技術(shù)策略促進(jìn)我國(guó)本土優(yōu)良豬種的選育，一直是肉豬養(yǎng)殖領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。CRISPR/Cas9技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造了具備優(yōu)越生產(chǎn)性能的豬群體，在保留我國(guó)特有肉豬種系優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其生長(zhǎng)率和瘦肉率，不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)于保護(hù)我國(guó)地方品系資源也具有重要意義。

1.2 提高抗病性

作為一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，我國(guó)不僅養(yǎng)殖方式多樣，疫病流行情況也相對(duì)復(fù)雜，豬病流行給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，人畜共患病和食品安全更嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康?？蒲腥藛T逐漸意識(shí)到單純依靠藥物和疫苗無(wú)法徹底控制豬病，因此，從遺傳角度利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)研究培育新的抗病品種成為解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproduction and respiratory syndrome，PRRS）俗稱(chēng)“藍(lán)耳病”，會(huì)導(dǎo)致母豬出現(xiàn)繁殖障礙及仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道疾病。在中國(guó)廣泛傳播的豬高熱病是由藍(lán)耳病病毒（Porcine reproduction and respiratory syndrome virus，PRRSV）的高致病性毒株引起的，死亡率在2%～100%之間。清道夫受體CD163蛋白是PRRSV入侵宿主時(shí)的重要識(shí)別蛋白，能夠促進(jìn)病毒脫殼并將病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用［15-16］。2013年，Prather團(tuán)隊(duì)首次利用基因編輯技術(shù)治療豬傳染性疾病，發(fā)現(xiàn)CD163的第7外顯子雙等位基因敲除豬具有很好的抗病能力，為后續(xù)研究奠定了重要基礎(chǔ)［17-19］。2014年，K.M.Whitworth等［19］通過(guò)顯微注射Cas9 mRNA和sgRNA獲得能夠抵抗藍(lán)耳病病毒的CD163雙等位基因敲除豬，取得豬育種領(lǐng)域的重大突破。隨后的多項(xiàng)研究表明，CD163基因外顯子7上富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域5（scavenger receptor cysteine-rich domain 5，SRCR5）是PRRSV感染所必需的。2018 年，C.Burkard 等［20］利 用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除豬CD163蛋白的SRCR5結(jié)構(gòu)域，成功制備了能抵抗PRRSV-1的抗病豬。Guo C.H.等［21］進(jìn)一步特異性刪除SRCR5結(jié)構(gòu)域中的部分序列，培育出可抵抗PRRSV-2的長(zhǎng)白豬和兩廣小花豬抗病豬模型。隨后，科研人員發(fā)現(xiàn)只需對(duì)SRCR5結(jié)構(gòu)域進(jìn)行單個(gè)堿基編輯，即可獲得抵抗藍(lán)耳病的豬模型［22］。更重要的是，通過(guò)此種方法生產(chǎn)的基因編輯豬不導(dǎo)入外源基因且不影響CD163的生物學(xué)功能，因此不存在轉(zhuǎn)基因生物安全問(wèn)題。除了藍(lán)耳病以外，科研人員可以利用相同手段對(duì)偽狂犬、口蹄疫、圓環(huán)病毒病、流行性腹瀉和非洲豬瘟等豬病進(jìn)行了抗病育種研究，這對(duì)于提高豬抗病性具有重要推動(dòng)作用。

CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用為探究病毒致病機(jī)制、新型疫苗研發(fā)及抗病毒藥物研發(fā)等領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的工具。在對(duì)疾病發(fā)生機(jī)制研究的基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行有針對(duì)性的高效基因編輯，是實(shí)現(xiàn)豬抗病育種突破的關(guān)鍵技術(shù)手段，對(duì)推動(dòng)畜牧業(yè)健康發(fā)展具有重要作用。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)還只是局限在宿主與病毒的相互作用方面，過(guò)度依賴(lài)于復(fù)雜競(jìng)爭(zhēng)的細(xì)胞過(guò)程，在一定程度上限制了基因編輯的效率和精準(zhǔn)度。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)在建立人類(lèi)疾病豬模型上的應(yīng)用

目前用于人類(lèi)疾病研究的基因編輯動(dòng)物模型主要是以小鼠、大鼠為代表的嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型和以豬為代表的大動(dòng)物模型。與嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型相比，豬的組織和器官在生理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)和遺傳學(xué)等方面與人類(lèi)具有更高的相似性，是人類(lèi)疾病研究領(lǐng)域的理想模型之一。同時(shí)，由于胚胎干細(xì)胞技術(shù)較難、繁殖周期長(zhǎng)及基因編輯效率低等，大型哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建一直都是技術(shù)攻關(guān)的難點(diǎn)。目前，利用CRISPR/Cas9技術(shù)已獲得多種人類(lèi)疾病的豬模型。

2.1 心血管疾病模型

心血管疾病是全球的頭號(hào)死因，由于心血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率等特征，目前已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。血管性血友?。╲on willebrand disease，vWD）是一種常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病，由常染色體遺傳的血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）的數(shù)量或結(jié)構(gòu)異常所造成的，以出血傾向、出血時(shí)間延長(zhǎng)、血小板黏附功能下降等為主要臨床特點(diǎn)［23］。2014年，Hai T.等［24］獲得vWF雙等位基因敲除的小型巴馬豬，該突變體的凝血時(shí)間顯著高于野生型，表現(xiàn)出嚴(yán)重的凝血功能障礙，這是首次利用CRISPR技術(shù)制備出具有特定疾病表型的哺乳動(dòng)物疾病模型。尼曼-匹克C1型類(lèi)似蛋白1（niemann-pick type C1 like l，NPC1L1）是一種跨膜蛋白，在外源性膽固醇吸收和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［25］。2015年，Wang Y.等［26］利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備N(xiāo)PC1L1敲除豬，為深入研究NPC1L1基因在人類(lèi)膽固醇吸收中的功能提供了新信息。低密度脂蛋白受體（lowdensity lipoprotein receptor，LDLR）是家族性高膽固醇血癥的主要致病因子，該蛋白位于肝細(xì)胞表面，在肝臟低密度脂蛋白膽固醇清除中起關(guān)鍵作用［27］。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）在膽固醇和脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中發(fā)揮重要作用，是極低密度脂蛋白和乳糜微粒的重要組成部分［28］。Huang L.等［29］利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了LDLR和ApoE雙基因敲除豬，該種豬血液中低密度脂蛋白、膽固醇、總膽固醇和載脂蛋白B的水平顯著升高，成為研究代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化疾病的大動(dòng)物模型。膽固醇的吸收和代謝異常會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化與早發(fā)冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，這些疾病模型的建立為探究人類(lèi)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了基礎(chǔ)，具有巨大的市場(chǎng)潛力和商業(yè)化前景。

2.2 代謝異常疾病模型

肥胖是由于機(jī)體長(zhǎng)期能量攝入超過(guò)消耗而引起能量平衡紊亂，導(dǎo)致機(jī)體生理功能出現(xiàn)異常的一種病理狀態(tài)。肥胖會(huì)對(duì)機(jī)體多個(gè)器官產(chǎn)生影響，引起代謝紊亂，誘發(fā)2型糖尿病、心血管疾病等慢性病。目前，肥胖和代謝綜合征的人數(shù)在全世界范圍內(nèi)迅速增長(zhǎng)，導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率。黑皮質(zhì)素3受體（melanocortin 3 receptor，MC3R）是位于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的視紫紅質(zhì)樣G蛋白偶聯(lián)受體，在能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用［30］。2019年，Yin Y.J.等［31］利用CRISPR/Cas9技術(shù)并結(jié)合SCNT技術(shù)制備了MC3R敲除豬，該豬的體重和體脂率均顯著高于野生型，成為研究人類(lèi)肥胖疾病的良好非嚙齒類(lèi)動(dòng)物醫(yī)學(xué)模型。糖尿病作為一種代謝紊亂引起的慢性疾病，目前醫(yī)學(xué)界對(duì)糖尿病的治療廣泛使用豬源胰島素。但由于豬和人的胰島素蛋白存在一個(gè)氨基酸的差異，使用豬源胰島素效率較低且長(zhǎng)期使用易誘發(fā)抗體的產(chǎn)生［32-33］。2016年，Yang Y.等［34］利用基因編輯技術(shù)對(duì)豬胰島素基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，成功建立了完全分泌人胰島素的基因修飾豬，為糖尿病治療和臨床異種胰島移植治療提供了研究基礎(chǔ)。目前在研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種與糖尿病等代謝疾病相關(guān)的基因，基于CRISPR的基因編輯系統(tǒng)對(duì)這些機(jī)體代謝相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù)，將有利于在遺傳水平上幫助人類(lèi)改善肥胖癥及相關(guān)代謝性疾病。

2.3 神經(jīng)退行性疾病模型

亨廷頓舞蹈病、阿爾茲海默癥、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等均因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的錯(cuò)誤折疊而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，是當(dāng)今社會(huì)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)退行性疾?。?5］。伴隨人年齡的逐漸增長(zhǎng)，這些疾病逐漸產(chǎn)生，可遺傳，呈漸進(jìn)性發(fā)展，但由于缺乏合適的動(dòng)物模型進(jìn)行藥物篩選，目前尚無(wú)有效治療方法。2015年，Zhou X.Q.等［36］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對(duì)豬基因組中PARK2和PINK1基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)Cas9打靶質(zhì)粒，成功建立了帕金森綜合征醫(yī)用豬模型，首次實(shí)現(xiàn)了大動(dòng)物的雙基因等位敲除。亨廷頓舞蹈病是由單基因（Hunting，HTT）突變導(dǎo)致的神經(jīng)退行疾病，是研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起選擇性的神經(jīng)退行性病變和多基因突變病癥的基礎(chǔ)［37］。2018年，Yan S.等［38］首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)精準(zhǔn)將人的突變亨廷頓舞蹈病基因精確地插入豬HTT內(nèi)源性基因中，在國(guó)際上首次建立了與神經(jīng)退行性人突變基因相似的大動(dòng)物模型。亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域中的一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，為我國(guó)腦科學(xué)與類(lèi)腦研究提供了最新手段，標(biāo)志著我國(guó)大動(dòng)物模型研究走在了世界前列。更值得關(guān)注的是，這些疾病模型的病理特征及異常行為均可穩(wěn)定遺傳給后代，這為開(kāi)發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病新手段提供了穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型，更能夠?yàn)橹苽淦渌窠?jīng)退行性疾病大動(dòng)物模型提供技術(shù)范本和理論基礎(chǔ)。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在生產(chǎn)異種器官上的應(yīng)用

自20世紀(jì)80年代免疫抑制藥物應(yīng)用以來(lái)，臨床器官移植成為晚期器官功能衰竭的首選治療手段。目前在全世界范圍內(nèi)器官來(lái)源嚴(yán)重短缺的問(wèn)題尚未解決，異種器官移植和異種細(xì)胞移植是解決人供體器官短缺的重要途徑。豬的生理和解剖結(jié)構(gòu)與人類(lèi)高度類(lèi)似，被認(rèn)為是人體異種器官來(lái)源及異種細(xì)胞再生的首選動(dòng)物。

目前，豬器官植入人體存在的一個(gè)最大障礙是超急性排斥反應(yīng)。非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞表面存在一種稱(chēng)為α-1，3半乳糖（α-1，3 galactosidase，αgal）的抗原，在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過(guò)程中α-gal在靈長(zhǎng)類(lèi)中已經(jīng)消失，但卻存在針對(duì)該抗原決定簇的天然抗體。因此，只有培育出完全不含α-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）基因的轉(zhuǎn)基因豬，才能徹底消除這種免疫排斥反應(yīng)。2014年，M.Sato等［39］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了豬的GGTA1基因，消除了豬和人的異種器官移植排斥問(wèn)題，為人類(lèi)器官移植探究提供了良好模型。此外，豬自身攜帶有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Porcine endogenous retrovirus，PERVs），該病毒對(duì)豬不具備毒性，但在體外不僅能感染人細(xì)胞，還可在人細(xì)胞之間傳播，一旦侵入人體可能會(huì)引起免疫缺陷、腫瘤發(fā)生等健康隱患。因此，作為器官移植的供體必須清除豬體內(nèi)的所有PERVs。2015年，Yang L.H.等［40］利用CRISPR/Cas9技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)從PK15豬腎細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中敲除PERV的所有拷貝，成為迄今為止最廣泛的CRISPR編輯壯舉。2017年，Niu D.等［41］成功在豬原代細(xì)胞系中滅活了所有的PERVs，并通過(guò)體細(xì)胞核移植獲得世界首批PERVs滅活豬模型，第一次從根本上解決了異種器官病毒傳染的風(fēng)險(xiǎn)，是異種器官移植科學(xué)研究進(jìn)程的標(biāo)志性里程碑。盡管敲除GGTA1基因后能夠逃避超級(jí)性免疫排斥反應(yīng)，但是引起超急性免疫排斥反應(yīng)的靶點(diǎn)卻不只有GGTA1基因，還有胞苷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因、β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶（β-1，4-N acetylgalactosaminyl transferase 2，β4GalNT2）基因和去唾液酸糖蛋白受體1（asialoglycoprotein receptor 1，ASGR1）基因等。因此，2020年，F(xiàn)u R.等［42］成功敲除豬體內(nèi)的GGTA1、β-微球蛋白（β-microglobulin，β2M）和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(lèi)興奮劑（major histocompatibility complex classⅡtransactivator，CIITA）基因，有效緩解了異種免疫反應(yīng)并延長(zhǎng)了異種發(fā)生過(guò)程中豬的存活時(shí)間。2021年，Yue Y.N.等［43］進(jìn)一步在PERVs敲除豬體內(nèi)移除3個(gè)激活免疫反應(yīng)的基因，插入6個(gè)移植人體免疫反應(yīng)的基因和3個(gè)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的基因，大大減輕了人體免疫排斥反應(yīng)。

近日，世界首例基因編輯豬腎臟成功植入人體，成為豬異種器官移植探索的重要里程碑。移植后該器官不僅能正常發(fā)揮功能，且短時(shí)間內(nèi)未發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。更重要的是，全球首次豬心臟移植人體手術(shù)也順利開(kāi)展，首次證明基因編輯動(dòng)物心臟可以在人體內(nèi)正常工作。這標(biāo)志著科學(xué)家們向利用動(dòng)物器官拯救人類(lèi)生命邁出重要一步。

隨著基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，各種異種器官移植難題逐漸被克服，利用基因編輯技術(shù)改造豬器官并結(jié)合克隆動(dòng)物技術(shù)，培育能為人類(lèi)提供器官的基因修飾豬，將為更多器官功能衰竭晚期病人帶來(lái)新生。

4 問(wèn)題與展望

近年來(lái)，CRISPR基因編輯技術(shù)的多樣性、模塊性和高效性正在掀起一場(chǎng)生物技術(shù)革命。從純粹的技術(shù)角度來(lái)看，CRISPR/Cas9技術(shù)的基因編輯效率和準(zhǔn)確性都較高，但也存在嚴(yán)重的脫靶問(wèn)題。由于基因組的復(fù)雜性極高，sgRNA可能會(huì)與非靶向序列局部配對(duì)，激活Cas9內(nèi)切酶活性發(fā)生非特異性切割，從而干擾細(xì)胞的正常功能，甚至誘發(fā)諸如癌癥等多種疾病。目前，主要通過(guò)改造Cas9蛋白和優(yōu)化sgRNA兩方面降低脫靶效率。此外，有研究人員還指出，CRISPR技術(shù)會(huì)造成編輯位點(diǎn)附近出現(xiàn)大量DNA缺失和重排，從而增加基于CRISPR治療的復(fù)雜性［44］。

2018年11月份，我國(guó)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)秘密將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于人類(lèi)胚胎的修飾，在國(guó)際上引起軒然大波［45］。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠通過(guò)編輯成年動(dòng)物的胚胎或生殖細(xì)胞來(lái)修飾基因，控制和改變生物的遺傳特征并傳遞給后代。目前，將Cas9和sgRNA導(dǎo)入受精卵多采用電轉(zhuǎn)化或顯微注射的方式，但在受精卵分裂過(guò)程中Cas9蛋白對(duì)不同卵裂球的編輯能力和修復(fù)方式可能不同，出現(xiàn)帶有不同編輯類(lèi)型細(xì)胞的嵌合體［46-48］。因此，如何正確利用CRISPR/Cas9技術(shù)提升人類(lèi)的健康和福祉，是值得人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

盡管目前還有許多技術(shù)難題有待解決，但CRISPR/Cas9技術(shù)仍在不斷發(fā)展，基因編輯豬在農(nóng)業(yè)育種、醫(yī)學(xué)研究、人源化器官生產(chǎn)和臨床疾病治療等多個(gè)領(lǐng)域均取得突破性進(jìn)展。這不僅為豬育種提供了全新的思路，也為生物醫(yī)學(xué)研究提供了重要參考。采用基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因治療必將成為21世紀(jì)人類(lèi)攻克疑難病癥的一種常規(guī)治療手段，它必將為維護(hù)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。