鞣花酸提取、純化及其生物活性研究進展

王佳鸞，趙俸藝，張春紅，吳文龍

（江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京 210014）

植物界儲藏著大量具有豐富生物活性的天然化合物，值得深入挖掘利用。隨著社會的發(fā)展，人們越來越注重自身的健康問題，“食補”也成為了人們愈加關(guān)注的話題。國內(nèi)外大量學者的研究表明，經(jīng)常食用富含酚酸類化合物的食品，例如富含鞣花酸的藍莓、葡萄、核桃等，可以降低某些慢性疾病的發(fā)病率。

鞣花酸（Ellagic acid,EA）又名并沒食子酸、胡頹子酸，是沒食子酸的二聚衍生物[1]，其分子式為C14H16O18(見圖1)。鞣花酸是一種多酚二內(nèi)酯，具有高度熱穩(wěn)定性。其4 個環(huán)代表它的親脂結(jié)構(gòu)，親水部分有4 個酚基和2 個內(nèi)酯環(huán)，這些結(jié)構(gòu)特性導致鞣花酸的親水性及親脂性均較差[2]。它是一種天然的植物多酚類物質(zhì)[3]，通常以黃色針狀晶體形式存在，相對分子量為302.28，熔點（吡啶）大于360 ℃，微溶于水、醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚[4]。鞣花酸的水溶液不穩(wěn)定，溶解度隨著溫度的上升相對增大，不同溫度處理的鞣花酸水溶液穩(wěn)定性均有一定程度地下降。溶液pH 對鞣花酸的穩(wěn)定有較大影響，鞣花酸在堿性條件下穩(wěn)定性較差，這可能是因為鞣花酸含有酯基和酚羥基，容易與堿發(fā)生反應，同時其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)也容易在堿的作用下發(fā)生分解[5]。鞣花酸對紫外線具有吸收作用，其水溶液經(jīng)紫外線照射后會發(fā)生自身的氧化聚合[6]，因此，在紫外線照射下其穩(wěn)定性會有一定程度地下降。鞣花酸在乙醇溶液中的最大吸收波長為255 和366 nm，遇三氯化鐵呈藍色，遇硫酸呈黃色[7]。Greiss—meger 反應呈陽性，還易與金屬陽離子如Ca2+、Mg2+結(jié)合。

圖1 鞣花酸分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular formula of ellagic acid

鞣花酸廣泛存在于各種水果與堅果中，如石榴[8]、葡萄[9]、草莓[10]、核桃[11]等，天然鞣花酸多以縮合形式（如鞣花單寧、苷等）存在于自然界中，鞣花酸通常與葡萄糖、西洛糖、阿拉伯糖等縮合成糖苷，但更容易參與鞣花單寧的形成，植物往往通過水解鞣花單寧來產(chǎn)生鞣花酸[12]。此外，鞣花酸還以游離的形式存在于多種植物的果實中。研究表明鞣花酸具有很強的清除自由基和抗氧化的能力，鞣花酸對于氧自由基和羥自由基都具有清除作用[13]。鞣花酸對于化學物質(zhì)誘導的癌變以及其他多種癌變表現(xiàn)出明顯的抑制作用，特別是對結(jié)腸癌[14]、肝癌[15]、肺癌[16]、乳腺癌[17]以及皮膚癌[18]等均有很好的抑制作用。鞣花單寧與鞣花酸的性質(zhì)相近，也具有抗氧化、抗炎、抗癌以及調(diào)節(jié)腸道菌群等多種生物活性，對癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)性病變等慢性疾病具有潛在的抑制作用[19]。

本文對植物體內(nèi)鞣花酸的提取方法、提取率，純化方法等進行了歸納總結(jié)，對鞣花酸在抗癌、抗氧化、抗炎、抗糖尿病等多方面的生物活性進行了系統(tǒng)歸納。隨著對鞣花酸研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)鞣花酸對維持人體健康具有巨大的潛力，且其作用范圍大，在生產(chǎn)生活中也具有一定的應用前景。

1 鞣花酸提取制備研究進展

鞣花酸因其特殊的理化性質(zhì)導致其在很多溶劑中的溶解度并不高，在目前的研究中，鞣花酸的提取方法主要可分為堿溶酸沉、直接提取法、溶劑提取法和化學合成法等。

1.1 堿溶酸沉法

鞣花酸是一種天然多酚類內(nèi)酯化合物，含有酯基和酚羥基，容易與堿發(fā)生反應，同時其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)也容易在堿的作用下發(fā)生分解，所以鞣花酸在堿性條件下與堿反應，在酸性條件下沉淀產(chǎn)生結(jié)晶。Khac 等[20]在文獻中利用堿溶酸沉的方法提取鞣花酸：植物組織勻漿后用浸提液浸泡，減壓抽濾過濾殘渣將浸提液用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至10～13，后用稀鹽酸將溶液調(diào)pH 至2～4，離心分離沉淀，水洗去雜即可得到鞣花酸粗品。

1.2 超聲輔助酸水解法

超聲波技術(shù)對植物細胞壁有破壞作用，其作用是使細胞內(nèi)的溫度不斷升高，外界滲透壓逐漸增大，植物細胞壁破碎，提取的產(chǎn)物從細胞中被釋放出來。超聲波輔助提取技術(shù)具有提取作用時間短、效率高、成本低的特點，同時還可以降低對熱敏感物質(zhì)在提取過程中被破壞的程度，能夠提高目標物質(zhì)的產(chǎn)量和質(zhì)量。邸幼軍等[21]利用超聲輔助提高鞣花酸的提取率，發(fā)現(xiàn)將100 g 的樣品充分分散于100 mL1.5 mol/L稀鹽酸溶液中，在60 ℃條件下超聲萃取30 min 并重復提取2 次，粗提液減壓過濾，合并濾液，減壓濃縮干燥，即可得到鞣花酸粗品，其提取率最高可達4.3%。

1.3 溶劑提取法

溶劑提取法是鞣花酸提取方法中使用最為廣泛的一種，但因鞣花酸的理化性質(zhì)較為特殊，單純的溶劑提取率并不理想，所以采用其他提取方法輔助溶劑提取，以達到提升提取效率的效果。

1.3.1 回流提取法 丙酮的極性與鞣花酸較為相似，且相對于其他溶劑最不易與其水解鞣質(zhì)發(fā)生反應。李小萍[22]利用丙酮作為提取溶劑測得最佳提取方法為：樹莓果勻漿后用80%丙酮溶液（內(nèi)含1.2 mol/L的鹽酸以及0.2 g 的維生素）料液比為1∶12，在80 ℃的條件下回流提取90 min，抽濾去除果渣，減壓旋蒸去除丙酮，?20 ℃預冷，真空冷凍干燥獲得粗提物粉末，在此條件下鞣花酸得率為323 μg/g。

1.3.2 超聲波輔助溶劑提取法 鞣花酸在抗氧化、抗癌及抗炎等方面均有較好的生理活性，但用其制備藥物或保健品時，提取溶劑的選擇往往備受關(guān)注。乙醇是一種毒性較低且被普遍接受的有機試劑，以乙醇為提取溶劑生物安全性更高，也更容易被消費者接受。王佳慧等[23]將無水乙醇作為鞣花酸的提取溶劑，對樹莓進行超聲波輔助提取。利用響應面分析法對提取步驟進行優(yōu)化，最終確定提取最佳工藝為：料液比1∶14 g/mL，超聲提取20 min，提取溫度為80 ℃，在此條件下鞣花酸為670.28 μg/g。

1.3.3 酸水解輔助溶劑提取法 園藝果實石榴其果皮不可食用，有研究證明石榴皮中富含多種有效活性物質(zhì)，因此石榴皮的廢棄造成了巨大的浪費。石榴皮具有價低量大的特點，所以加強石榴皮的利用率對部分生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)提取具有一定利用價值。Lu 等[24]用60%乙醇作為提取溶劑來浸泡待提取樣品，加熱攪拌，減壓旋蒸去除乙醇得粗提液，加去離子水混合粗提液至150 mL 后加5%的H2SO4，油浴水解5 h 或過夜，在50 ℃的烘箱中間隔攪拌收集沉淀，深棕色沉淀即為鞣花酸粗品，在此條件下100 g石榴皮中可以提取純度90%鞣花酸3.5 g。

1.4 發(fā)酵制備法

在生活中，果渣因無法食用而被廢棄，但其中富含許多未被利用的有益活性成分，果渣中有益成分的利用不僅減少了不必要的浪費，還可以增大其利用率。例如Vattem 等[25]利用蔓越莓果渣配制成食用真菌固態(tài)生長培養(yǎng)基，真菌發(fā)酵處理蔓越莓果渣生成多酚類物質(zhì)，使得可萃取鞣花酸的含量增加，反應后用HPLC 測定鞣花酸的含量約為350 μg/g。

1.5 鞣花酸的化學制備法

鞣花酸在植物界分布較為廣泛，但其含量較低，在工業(yè)生產(chǎn)中以植物的營養(yǎng)部分作為樣本提取成本較高，不利于生產(chǎn)。利用單寧以及沒食子酸進行化學制備，更容易得到大量的鞣花酸單體。鞣花酸的化學制備方法可分為單寧降解法和沒食子酸氧化聚合法。單寧降解法即五倍子單寧氧化法，五倍子單寧酸在堿性條件下氧化生成鞣花酸。在徐涓等[26]的研究中，利用射流泵作為帶氣和充氣裝置，用NaOH 將溶于水的單寧酸pH 調(diào)至8.5，20 ℃反應8 h，單寧酸的最佳濃度為25 g/L。沒食子酸氧化聚合：鞣花酸是沒食子酸的二聚體，所以在過氧化物酶的催化下對沒食子酸進行氧化聚合也可以得到鞣花酸[7]。

2 鞣花酸純化研究進展

鞣花酸的純化方法主要有溶劑重結(jié)晶法、大孔樹脂吸附法、高速逆流色譜（HSCCC）、高效液相色譜法（HPLC）等。

2.1 溶劑重結(jié)晶法

溶劑重結(jié)晶法是利用飽和溶液重結(jié)晶的方法，得到較純凈的物質(zhì)的一種純化方法，因其操作簡單，得到結(jié)晶較為純凈而被廣泛利用。徐涓等[26]通過對不同提純方法進行比較后，確定以溶劑洗滌法為最佳方法，且可通過調(diào)節(jié)料液比制備不同純度的鞣花酸，當鞣花酸與甲醇料液比為1:100 g/mL，65 ℃下攪拌1 h，洗滌1 次可獲取純度約為95%的鞣花酸；固定其余條件，將料液比調(diào)為1:200 g/mL 時即可獲得純度為98%的鞣花酸。

2.2 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂的吸附力是依賴大孔樹脂與被吸附物質(zhì)之間的范德華力來進行的物理吸附，從而達到分離的效果。王佳寧[27]將不同樹脂對鞣花酸的吸附能力進行了對比，最終選取大孔樹脂HPD-600 對鞣花酸粗提液進行第一次分離純化。實驗中先將大孔樹脂HPD-600 進行活化[28]后備用，將提取的鞣花酸粗提液上柱動態(tài)吸附6 h 后用蒸餾水沖洗除雜至無色，再用60%的乙醇洗脫，收集洗脫液后減壓旋蒸除去乙醇，定容測定鞣花酸的濃度為61.07%，利用CG-161樹脂二次純化后鞣花酸濃度可達80.18%。

2.3 高速逆流色譜法

高數(shù)逆流色譜法是一種連續(xù)的高效的液—液色譜分離技術(shù)，其固定相和流動相都是液體，沒有不可逆吸附，因其具有回收率高、純度高、制備量高的優(yōu)點而被逐漸應用到天然化合物的分離實驗中。吳夢琪等[29]以玫瑰花渣為原料，75%乙醇為溶劑，料液比為1:10 g/mL 加熱回流提取2 h，重復提取兩次，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加水洗滌后再次烘干，得粗粉末。再通過大孔樹脂HP 200 進行第一次純化后，選取正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:7:3.5:7，v/v）溶劑體系進行分離，在紫外254 nm 處進行檢測。

2.4 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前常用的分離技術(shù)，因其能在短時間內(nèi)快速高效分離檢測樣品而被廣泛應用。楊光等[30]利用高效液相色譜法對樹莓不同部位的鞣花酸進行了含量測定。在600 mL 的超純水中加入6 mL 的乙酸混勻后，再加入400 mL 的甲醇混勻，以此混合液作為流動相。最終確定色譜條件為流速為1000 mL/min 柱溫30 ℃，檢測波長為254 nm，進樣量為10 μL，并通過精密度、穩(wěn)定性、重復性來驗證該色譜條件的可行性。用鞣花酸標準品配置標準溶液，以鞣花酸濃度為縱坐標，鞣花酸峰面積為橫坐標，建立標準曲線，用來計算樣品中的鞣花酸濃度。

3 鞣花酸的生物活性

3.1 抗炎

3.1.1 抗神經(jīng)炎癥 小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)固有的免疫細胞。通常，小膠質(zhì)細胞存在于一個穩(wěn)定的休眠狀態(tài)，但同時還可以免疫監(jiān)控危險信號。然而，小膠質(zhì)細胞接收到神經(jīng)元分泌的或外來病原體侵入所分泌的信號中時被刺激激活[31?32]。神經(jīng)退行性疾病中觀察到經(jīng)典的促炎激活信號通常與神經(jīng)炎癥有關(guān)，其特征是引起許多細胞表面受體和細胞因子上調(diào)的典型炎癥信號級聯(lián)急劇變化[33]。Gon?alo 等[34]的報道指出，樹莓提取物的GIB（經(jīng)過體外模擬腸胃消化后的產(chǎn)物）組分有一定的抗炎效果，并且在細胞實驗中也驗證了GIB 組分在生理濃度下無毒性。他們得出了以下結(jié)論：a.經(jīng)過樹莓提取物的GIB 組分預處理顯著促進了脂多糖（LPS）刺激的N9 小膠質(zhì)細胞中的IL-10 的釋放；b.在ATP 刺激的小膠質(zhì)細胞下清楚顯示GIB 組分具有抑制NFATc1 的核易位的潛力；c.GIB 組分通過抑制p38Thr180/Tyr182 位點的磷酸化而導致的MAPK 信號轉(zhuǎn)導；d.樹莓提取物的GIB 組分通過減少p65 的核易位和Ser536 磷酸化來抑制LPS 刺激激活NF-κB。

3.1.2 抗炎 脂多糖可以顯著提高血清中炎癥因子的含量，經(jīng)鞣花酸處理后可以降低脂多糖引起的血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β的濃度。表明鞣花酸可以抑制細胞分泌炎癥因子，從而抑制炎癥的發(fā)生。在呂廣[35]的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過LPS 處理后RAW264.7巨噬細胞，a.細胞內(nèi)NF-κB 蛋白含量增加，且呈劑量依賴性地隨著鞣花酸濃度的增加含量逐漸減少；b.細胞內(nèi)IκB 的表達減少，且呈劑量依賴性地隨著鞣花酸濃度的增加含量逐漸增加；c.細胞內(nèi)p-IκB 蛋白的表達增加，且呈劑量依賴性地隨著鞣花酸濃度的增加抑制該蛋白的表達。

非甾體抗炎藥（ACF）因其可抑制氧合酶-1 和氧合酶-2 的活性而常用于緩解疼痛和治療炎癥[36]，但長期服用會引起一些上消化道并發(fā)癥[37]。Ashutosh等[38]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸對長期服用ACF 造成的氧化應激反應以及炎癥具有緩解作用。以大鼠為試驗對象，口服ACF 21 d 后進行實驗，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟出現(xiàn)肝損傷，鞣花酸對ACF 造成的體重減輕具有恢復作用。服用ACF 的大鼠肝臟中的MDA（丙二醛）含量增加約為三周前的七倍，鞣花酸對肝損傷具有較好的恢復作用。提取物鞣花酸（測試濃度為10～100 μg/mL）對NO 的清除率為26%～83%。與對照組相比服用ACF 組大鼠肝臟中的抗氧化酶活性較低，而鞣花酸對此具有較好的恢復作用。

3.2 抗氧化

氧化應激代表了生物中氧化/抗氧化反應平衡狀態(tài)的一種紊亂?？寡趸瘎┖妥杂苫g的平衡是非常重要的，它是通過統(tǒng)稱為“氧化還原調(diào)節(jié)”的機制來調(diào)節(jié)的，這種機制保護生物免受氧化應激[39]?；钚匝踹^量會損傷細胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA，抑制細胞正常功能[40]。多酚的抗氧化活性主要是由羥基的數(shù)量和位置變化所引起的，同時也與羥基的氫原子和氧原子鍵的解離焓相關(guān)[41]。

崔珊珊等[42]利用微波提取法提取的鞣花酸為樣品，驗證鞣花酸的總還原能力、DPPH 自由基清除能力以及羥自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)微波提取法提取的鞣花酸清除自由基的能力較高。在蔣新龍等[43]的研究中，驗證了鞣花酸對植物油的抗氧化作用。文章中以鞣花酸與大豆卵磷脂作為原材料制成鞣花酸磷脂復合物，并且對核桃油以及葡萄籽油的抗氧化作用進行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在添加了鞣花酸磷脂復合物之后植物油的氧化反應活化能有所增加，相對于葡萄籽油鞣花酸磷脂復合物對核桃油的抗氧化效果較好。推測原因可能是兩種植物油含有不同的脂肪酸成分，以及不飽和脂肪酸油脂的氧化敏感程度不同。

3.3 抗癌

3.3.1 抗癌治療靶點 乙醛酶-1 已經(jīng)被證明是癌癥治療的潛在靶點。Nizar 等[44]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物是潛在的乙醛酶-1（GLO-I）的抑制劑。乙醛酶系統(tǒng)是一種普遍存在的解毒系統(tǒng)，由GLO-I 和GLO-II 組成，解毒是將有毒的糖酵解副產(chǎn)物甲基乙二醛轉(zhuǎn)化為SLG。該過程由GLO-I 催化硫代半縮醛異構(gòu)化來進行，硫代半縮醛由甲基乙二醛和谷胱甘肽自發(fā)合成SLG，然后GLO-II 催化SLG 水解釋放無毒的D-乳酸，重新生成GSH 輔助因子。由于甲氧基乙醛和與其類似的氧醛的積累對細胞活力有害，當這些有毒產(chǎn)物含量較高時，有強效抑制劑作用的乙醛酶系統(tǒng)變成了一個潛在的治療靶點。鞣花酸能與GLO-I 穩(wěn)定結(jié)合且形成穩(wěn)定的復合物。鞣花酸的顯著活性和效果歸因于與GLO-I 的多種相互作用，最終導致活性位點的封閉。

3.3.2 抗胰腺癌 胰腺癌是一種具有侵略性的疾病，死亡率非常高[45]，且胰腺癌對化學治療具有很強的抗性，其中一個原因是胰腺癌對細胞凋亡的抗性[46]，而細胞凋亡是通過激活半胱氨酸蛋白酶家族caspase來實現(xiàn)的。

Mouad 等[47]發(fā)現(xiàn)鞣花酸通過刺激凋亡細胞核小體DNA 片段化促進人胰腺癌PaCa 細胞的凋亡。進一步研究結(jié)果表明鞣花酸對人胰腺癌MIA PaCa-2 和PANC-1 細胞的增殖均有劑量依賴性的抑制作用，并且在50 μmol/L 時效果最好。鞣花酸誘導線粒體凋亡途徑與線粒體去極化、細胞色素C 的釋放和caspase 下游活化有關(guān)。鞣花酸不直接影響胰腺癌細胞的線粒體功能，根據(jù)一系列的實驗發(fā)現(xiàn)鞣花酸并沒有增加細胞色素C 從分離的線粒體中釋放到培養(yǎng)基中，且鞣花酸對滲透細胞線粒體呼吸幾乎沒有任何的影響。鞣花酸通過和NF-κB 相同的機制來抑制細胞凋亡。NF-κB 是一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，在包括胰腺癌細胞在內(nèi)的癌細胞中通常被激活，它具有抗凋亡作用。而鞣花酸劑量依賴性的降低了MIA PaCa-2 和PANC-1 細胞的NF-κB 結(jié)合活性。

3.3.3 抗黑色素細胞瘤 惡性黑色素瘤是最具有侵襲性的惡性腫瘤之一。Tan 等[48]通過研究發(fā)現(xiàn)，用鞣花酸處理的B16F10 細胞G1 期阻滯，p53 聚集，ATK 失活。在加入PTNE 抑制劑后，可以使鞣花酸引起的ATK 失活和G1 期阻滯消失，同時還能減少鞣花酸誘導的p53 的積累。鞣花酸可明顯增加PTNE的蛋白磷酸酶活性，分析表明鞣花酸對TPNE 的活性有直接調(diào)節(jié)作用。鞣花酸作為TPNE 的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，在抑制其脂質(zhì)磷酸酶活性的同時，也增強了其蛋白磷酸酶的活性。報道中還指出鞣花酸與化療藥物順鉑聯(lián)合應用可顯著提高B16F10 細胞的死亡率。

細胞周期的阻滯能力對于細胞維持基因組穩(wěn)定性時具有很重要的作用，細胞周期的失調(diào)往往會導致癌癥的發(fā)生。鞣花酸誘導的G1 期阻滯以及坑增殖作用呈劑量依賴型。用流式細胞儀檢測到用不同濃度的純鞣花酸處理細胞時起初并沒有明顯的細胞減少現(xiàn)象，24 h 后觀察到細胞數(shù)量呈劑量依賴性的減少。

3.3.4 抗肺癌 肺癌是一種常見且致死率很高的癌癥，大部分肺癌是非小細胞肺癌[49]。段婧[16]的研究表明鞣花酸對非小細胞肺癌HOP62 和H1975 細胞系均有抑制作用，并且呈劑量依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)其原理并不是激活caspase 通路，而是抑制mTOR磷酸化，從而影響Akt-mTOR 通路引發(fā)細胞自噬，同時少量增加G2/M 細胞周期抑制癌細胞生長。

3.3.5 抗肝癌 肝癌是致死率極高的惡性腫瘤之一[50]。臨床治療通常采用手術(shù)切除、移植、放療等手段[51]。但由于現(xiàn)存的治療手段十分受限，所以研發(fā)新型的治療方法十分必要。鞣花酸對多種腫瘤均具有良好的抑制作用，除了直接影響基因表達及蛋白質(zhì)功能以外[52?53]，還可以通過調(diào)控微小RNA 來抑制腫瘤[54]。鐘晨[55]發(fā)現(xiàn)鞣花酸對HepG2 細胞的抑制作用具有劑量和時間依賴性，結(jié)果表明鞣花酸可將該細胞周期阻滯在G0/G1，同時也可以引發(fā)DNA 損傷。通過體外實驗證明鞣花酸聯(lián)合鹽酸阿霉素或順鉑能夠有效的抑制肝癌細胞的生長，并且通過激活線粒體途徑引發(fā)細胞凋亡。

3.4 解毒作用

3.4.1 緩解亞硝酸鹽導致的病變 亞硝酸鹽被應用于血管擴充劑、支氣管擴充劑以及緩解氰化物中毒等方面，但亞硝酸鹽攝入量過多會導致一系列疾病[56]。亞硝酸鹽的主要攝入方式為口服，在胃腸中的酸性環(huán)境下亞硝酸鹽會被轉(zhuǎn)化為亞硝胺，而亞硝胺有致癌風險[57]。長期低劑量攝入亞硝酸鹽會對健康造成損傷，如呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、出生缺陷等[58]，長期大量攝入則有致癌的風險[59]。

Amira 等[60]的研究表明鞣花酸對攝入亞硝酸鹽導致的病變具有緩解功效，未服用鞣花酸殼聚糖顆粒的大鼠在連續(xù)攝入亞硝酸鹽2 g/L 水溶液8 周后造成了部分大鼠出現(xiàn)死亡、偏癱、腹部腫瘤等，血液中血紅蛋白水平明顯下降，而在攝入亞硝酸鹽的同時服用鞣花酸其血紅蛋白含量接近正常水平。大鼠在停止攝入亞硝酸鹽時血液中AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）活性與尿素含量會恢復至原來水平，而在攝入亞硝酸鹽的同時服用鞣花酸其血液中AST 活性顯著下降。

3.4.2 緩解馬兜鈴酸導致的急性腎損傷 馬兜鈴酸是主要從馬兜鈴屬植物中獲得的一類硝基菲羧酸類化合物[61]，而含有這類物質(zhì)的中藥其在臨床上常用于肝炎、痛風、高血壓等疾病的治療[62]。短期大量攝入馬兜鈴酸會導致腎小管上皮細胞損傷，造成腎纖維化等[63]。在付千[64]的研究中發(fā)現(xiàn)，鞣花酸對馬兜鈴酸造成的急性腎損傷有緩解作用，在體外研究中鞣花酸可以抑制由馬兜鈴酸造成的HK-2（人腎小管上皮細胞）細胞的凋亡，其通過抑制NF-κB/NLRP3 炎性小體的激活來抑制馬兜鈴酸誘導的細胞凋亡。在體內(nèi)研究中檢測發(fā)現(xiàn)小鼠尿液中蛋白濃度以及血清中尿素氮、肌酐均呈劑量依賴性的降低，鞣花酸可以改善腎小管損傷程度，以及腎纖維化等。

3.5 緩解糖尿病

在高糖作用下的HepG2 細胞中，鞣花酸（15～30 μmol/L）可加強葡萄糖的利用率，類似于胰島素增敏藥物二甲雙胍的最高劑量（150 μmol/L）。鞣花酸上調(diào)胰島素受體底物，Akt 和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）在胰島素的刺激下磷酸化[65]。同樣的鞣花酸也促進刺激葡萄糖誘導小鼠離體胰島的胰島素分泌，但并沒有達到促分泌藥物拖布他胺的作用。許多文章報道了鞣花酸和鞣花酸衍生物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用的劑量依賴性效率。鏈脲佐菌素（STZ）會導致胰島β細胞被破壞，進而影響胰島素的產(chǎn)生，導致胰島素依賴性糖尿病。在給STZ 糖尿病大鼠OGTT（口服葡萄糖耐量試驗）前60 min 給鞣花酸（25、50、100 mg/kg），鞣花酸以劑量依賴性降低血糖[66]。鞣花酸以25、50、100 mg/kg 進行給藥，2 d 一次，10 d 后以劑量依賴性降低空腹血糖，同時增加胰島素水平[67]。

Jozaa 等[68]發(fā)現(xiàn)Nrf 2 的激活對由鏈脲佐菌素（STZ）誘導的大鼠糖尿病腎病具有保護作用，在用鞣花酸對誘導的大鼠進行8 周的治療后發(fā)現(xiàn)鞣花酸通過抗氧化和抗炎作用來改善糖尿病腎病。鞣花酸可以使NF-κB 的降低、GSH 的活性升高γ-GCL 和SOD 活性的降低以及Nrf2 核轉(zhuǎn)運增加有關(guān)。鞣花酸還可以抑制Keap1 的胞漿表達及其與Nrf2 的相互作用，增加了Akt 和GS3Kβ的磷酸化，降低了Fyn 的磷酸化和核積累。在實驗給藥的同時增加了一組STZ+EA+三尖杉堿，發(fā)現(xiàn)三尖杉堿可以抑制上述鞣花酸的功能，從而發(fā)現(xiàn)鞣花酸是通過抗氧化和抗炎作用來改善糖尿病和腎病的。

3.6 抑菌作用

閆莉等[69]發(fā)現(xiàn)鞣花酸對齲齒菌有抑制作用。當鞣花酸濃度在12.5～50 mg/mL 時，變異鏈球菌產(chǎn)生了抑菌圈，且抑菌圈直徑＞15 mm。進一步研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸對變異鏈球菌的生長以及生物膜的形成均有抑制作用，其機制可能是通過抑制（細胞外多糖）EPS 產(chǎn)生，降低細菌的黏附，破壞細菌細胞膜，從而降低細菌活性。

3.7 調(diào)控細胞周期

鄭進萍等[70]發(fā)現(xiàn)鞣花酸對IPEC-J2（豬腸道上皮細胞）細胞具有增殖作用以及抑制凋亡的作用，且呈劑量依賴型。經(jīng)實驗驗證發(fā)現(xiàn)鞣花酸對該細胞的增殖作用以及抑制凋亡作用的機制與Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 的mRNA 表達的下調(diào)有關(guān)。吳家榮[71]同樣進行了鞣花酸對IPEC-J2 細胞影響的研究。結(jié)果表明鞣花酸可增加與其緊密連接相關(guān)的基因cyclinA、cyclinB、cyclinC、cyclinD、cyclinE的表達。鞣花酸對細胞膜屏障具有保護作用。Leticia 等[72]用石榴皮提取物即鞣花酸和鞣花酸衍生物處理TPH-1 細胞后發(fā)現(xiàn)其能夠促進DNA 片段化（主要作用在G2/M 期），大約為未處理細胞的七倍左右，而DNA 片段化的細胞的增加預示著細胞凋亡的誘導，是一種早期的應答性細胞死亡，是預測腫瘤及抗腫瘤治療反應的重要指標。

3.8 保持腸道健康

鞣花單寧很難被生物體的腸道直接吸收，在小腸微生物或者生理pH 下水解生成鞣花酸，游離的鞣花酸可以在小腸被吸收[73]。研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸對一系列的致病菌具有抑制作用[74?75]，例如：致病性的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、霍亂弧菌等，但出乎意料的是鞣花酸對益生菌和雙歧桿菌不具有抑制作用，尤其對Breve 雙歧桿菌以及infantis 雙歧桿菌具有明顯的促進作用[76]。

未被吸收消化的鞣花單寧以及鞣花酸在進入結(jié)腸后，由微生物代謝產(chǎn)生一系列的鞣花酸代謝產(chǎn)物——尿石素[77]。尿石素代謝產(chǎn)物被證明可以抑制病原菌[78]，促進或者不影響益生菌的活性。

3.9 其他作用

鞣花酸的抗癌[33]、抗炎[44]、抗氧化[41]效果較為顯著且均已得到驗證并有文章報道，而鞣花酸是否具有其他的生物活性有待進一步驗證，在徐冰等[79]的報道中發(fā)現(xiàn)鞣花酸對黃褐斑具有一定的抑制作用，自愿受試者連續(xù)服用覆盆子提取物30 d 后，觀察結(jié)果顯示，受試者身體表面黃褐斑的面積以及顏色都有不同程度的減少，且并未產(chǎn)生新的黃褐斑，實驗中統(tǒng)計有效率為68%左右。

心腦血管類疾病是一種在老年群體中高發(fā)的疾病，抗凝血劑可緩解部分的血栓形成或由血栓造成的疾病，對于心血管具有一定的保健作用，趙慧等[80]的研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸具有一定的抗凝血效果，以中藥地榆為原材料，在正常人抗凝血漿中加入炮制的地榆提取液以及鈣離子，鈣離子促進血液凝固。實驗后發(fā)現(xiàn)地榆經(jīng)過適當炮制后的提取液加入抗凝血漿中，在5 min 內(nèi)血紅蛋白的吸光度值的變化率最高，表現(xiàn)出較強的抗凝血作用。

阿爾茲海默癥（AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，老年人發(fā)病率較高，其發(fā)病后無法根治，隨著社會老齡化加重，逐漸引起人們的廣泛關(guān)注并成為現(xiàn)今研究熱點。其中，一種較為認可的發(fā)病機制為β淀粉樣蛋白的積累，通過緩解其在腦中的大量積累來緩解AD 的病癥。仲麗麗等[81]發(fā)現(xiàn)鞣花酸對阿爾茲海默癥（AD）具有緩解作用。用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠來模擬AD 的病理變化以及行為學特征。他們利用水迷宮鍛煉小鼠的記憶力，用富含鞣花酸的石榴汁對轉(zhuǎn)基因小鼠進行灌胃，實驗結(jié)果表明進行灌胃的小鼠的空間學習以及記憶力要高于空白組，且小鼠腦中β淀粉樣蛋白的堆積減少。

肥胖目前成為全球性的健康問題，過度肥胖會影響身體健康同時也會引起多種疾病。在焦士蓉等[82]發(fā)現(xiàn)鞣花酸具有抑制人脂肪干細胞生長活性的作用，且呈劑量效應關(guān)系，當鞣花酸濃度為4.5 μg/mL時，對人脂肪干細胞生長的抑制率約為47.23%。綜上所訴，鞣花酸在保健方面具有較好的效果，對其進行深入研究對人類健康十分有益。

4 結(jié)語與展望

鞣花酸作為一種天然多酚二內(nèi)酯，廣泛分布在自然界中。因其特殊的理化性質(zhì)導致其很難被提取純化，又因游離的鞣花酸含量較低、提取率不高等問題，并未被大量投入到生產(chǎn)生活中。隨著科技地不斷發(fā)展，提取方法地逐漸優(yōu)化，使得鞣花酸的提取率不斷提高，并且可以通過化學合成法大量合成，使其在人類疾病治療以及生產(chǎn)生活中有了更好的應用前景。目前，對于鞣花酸的生理活性以及如何提高鞣花酸提取率都有較為系統(tǒng)的研究，本文對其進行了系統(tǒng)性的整理，為后期鞣花酸的應用和發(fā)展提供部分的理論基礎(chǔ)。鞣花酸具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗糖尿病等多種生物活性并對一些慢性疾病具有較好的抑制作用，因鞣花酸對保持人體健康具有一定的輔助作用，其在生物醫(yī)藥中具有巨大發(fā)展前景，但其在臨床醫(yī)藥中的應用還需深入研究。目前，鞣花酸保健品在一些發(fā)達國家中很受歡迎，而國內(nèi)鞣花酸在生物醫(yī)藥、日常生產(chǎn)生活中應用前景還有很大的發(fā)展空間，值得進行更為深入的研究。