基于TLR4/NF-κB 信號通路探討黔產(chǎn)刺梨根干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

陳波洋，趙玲婕，羅運(yùn)鳳，管連城，于海洋，趙 潔，張旭飛，蔣志濱，陳云志,

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.黔南州中醫(yī)院，貴州都勻 558000；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，貴州貴陽 550001）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種反復(fù)發(fā)作的特發(fā)性慢性結(jié)腸黏膜炎疾病，以血性腹瀉、腹痛等為典型臨床癥狀[1]。近年來，UC 發(fā)病率明顯上升且發(fā)病人群呈年輕化，已成為一種全球性疾病[2]。UC 病因病機(jī)復(fù)雜，受遺傳、環(huán)境、心理健康、免疫等因素的共同影響[3]，而免疫功能在其中發(fā)揮重要作用[4]。目前，常用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)類固醇、硫嘌呤等作為UC 的治療藥物，但作用效果有限且副作用多[5]。潰瘍性結(jié)腸炎與TLR4/NF-κB 信號通路關(guān)系密切[6]。TLR4/NF-κB 信號通路是UC 發(fā)病過程中的重要介導(dǎo)因子，常導(dǎo)致UC 患者結(jié)腸炎癥持續(xù)性加重，已成為UC 患者藥物治療的靶點(diǎn)之一[7]。

刺梨深受貴州人民喜愛，并且與刺梨相關(guān)的產(chǎn)品也已遍布全國。刺梨根始載于《草木便方》，系薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt 的根，具有健胃消食，止瀉澀精的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，刺梨根莖中的三萜類、鞣花酸類、黃酮類以及寡糖類化合物是其抗炎作用的主要有效成分，并且實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了刺梨根莖的民間抗炎功效[8]。臨床常用于治療痢疾、泄瀉等消化系統(tǒng)疾病。研究發(fā)現(xiàn)，刺梨根水煎液可促進(jìn)大鼠胃潰瘍愈合[9]。此外，臨床上用鮮刺梨根水煎液治療急性細(xì)菌性痢疾有較好療效，總有效率達(dá)92.3%且無不良反應(yīng)[10]。

故本課題組從TLR4/NF-κB 信號通路探討黔產(chǎn)刺梨根干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的作用機(jī)制，以期為刺梨根的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)，更為了刺梨根在現(xiàn)實(shí)生活中應(yīng)用的普及，使刺梨根這種價廉物美的天然營養(yǎng)植物對人類的健康作出重要貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性SD 大鼠60 只 體質(zhì)量（230±10）g，天勤生物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK（湘）2019-0014，本次動物實(shí)驗(yàn)獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。大鼠在溫度22～24 ℃、相對濕度40%～60%下用普通飼料喂養(yǎng)7 d 后開始實(shí)驗(yàn)；黔產(chǎn)刺梨根貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)方藥教研室蔣志濱副教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt 的根；柳氮磺嘧啶（批號：E1525058） Aladdin 公司；2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號：SLBX3263） Sigma 公司；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為：JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0635Ra） 基因美生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒（批號：BM1144） 博美生物科技有限公司；實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒（批號：RR047A） 寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker（批號：RM19001） ABClone 公司；ECL 發(fā)光試劑盒（批號：KF001） Affinity 公司；Immobilon-PSQ PVDF 膜（批號：ISEQ00010） Sigmaaldrich 公司；Glycine、Tris for molecular biology、SDS（批號分別為：1275GR500、1115GR500、1275GR500） Biofroxx 公司；兔多抗SLC6A4（批號分別：YO7512，G1005-1，G1001，A14782） ABclonal 公司。

QuantStudioTM3 實(shí)時熒光定量（RT-PCR）儀、TCA0096 熱循環(huán)儀、MK3 全功能酶標(biāo)儀 Thermo Fisher 儀器有限公司；KZ-III-F 高速低溫組織研磨儀賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 刺梨根經(jīng)蒸餾水浸泡20 min 后，武火煮沸30 min 及文火煎煮1 h，再重復(fù)以上操作一次，合并兩次煎煮液，生藥質(zhì)量濃度為8 g/mL，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 動物模型制作 將60 只SD 雄性大鼠隨機(jī)分為空白組（10 只）、模型組（50 只）。據(jù)參考文獻(xiàn)[11]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，造模前大鼠禁食24 h，確定大鼠直腸內(nèi)排空大便。乙醚麻醉后使用生理鹽水潤滑聚乙烯管，將TNBS 與乙醇混合溶液（100 mg/kg TNBS+0.25 mL 50%乙醇）緩慢注入距大鼠肛門處約8 cm的結(jié)腸部位，灌腸1 次。灌腸結(jié)束后，將大鼠頭部朝下倒置約5 min，并用小夾子夾住肛周皮膚，謹(jǐn)防TNBS 藥物流出，直至大鼠蘇醒?？瞻捉M大鼠結(jié)腸灌注0.8 mL 生理鹽水。以體重明顯下降，出現(xiàn)典型腹瀉、糞便中有暗紅色斑點(diǎn)且肛門可見出血作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠結(jié)腸組織病理變化 隨機(jī)抽取2 只大鼠，采取HE 染色觀察各組大鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變。研究表明，結(jié)腸病理顯示充血、水腫、大腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞增多，腺體病變及潰瘍形成等系列變化，提示UC造模成功[12]。

1.2.4 動物分組、給藥與取樣 造模成功后，取空白組中8 只正常大鼠為正常組，再將40 只造模成功大鼠隨機(jī)分為5 組：UC 模型組、柳氮磺嘧啶組、刺梨根水煎液高、中、低劑量組。柳氮磺嘧啶組0.3 g/（kg·d）灌胃，刺梨根水煎液高、中、低組分別按8、4、2 g/（kg·d）劑量灌胃（給藥劑量按60 kg 成人臨床常用劑量與大鼠體表面積折算），正常組、UC 模型組均灌胃等體積生理鹽水，1 次/日，連續(xù)給藥21 d。第21 d末時禁食24 h，大鼠腹腔注射350 mg/kg 水合氯醛麻醉，并腹主動脈取血，靜置30 min，低溫離心10 min（3000 r/min），分離收集血清，?80 ℃低溫冰箱保存。取血完畢后快速收集結(jié)腸組織，截取結(jié)腸遠(yuǎn)端部分并縱行剖開后用冰生理鹽水沖洗腸道內(nèi)容物。使用濾紙吸收多余水分，縱行一分為二，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片、HE 染色，顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)。一部分?80 ℃低溫冰箱保存，用于檢測結(jié)腸中Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 及蛋白表達(dá)。

1.2.5 ELISA 檢測大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作與檢測，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長依序測量各孔的吸光度A，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品檢測目標(biāo)的濃度。

1.2.6 熒光定量PCR 法檢測結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達(dá) 根據(jù)說明書，先提取樣品總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE 純化，見表1。使用Thermo Scientific PikoReal 軟件分析PCR 過程各樣本的CT（Threshold cycle）值。反應(yīng)結(jié)束后作熔解曲線檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。通過2?△△CT法計(jì)算目的Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.2.7 Western blot 檢測結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá) 參照說明書，將樣本取出放入2 mL 研磨管中，然后向每管加入3 mm 鋼珠及RIPA 裂解液（按照質(zhì)量比樣本:裂解液=1:10），置于高速低溫組織研磨儀內(nèi)（溫度?20 ℃，研磨4 次，每次60 s）；取出放4 ℃冰箱30 min 進(jìn)行裂解，30 min后取出放入離心機(jī)（4 ℃、12000 r/min 離心、10 min）；用BCA 蛋白定量試劑盒測定離心完畢后上清液的蛋白濃度。配置相應(yīng)電泳凝膠，上樣后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，用TBST 封閉2 h，將PVDF 膜放入一抗中，（一抗?jié)舛龋篗yd88 1:1000；p50 1:1000；p65 1:2000；TLR4 1:1000；β-actin 1:100000），搖床上輕搖，4 ℃孵育過夜；用TBST 將PVDF 膜洗3 次，每次5 min；在二抗中放入PVDF 膜（稀釋濃度：1:5000）中，搖床上輕搖，室溫孵育2～3 h；用TBST 將PVDF 膜洗3 次，每次10 min，將ECL 發(fā)光液的A、B 兩種試劑等體積混勻后滴加至平鋪到曝光板的PVDF 膜上，反應(yīng)1 min 后，將裝有PVDF 膜的曝光板放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀的暗室中，依據(jù)信號強(qiáng)弱合適調(diào)整曝光時間，曝光。最后用天能GIS 機(jī)箱控制軟件V2.0曝光掃描條帶，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Graph Pad Prism 8.0.1 作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組樣本均值采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)及Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表明結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表明統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀態(tài)觀察

各組大鼠飼喂21 d，取材前一天。正常組大鼠精力旺盛，活動性高，毛發(fā)柔順有光澤，大便正常。模型組大鼠出現(xiàn)懶動，喜蜷伏角落扎堆，毛悴色夭，體質(zhì)量下降，大便稀溏或半稀溏，伴有膿血，拖尾。刺梨根水煎液低劑量組大鼠與模型組大鼠外觀、行為、精神等基本一致或看不出改善；刺梨根水煎液中劑量組大鼠外觀、行為、精神等稍有改善；刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組大鼠活動趨于正常，毛發(fā)逐漸恢復(fù)至相對有光澤，大便逐漸成形，與正常組接近。

2.2 UC 大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

正常組結(jié)腸黏膜各組織結(jié)構(gòu)較完整，固有層內(nèi)大腸腺排列較為密集且大小相近，未見上皮細(xì)胞變性壞死或脫落。與正常組相比，模型組結(jié)腸黏膜完整性受到破壞，固有層內(nèi)部腸腺腺腔膨脹，黏膜下層或結(jié)腸全層形成明顯潰瘍，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞、壞死組織取代正常結(jié)構(gòu)。刺梨根水煎液低劑量組結(jié)腸粘膜等較模型組基本一致或改善不明顯；刺梨根水煎液中劑量組結(jié)腸黏膜破壞稍有改善，但尚存在炎性細(xì)胞與壞死組織等；刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組兩組較模型組比，大鼠結(jié)腸黏膜各組織結(jié)構(gòu)較為清晰，腸腺排列相對規(guī)則，間質(zhì)內(nèi)偶見單個淋巴細(xì)胞或中性粒細(xì)胞。見圖1。

2.3 刺梨根水煎液對UC 大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平影響

模型組較正常組而言，大鼠結(jié)腸中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)極顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。刺梨根水煎液高劑量組干預(yù)后可明顯抑制各炎癥因子的分泌；刺梨根水煎液高、中劑量組較模型組比，均可顯著降低IL-1β、IL-6 與TNF-α表達(dá)水平（P＜0.05）。刺梨根水煎液高劑量組與柳氮磺嘧啶組抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的效果相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；刺梨根水煎液中、低劑量組與柳氮磺嘧啶組抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的效果相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 刺梨根水煎液對UC 大鼠結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平的影響（，n=8）Fig.2 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in the colonic tissues of UC rats (,n=8)

2.4 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結(jié)腸Myd88、NFκB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達(dá)的影響

模型組較正常組比，大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50 mRNA 表達(dá)極顯著上升（P＜0.01），TLR4 mRNA表達(dá)顯著上升（P＜0.05）。刺梨根水煎液高劑量組較模型組比，大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、TLR4 mRNA 表達(dá)均顯著下降（P＜0.05）；刺梨根水煎液中劑量組較模型組相比，大鼠結(jié)腸Myd88 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較模型組相比，大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。刺梨根水煎液高、中劑量組較柳氮磺嘧啶組相比，大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較柳氮磺嘧啶組相比，大鼠結(jié)腸Myd88、TLR4 mRNA 表達(dá)顯著上升（P＜0.05），NF-κB p50 mRNA 表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見圖3。

圖3 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 mRNA 表達(dá)的影響（，n=8）Fig.3 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the expression of Myd88,NF-κB p50,NF-κB p65 and TLR4 mRNA in the colon of UC model rats（,n=8）

2.5 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結(jié)腸Myd88、NFκB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)的影響

模型組較正常組比，大鼠結(jié)腸Myd88 蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.05），NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4蛋白表達(dá)水平均極顯著升高（P＜0.01）。刺梨根水煎液高劑量組較模型組比，大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)均極顯著降低（P＜0.01）；刺梨根水煎液中劑量組較模型組比，大鼠結(jié)腸Myd88 蛋白表達(dá)極顯著下降（P＜0.01），NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較模型組比，各蛋白表達(dá)不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。刺梨根水煎液高劑量組較柳氮磺嘧啶組比，各組蛋白不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；刺梨根水煎液中劑量組較柳氮磺嘧啶組比，NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.05）；刺梨根水煎液低劑量組較柳氮磺嘧啶組比，NF-κB p65、TLR4 蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），結(jié)果見圖4。

圖4 刺梨根水煎液對UC 模型大鼠結(jié)腸Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65、TLR4 蛋白相對表達(dá)量的影響（，n=8）Fig.4 Effect of Rosa roxburghii Radix aqueous decoction on the relative expression of Myd88,NF-κB p50,NF-κB p65 and TLR4 proteins in the colon of UC model rats (,n=8)

3 討論

UC 是一種以腸道炎癥與結(jié)腸粘膜損害為特征的常見消化系統(tǒng)疾病。TLR4/NF-κB 信號通路在UC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。研究表明，UC 的炎癥機(jī)制被NF-κB 激活后導(dǎo)致腸道炎性因子異常表達(dá)[13]。從而激活UC 一系列免疫、炎癥反應(yīng)，加速UC的發(fā)生發(fā)展[14]。因此，抑制NF-κB 激活作為有效的治療策略可減輕UC 患者的不良反應(yīng)[15]。

Toll 樣受體（TLRs）作為模式識別受體家族的主要類型之一，主要誘導(dǎo)炎癥發(fā)生和建立適應(yīng)性免疫[16]。其中，亞型TLR4 識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）被激活后，招募骨髓樣分化蛋白（MyD88）觸發(fā)信號級聯(lián)誘導(dǎo)NF-κB 激活[17]。進(jìn)而促進(jìn)NFκB p50 與NF-κB p65 從細(xì)胞質(zhì)易位至細(xì)胞核與DNA 結(jié)合[4,18]。隨后在結(jié)腸組織及外周血中釋放大量IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)，加劇UC 患者結(jié)腸及外周血的炎癥浸潤[19?20]。

本研究選用刺梨根作為實(shí)驗(yàn)材料，建立UC 大鼠模型，通過PCR、Western blot、ELISA 法及結(jié)腸組織病理切片等分析刺梨根水煎液對UC 的干預(yù)作用。結(jié)果表明，造模成功后，模型組大鼠結(jié)腸及血清中各個檢測指標(biāo)與正常組差異顯著（P＜0.01 或P＜0.05）。與模型組相比，刺梨根水煎液高劑量組大鼠結(jié)腸組織中Myd88、NF-κB p50、NF-κB p65 及TLR4 mRNA 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05）；說明刺梨根水煎液抑制了炎癥發(fā)生機(jī)制的相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，有效阻止或平衡了UC 炎癥通路的激活；同時，刺梨根水煎液高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子表達(dá)較模型組極顯著下降（P＜0.01），表明刺梨根水煎液可改善UC 結(jié)腸組織中炎癥因子水平，能夠有效緩解UC 中的炎癥浸潤，促使UC 大鼠病變結(jié)腸康復(fù)。觀察結(jié)腸組織病理切片，刺梨根水煎液高劑量組可明顯改善病變結(jié)腸受損情況。

4 結(jié)論

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)刺梨根水煎液高劑量組可明顯改善TNBS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎病理損傷，發(fā)揮保護(hù)腸道的作用。其作用機(jī)制與TLR4/NF-κB 信號通路密切相關(guān)，刺梨根水煎液高劑量組使這條通路向正常狀態(tài)明顯轉(zhuǎn)變，發(fā)揮抗炎作用，減輕UC 大鼠腸道內(nèi)炎癥侵襲。本文初步闡明刺梨根水煎液對UC 大鼠抗炎的作用機(jī)制，一方面可為臨床刺梨根治療潰瘍性結(jié)腸炎提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；另一方面可通過刺梨根抗腸炎普及刺梨根這種價廉物美的天然營養(yǎng)植物，使其成為人類健康的福祉。