響應面優(yōu)化超聲波輔助酸法提取百香果皮果膠工藝及其抗氧化活性研究

王錦秀，趙晴晴，徐心怡，謝 倩，陳清西

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建福州 350000）

百香果（Passiflara eduliaSims.）又名巴西果、雞蛋果，為西番蓮科（Passiloraceae）、西番蓮屬（Passiflora）多年生常綠攀緣性藤本植物[1?2]。2018 年底全國百香果總產(chǎn)量達到590.03 kt，較上年新增67.47%，福建省總產(chǎn)量達200.00 kt，較上年增長150.00%[3]。百香果汁因營養(yǎng)豐富[4?5]常被加工成復合果汁[6]、果醋[7]、果酒[8]等加工產(chǎn)品；百香果皮（PFP）占鮮果重50%～55%[9]，在百香果加工中常作為廢棄物丟棄[10]，而PFP中富含果膠、多酚、膳食纖維等多種活性物質(zhì)[11?12]，因此對PFP 進行有效利用可提高百香果全果利用價值。

果膠主要存在于高等植物細胞壁中，提取方法主要有酸法、酶法、微波輔助法、超聲波輔助法、螯合劑法等[9,13?14]，提取方法不同果膠得率、性質(zhì)差異較大，如酸法提取果膠質(zhì)量好、生產(chǎn)成本低，但果膠得率低且會變性[9]；酶法提取果膠操作簡單、果膠性質(zhì)穩(wěn)定，但對酶純度要求較高；微波輔助法可加速果膠溶出，但成本高且溫度不易控制[15]，超聲-微波協(xié)同法提取時間短、提取率較高，但對設備條件要求較高，還需進一步研究。超聲波的“空化作用”可使細胞破碎或崩解[16?17]，促使植物細胞有效成分溶出[18]，利用超聲波輔助酸法提取果膠可有效中和酸法缺點，大大縮短提取時間[19]，但不同物料對超聲提取條件要求不同。目前，提取PFP 果膠的方法有超聲波輔助純水法（12.67%[20]）、超聲-微波協(xié)同輔助提取法（12.14%[21]）、超聲波輔助酶法（3.22%[22]）等，也有使用超聲波輔助檸檬酸法提取PFP 果膠（13.07%[23]），但多使用熱干燥法干燥物料。果品熱處理已被證明會降解和脫甲氧基化果膠分子，果膠降解程度隨溫度增加而增加[24]，而非熱處理則可以保留更多原果膠。

研究表明，多種植物果膠均具有抗氧化活性[25]，如柑橘皮[26]、檸檬皮[27]、胡蘿卜[28]等，在功能性食品及藥品中的應用具有較大利用價值。因此，本文針對當?shù)卮砥贩N，以‘福建百香果2 號’為試驗對象，使用冷凍干燥法干燥PFP，以酸法為對照，采用超聲輔助檸檬酸法提取PFP 果膠，在單因素基礎上利用響應面優(yōu)化得到PFP 果膠的最佳提取工藝，并在提取果膠的基礎上進一步研究兩種方法提取的果膠對DPPH 自由基（DPPH·）、羥自由基（·OH）以及超氧陰離子自由基（·）清除能力的差異，為解決當?shù)仄贩N百香果皮的資源浪費狀況，為其進一步開發(fā)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘福建百香果2 號’果皮 福建省漳州市華安縣聯(lián)眾果蔬專業(yè)合作社提供，將去除海綿層的百香果外果皮洗凈晾干，冷凍干燥48 h 后用高速多功能粉碎機粉碎，過80 目篩后保存于?40 ℃冰箱；檸檬酸、咔唑、半乳糖醛酸、水楊酸、硫酸亞鐵（FeSO4）、鄰苯三酚（C6H6O3） 國藥集團化學試劑有限公司；羥甲基氨基甲烷（Tris）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）生工生物工程上海股份有限公司；所有試劑均為分析純。

LGJ-25C 型真空冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R 臺式高速冷凍離心機美國 BECKMAN 公司；Infinite M200 Pro 多功能酶標儀 瑞士Tecan 集團公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸法提取百香果皮果膠 參考劉運花[9]的方法，并略有改動。稱取5.00 g PFP 粉末于150 mL 檸檬酸提取液（pH2.0）中攪拌均勻，在水浴溫度80 ℃條件下提取4 h，用2 層200 目尼龍布作為濾布抽濾2 次得果膠原液，果膠原液濃縮至原體積1/3 后加入1.5 倍95%乙醇醇沉12 h，抽濾得粗果膠濾餅，95%乙醇洗滌2 次，所得濾餅冷凍干燥48 h 后即得PFP 果膠。

1.2.2 超聲波輔助酸法提取百香果皮果膠 參考辛明等[23]的方法，并略有改動。超聲提取條件為超聲溫度50 ℃、超聲功率180 W 條件下超聲70 min，其他步驟參照1.2.1。

1.2.3 果膠提取得率測定 參照黎英等[21]方法略有改動。吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0 mg/L 半乳糖醛酸標準溶液各1.00 mL 于25 mL 玻璃試管中，分別加入0.25 mL 1 g/L 咔唑-乙醇溶液，產(chǎn)生白色絮狀沉淀，不斷搖動試管，快速加入5.0 mL 濃硫酸，振蕩搖勻，85 ℃水浴20 min，取出后放入冷水中冷卻，在波長528 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

稱取一定質(zhì)量果膠粉末溶于超純水，即為果膠樣品溶液，吸取1 mL 果膠樣品溶液于25 mL 試管中，按照標準曲線方法測定果膠樣品溶液吸光度。按照公式（1）計算PFP 果膠提取得率。

式中：C 為標準曲線計算所得半乳糖醛酸濃度，mg/L；V 為果膠樣品溶液總體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；W 為果膠粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 pH 對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以pH 為變量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5）在料液比1:30 g/mL、超聲時間70 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率180 W 條件下超聲提取70 min，以PFP 果膠提取得率為指標確定最佳pH。

1.2.4.2 料液對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP粉末，以最佳pH2.0 在不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）條件下考察不同提取料液比對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳料液比。

1.2.4.3 超聲時間對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0 在不同超聲時間（30、50、70、90、110 min）條件下考察不同提取超聲時間對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲時間。

1.2.4.4 超聲功率對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0、超聲時間70 min 在不同超功率（150、180、210、240、270 W）條件下考察不同提取超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲功率。

1.2.4.5 超聲溫度對提取得率的影響 稱取5.00 g PFP 粉末，以最佳料液比1:25 g/mL、pH2.0、超聲時間70 min、超聲功率210 W 在不同超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）條件下考察不同提取超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響，確定最佳超聲溫度。

1.2.5 響應面試驗設計 綜合單因素實驗結果，選擇pH、超聲時間、超聲功率和超聲溫度為主要考察因素，確定如表1 所示的因素和水平，采用Design-Expert 10.0 軟件，應用Box-Behnken 原理進行4 因素3 水平試驗（共29 組），從而確定提取最優(yōu)條件并進行驗證試驗。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factor and level table of response surface

1.2.6 PFP 果膠抗氧化活性的測定

1.2.6.1 DPPH·清除能力測定 參照馬麗蘋等[29]方法略有修改。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL PFP 果膠溶液，各取2 mL 至10 mL 試管，分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液混合均勻，室溫避光反應30 min 后，在517 nm 波長處測定吸光度。本底組用2 mL 95%甲醇溶液代替2 mL DPPH-甲醇溶液，空白組用2 mL 超純水代替果膠溶液；以抗壞血酸（VC）為陽性對照。按公式（2）計算PFP 果膠對DPPH·清除率。

式中：A1為測定組吸光度；A2為本底組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.2.6.2 對·OH 清除能力測定 參照宋佳敏等[30]方法略有修改。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL PFP 果膠溶液，各取1 mL 至10 mL 試管，分別加入1.00 mL 1.8 mmol/L FeSO4、1.0 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2，振蕩試管使溶液混合均勻，37 ℃水浴30 min，在510 nm 處測定吸光度；空白組用超純水代替樣品溶液；以VC為陽性對照。按公式（3）計算PFP 果膠對·OH 清除率。

式中：A樣品為測定組吸光度；A空白為空白組吸光度。

式中：Ai為測定組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復三次以上，以Excel 2019 整理數(shù)據(jù)，以SPSS 26.0 進行顯著性分析及回歸分析，以單因素方差分析（One-way ANOVA）法對所得數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，以Design Expert 10.0 進行響應面試驗設計。用Origin 2019 作圖。

2 結果與分析

2.1 半乳糖醛酸標準曲線

如圖1 所示，在波長528 nm 下測定吸光度，以半乳糖醛酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出標準曲線及其回歸方程:y=0.0241x+0.2157，R2=0.9991，在0～90 μg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

圖1 半乳糖醛酸標準曲線Fig.1 Galacturonic acid standard curve

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 pH 對PFP 果膠提取得率的影響 如圖2，PFP果膠提取得率隨pH 升高呈先上升后下降趨勢。當pH 為2.0 時，果膠提取得率達最大值14.44%。當pH＜2.0 時，果膠提取得率隨著酸性的增高而降低，這是因為樣品在較強酸性溶劑的浸泡中，原果膠逐漸轉(zhuǎn)化成可溶性果膠，然而較強的酸性環(huán)境又會促使果膠脫脂分解[32]；當pH＞2.0 時，果膠提取得率隨酸性降低而下降，這是因為溶劑酸性較低時，樣品中原果膠轉(zhuǎn)化成可溶性果膠能力也隨之降低，提取效率下降[33]。

圖2 pH 對PFP 果膠提取得率的影響Fig.2 Effect of pH on pectin extraction ratio of PFP

2.2.2 料液比對PFP 果膠提取得率的影響 如圖3，PFP 果膠提取得率隨料液比加大呈先上升后下降趨勢，當料液比為1:25 g/mL 時，提取得率達最大值14.57%，可能酸性溶液用量逐漸加大時，溶質(zhì)與溶劑濃度差也隨之增大，作為溶質(zhì)的原果膠則更加迅速擴散溶出，果膠提取得率增高[34]；當料液比＞1:25 g/mL時，果膠提取得率呈下降趨勢，下降了3.09%，這可能是因為果膠擴散距離拉長，擴散能力降低，且隨溶劑增加，溶劑對超聲波的能量消耗也隨之增加，導致作為溶質(zhì)的原果膠吸收能量減少，果膠提取得率下降[33?34]。

圖3 料液比對PFP 果膠提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on pectin extraction ratio of PFP

2.2.3 超聲時間對PFP 果膠提取得率的影響 如圖4，PFP 果膠提取得率隨超聲時間延長呈先上升后下降趨勢，當超聲時間70 min 時，果膠提取得率達最大值13.79%。當超聲時間＜70 min 時，隨時間增加，果膠逐漸從物料組織中溶出并擴散，轉(zhuǎn)變成水溶性果膠，提取得率增加[35]；而超聲時間過長（＞70 min）會使果膠部分結構被破壞，發(fā)生降解、脫脂等，且雜質(zhì)溶出率增加，導致果膠提取得率下降[36]。

圖4 超聲時間對PFP 果膠提取得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on pectin extraction ratio of PFP

2.2.4 超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響 如圖5，PFP 果膠提取得率隨超聲功率增強呈先上升后下降趨勢，當超聲功率為210 W 時，提取得率達最大值14.56%。當超聲功率＜210 W 時，超聲波“空化作用”加速了超聲波對物料組織的破壞，促使果膠大分子逐漸溶出，提取得率增加[17]；當超聲功率＞210 W 時，果膠降解率隨著大功率超聲波作用增大而增大，溶質(zhì)留在超聲場中作用時間縮短，無法充分破壁，且其他雜質(zhì)也會溶出，導致果膠提取得率下降[37]。

圖5 超聲功率對PFP 果膠提取得率的影響Fig.5 Influence of ultrasonic power on pectin extraction ratio of PFP

2.2.5 超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響 如圖6，PFP 果膠提取得率隨超聲溫度升高呈先上升后下降趨勢，當超聲溫度為50 ℃時，提取得率達最大值14.82%。當超聲溫度＜50 ℃時，隨著溫度升高會產(chǎn)生更高的傳質(zhì)速率和溶劑擴散速率，從而提高提取得率[38]；當超聲溫度＞50 ℃時，溫度過高會對果膠分子結構及穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，使部分果膠發(fā)生降解[39]，導致果膠提取得率降低。

圖6 超聲溫度對PFP 果膠提取得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on pectin extraction ratio of PFP

2.3 響應面試驗分析

2.3.1 響應面試驗結果 運用Design Expert 10.0 軟件對響應值和各個因素進行二次多元回歸擬合，所得二次多元回歸方程為：Y=14.63?0.42A+0.03B?0.12C?0.39D+0.73AB+0.03AC+0.2AD?0.65BC?0.08BD+0.43CD?1.2A2?0.91B2?0.8C2?0.61D2，響應面分析試驗設計結果如表2 所示。

表2 Box-Benhnken 試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Benhnken test

2.3.2 回歸模型的方差分析 通過F統(tǒng)計量、響應面二次多項式模型的方差分析（ANOVA）檢驗了回歸模型的顯著性，見表3。失擬項通常用來描述回歸模型的合適程度，考察沒有在回歸范圍內(nèi)被包含的數(shù)據(jù)點。本研究模型失擬項F值為2.93，P值為0.1558（P＞0.05），表明失擬項不顯著，該模型擬合度較好。A、D、AB、A2、B2、C2、D2對PFP 果膠提取量影響極顯著（P＜0.01），一次項B、C 項與交互項AC、AD、BD、CD 均不顯著（P＞0.05）。由各因素P值可以得知各因素對PFP 果膠提取得率影響順序為A＞D＞C＞B，即pH＞超聲溫度＞超聲功率＞超聲時間。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 響應面分析 各因素及其交互作用對果膠提取得率的影響可從響應面的變化得到直觀反映，本試驗所構建模型響應面圖如圖7 所示。PFP 果膠的提取得率隨著各因素水平變化而變化，A 與B 曲線坡度最為陡峭，說明pH 與超聲時間的交互作用最為顯著，其次是B 與C，說明超聲功率與超聲時間的交互作用比其它兩因素較為顯著，結果與方差分析一致。

圖7 各因素之間的交互作用對果膠提取得率的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction between various factors on pectin extraction rate

2.3.4 最佳工藝驗證 通過對PFP 果膠提取得率二次多項式解析，得提取PFP 果膠最佳工藝條件為：pH1.90，超聲時間70.54 min，超聲功率204.09 W，超聲溫度45.78 ℃，此時PFP 果膠理論提取得率為14.76%?？紤]到實際操作可行性，將工藝調(diào)整為：pH2.0，超聲時間70 min，超聲功率210 W，超聲溫度45 ℃，按此工藝條件進行5 組平行驗證試驗，得PFP 果膠提取得率為14.78%±0.21%。

2.4 PFP 果膠的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH·的清除率 DPPH 是一種親脂自由基，溶于醇時會呈紫色，在517 nm 處存在特殊的吸收峰[40]。當果膠樣品存在抗氧化活性時，DPPH·會失去孤對電子，失去孤對電子數(shù)量越多，樣品溶液褪色越明顯，表明樣品抗氧化能力越強，所以此現(xiàn)象常被用來評價抗氧化劑的抗氧化性[41]。本研究以VC為陽性對照，研究PFP 中果膠對DPPH·清除能力。如圖8，PFP 果膠對DPPH·的清除作用在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定劑量依賴效應。在0.5～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH·的清除率保持在91%以上，酸法和超聲波輔助酸法提取的PFP 果膠對DPPH·清除率的變化均呈緩慢上升趨勢，當果膠濃度為3.0 mg/mL 時，對DPPH·清除率分別為46.37%±1.45%和60.96%±1.03%。結果表明PFP 果膠對DPPH·具有良好的清除能力，且超聲波輔助提取后清除能力得到明顯增強。

圖8 PFP 果膠對DPPH·清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging rate of PFP pectin

2.4.2 對·OH 的清除率 ·OH 是一種常見自由基，它從細胞膜、DNA 等方面損害生物體[42]。如圖9，在質(zhì)量濃度0.5～3.0 mg/mL 范圍內(nèi)，VC對·OH 清除率穩(wěn)定保持在90%以上；酸法和超聲波輔助酸法提取的PFP 果膠對·OH 清除能力均隨果膠質(zhì)量濃度增加而逐漸增強，當果膠質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL 時，對·OH 清除率分別為58.37%±1.09%和80.16%±1.78%，且在此質(zhì)量濃度范圍，PFP 果膠對·OH 清除效果差異均顯著（P＜0.05）。超聲波輔助酸法提取的果膠清除·OH 能力作用明顯高于酸法，這與Torkamani 等[19]的研究結果一致。

圖9 PFP 果膠對·OH 清除率Fig.9 Hydroxyl radical scavenging rate of PFP pectin

圖10 PFP 果膠對·清除率Fig.10 Superoxide anion radical scavenging rate of PFP pectin

3 結論

本研究以‘福建百香果2 號’果皮為試驗原料，依據(jù)單因素實驗結果進行響應面優(yōu)化，得出最優(yōu)提取工藝參數(shù)為pH2.0，超聲時間70 min，超聲功率210 W，超聲溫度45 ℃，按此工藝條件進行5 組平行驗證試驗，得PFP 果膠平均提取得率為14.78%±0.21%，與響應面預測值僅差0.02%，說明模型能較好預測果膠提取得率。研究發(fā)現(xiàn)PFP 果膠具有較好的抗氧化活性，且經(jīng)過超聲波處理后PFP 果膠的抗氧化活性明顯提高，尤其是對清除·OH 能力明顯增強。結果表明，利用超聲波輔助酸法能夠提高果膠得率，并且增強了提取果膠的抗氧化活性，為百香果皮果膠的進一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。但超聲波增強果膠抗氧化活性的途徑暫不明確，可能是超聲波通過影響果膠結構、性質(zhì)等途徑，也可能與PFP 果膠的結構、性質(zhì)等有關，之后可進行深入研究。