基于仿生學(xué)技術(shù)不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)評價(jià)

李 姚，孔祥聰，琚興波，侯強(qiáng)川，郭 壯，王玉榮,

（1.湖北文理學(xué)院，湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院，乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽 441053；3.湖北璩家餐飲管理有限公司，湖北襄陽 441000）

漿水是以芹菜或白菜等為主料加少量面粉和大量水自然發(fā)酵而成的，其不僅是中國地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)品酸漿面的特征風(fēng)味來源，亦是陜南和甘肅等地漿水面的主要配料[1]。近年來研究人員針對酸漿水及其微生物開展了多項(xiàng)研究，主要包括微生物多樣性[2]、降膽固醇菌株的篩選[3]、亞硝酸鹽含量分析[4]以及相關(guān)飲料研制[5]等方面，而有關(guān)酸漿水發(fā)酵方式上的研究相對較少。目前，酸漿水的制作以農(nóng)家自制為主，一般采用自然發(fā)酵的方式，發(fā)酵進(jìn)程較難調(diào)控，產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，發(fā)展受限。張曉輝等[6]對采集自山西和甘肅的漿水中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，漿水中存在致腐菌和條件致病菌，說明急需改善加工環(huán)境或篩選適于酸漿水發(fā)酵的菌株來降低潛在風(fēng)險(xiǎn)。王麗萍等[7]探討了面粉添加量、發(fā)酵溫度和保藏方法等工藝因素對漿水品質(zhì)的影響，闡明實(shí)現(xiàn)漿水品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化的重要途徑為選擇特定菌種發(fā)酵。亦有研究人員發(fā)現(xiàn)，純種發(fā)酵更適合發(fā)酵蔬菜類制品的制作[8]。周書楠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌是琚灣酸漿面漿水中的絕對優(yōu)勢細(xì)菌微生物，并推測乳酸菌發(fā)酵對于酸漿水風(fēng)味的形成起著至關(guān)重要的作用。采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，彭飛等[10]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬亦是北方漿水中的優(yōu)勢菌屬。張振東等[11]采用六種純培養(yǎng)方式對酸漿水中乳酸菌進(jìn)行分離，發(fā)酵乳桿菌的株數(shù)占總分離株的48.89%，變性梯度凝膠電泳結(jié)果亦顯示發(fā)酵乳桿菌和德式乳桿菌為酸漿水中的主要乳酸菌。這些研究為篩選酸漿水發(fā)酵菌株提供了指導(dǎo)。

本研究分別采用發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵和加引子發(fā)酵兩種方式制作漿水，并嘗試使用電子舌、電子鼻和色度儀從滋味、風(fēng)味和色澤三個(gè)維度對漿水的感官品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)。電子舌通過人工脂膜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)同時(shí)對漿水中基本味（酸、苦、澀、咸和鮮味）以及回味（澀、苦和鮮味）進(jìn)行測定，具有檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前，在葡萄酒[12]、蜂蜜[13]、蘑菇[14]和奶制品[15]等食品的滋味檢測中應(yīng)用廣泛。電子鼻通過其金屬氧化電極對食品中典型揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，從而對漿水揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行評價(jià)，常用于水果[16]、豬肉[17]、白酒[18]和食用油[19]等食品的檢測。色度儀則直接顯示三刺激值并將其轉(zhuǎn)化為顏色空間標(biāo)度，從而對食品的明亮度、紅藍(lán)度和黃綠度進(jìn)行測定，目前廣泛應(yīng)用于飲用水[20]、番茄醬[21]、牛肉鮮度[22]和鮮切果蔬褐變程度[23]等的檢測。通過比較乳酸菌純種發(fā)酵和加引子發(fā)酵漿水品質(zhì)差異，以期為酸漿水的純種發(fā)酵以及即食型產(chǎn)品的生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸漿水 采集自襄陽市棗陽市琚灣鎮(zhèn)各大面館，主要原料均為芹菜和面粉，經(jīng)24 h 左右自然發(fā)酵而成；純種發(fā)酵用菌株 由傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所提供，即對15 個(gè)酸漿水樣本中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，然后從每個(gè)樣本中挑選一株發(fā)酵乳桿菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，共計(jì)15 株；芹菜 市售；面粉 中糧面業(yè)（海寧）有限公司；葡萄糖 西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS 培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；陽離子溶液、陰離子溶液、內(nèi)部溶液、預(yù)處理溶液、參比溶液 日本Insent 公司。

SA 402B 電子舌（配備5 個(gè)味覺傳感器電極和2 個(gè)參比電極） 日本Insent 公司；PEN3 電子鼻（配備10 個(gè)金屬氧化電極） 德國Airsense 公司；Ultra Scan PRO 色度儀 美國Hunter Lab 公司；CR21N 高速離心機(jī) 日本日立公司；PHS-3C 臺(tái)式酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-70 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 從湖北省襄陽市棗陽市琚灣鎮(zhèn)的不同面館采集15 份自然發(fā)酵酸漿面漿水樣品，裝入無菌采樣瓶后密封置于含有冰盒的采樣箱中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室迅速完成乳酸菌的分離純化。

1.2.2 酸漿水樣品制作 原料前處理：取純凈水煮沸后按0.5%（w/v）比例添加面粉制備面粉漿液，煮沸放涼按1%比例加入漂燙過的芹菜，攪拌均勻制成漿湯后分裝至小發(fā)酵罐中，每罐500 mL 備用。

漿水制備：將前期分離至酸漿面漿水的15 株發(fā)酵乳桿菌接入MRS 培養(yǎng)基中活化（37 ℃靜置培養(yǎng)24 h）兩代后10000 r/min 離心10 min，沉淀即為菌體，取菌體接入含1%葡萄糖的100 mL 面粉漿液中30 ℃靜置培養(yǎng)24 h 制成菌液。將菌液按5%（v/v）的比例接入分裝好的漿湯中，30 ℃發(fā)酵24 h，制備純種發(fā)酵漿水，編號(hào)分別為T1～T15。以采集的15 份自然發(fā)酵酸漿為引子，按照5%（v/v）的比例加入到制備好的漿湯，30 ℃發(fā)酵24 h，制備引子發(fā)酵酸漿，編號(hào)依次為Z1～Z15。制備T1 的發(fā)酵乳桿菌分離至制備Z1 的引子，制備T2 的菌株來源于發(fā)酵Z2 的引子，依次類推。

1.2.3 不同發(fā)酵方式漿水滋味特征分析 準(zhǔn)確量取50 mL 發(fā)酵后的漿水樣品和100 mL 純凈水混合均勻，靜置30 min 后進(jìn)行抽濾，取濾液參考王丹丹等[24]的測試方法使用電子舌進(jìn)行參數(shù)測試。為減少系統(tǒng)誤差，每次測定時(shí)均設(shè)置Z1 號(hào)樣品作為對照樣本，數(shù)據(jù)分析時(shí)待測樣品與對照樣本的差值即為待測樣品各滋味品質(zhì)的相對強(qiáng)度值。

1.2.4 不同發(fā)酵方式漿水揮發(fā)性風(fēng)味測定 準(zhǔn)確吸取15 mL 發(fā)酵好的漿水于電子鼻樣品瓶中，水浴鍋中50 ℃保溫30 min，室溫平衡10 min 后插入電子鼻探頭進(jìn)行進(jìn)樣，參考張松等[25]的測試方法進(jìn)行參數(shù)測試。每個(gè)樣品測試90 s，由于傳感器的響應(yīng)值在70 s 后達(dá)到穩(wěn)定，選取85、86 和87 s 時(shí)的響應(yīng)值作為本研究的測試結(jié)果。

1.2.5 不同發(fā)酵方式漿水色澤分析 本研究參考郭壯等[26]的研究對不同發(fā)酵方式漿水的色澤進(jìn)行評價(jià)。將漿水裝入50 mm×50 mm 的專用比色皿中，采用色度儀對其色澤品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)，測試模式選擇透視測試，讀數(shù)以CIE1976 色度空間值L*（暗→亮：0→100），a*（綠-→紅+），b*（藍(lán)-→黃+）表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic，UPGMA）和多元方差分析法（multivariate analysis of vari-ance，MANOVA）對不同發(fā)酵方式漿水的整體品質(zhì)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)、Mann-Whiney 檢驗(yàn)和冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對不同發(fā)酵方式漿水品質(zhì)差異的關(guān)鍵性指標(biāo)進(jìn)行甄別。采用Cannoco 4.5 軟件、MATLAB 2016b 軟件和Origin 2017 完成數(shù)據(jù)分析和可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式漿水品質(zhì)分析

琚灣酸漿面風(fēng)味特征為酸、香、辣，是湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)和中國地理標(biāo)識(shí)產(chǎn)品[27]，其酸味及主體香味主要來源于酸漿水，因此，酸漿水口感、風(fēng)味等發(fā)酵特征對成品酸漿面品質(zhì)有著重要的影響。本研究首先使用電子舌對15 份發(fā)酵乳桿菌單菌發(fā)酵酸漿水及15 份老鹵水引子發(fā)酵酸漿水的滋味特征進(jìn)行了測定，兩類樣本的8 個(gè)滋味指標(biāo)測定結(jié)果見圖1。

圖1 不同發(fā)酵方式酸漿水各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度箱型圖Fig.1 Box diagram of relative intensity of each taste index of Suanjiangshui with different fermentation methods

由圖1 可知，不同發(fā)酵方式制作的漿水酸、苦、澀、咸和鮮味之間均具有較大的差異，其中，澀味的差異性最大，酸味次之；后味A（澀的回味）、后味B（苦的回味）和豐度（鮮的回味）之間的差異性較小。發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵的漿水鮮味相對強(qiáng)度明顯高于用引子發(fā)酵，而酸味和澀味正好相反。漿水經(jīng)過多輪次發(fā)酵，其中的微生物相較凍存過的純種菌株能更快適應(yīng)漿湯環(huán)境，發(fā)酵產(chǎn)酸更快；此外，不同農(nóng)戶自制老鹵水發(fā)酵輪次多且不盡相同也使得其中乳酸等有機(jī)酸不斷積累，這也可能是導(dǎo)致用其發(fā)酵漿水酸度較單菌發(fā)酵漿水強(qiáng)度大且組內(nèi)差異亦較后者明顯的原因。值得注意的是不同發(fā)酵乳桿菌接菌發(fā)酵漿水澀味差異較大，表明這些菌株雖然都分離至自然發(fā)酵漿水但并不都適宜單獨(dú)發(fā)酵酸漿水。

本研究進(jìn)一步使用電子鼻對不同發(fā)酵方式漿水的揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

由表1 可知，發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵制作的漿水在三個(gè)對芳香類風(fēng)味靈敏的傳感器（W1C、W3C 和W5C）上的響應(yīng)強(qiáng)度顯著高于加引子發(fā)酵漿水（P＜0.05），而在對有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)（W1W）以及烷烴靈敏的傳感器（W3S）上的響應(yīng)值呈現(xiàn)相反的趨勢（P＜0.05）。由此可見，總體上發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵制備的漿水揮發(fā)性風(fēng)味要明顯優(yōu)于用引子發(fā)酵的漿水，這與前期研究發(fā)現(xiàn)的發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵的酸漿水芳香類風(fēng)味物質(zhì)的含量高于植物乳桿菌與德氏乳桿菌發(fā)酵漿水的結(jié)論相似[28]。此外，望詩琪等[29]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從琚灣酸漿面漿水中檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有159 種，并推測較高含量3-丁炔-1-丁醇的檢出可能來源于漿水的盛裝容器。因此，引子發(fā)酵漿水不良風(fēng)味相對強(qiáng)度較單一菌株發(fā)酵漿水高可能是因?yàn)橐又形⑸锓N類復(fù)雜，開放發(fā)酵易滋生污染菌。此外，部分引子原是盛于塑料容器中發(fā)酵，長時(shí)間循環(huán)使用亦可能摻入雜味。

表1 不同發(fā)酵方式酸漿水風(fēng)味特性及差異Table 1 Flavor characteristics and differences of Suanjiangshui by different fermentation methods

為更準(zhǔn)確顯示接菌及加引子發(fā)酵酸漿水的色澤特征和差異，本研究使用色度儀對的色澤特征進(jìn)行了測定，分析結(jié)果見表2。

表2 不同發(fā)酵方式酸漿水各色度指標(biāo)的差異性分析Table 2 Analysis on the difference of chromaticity indexes of Suanjiangshui with different fermentation methods

好的漿水呈淡乳白色，略帶綠色，色澤均勻不分層，表面無白膜。經(jīng)檢測，本研究采用引子發(fā)酵和接菌發(fā)酵制作的漿水色澤均較為明亮，整體偏綠偏藍(lán)，符合酸漿水發(fā)酵特征。經(jīng)對比，發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵制備的酸漿水其明亮度顯著高于加引子發(fā)酵（P＜0.05），a*值則呈現(xiàn)出相反的趨勢（P＜0.05）。由此可見，較之加引子發(fā)酵，乳酸菌純種發(fā)酵的酸漿水顏色偏亮偏綠，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)二者色差值（△E*）為3.05，因而不同發(fā)酵方式對酸漿水色澤有明顯的影響。不同發(fā)酵方式酸漿水色差明顯可能與其酸度及發(fā)酵程度有關(guān)，電子舌檢測結(jié)果顯示，加引子發(fā)酵酸漿水酸度高于加發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵，說明引子發(fā)酵酸漿水發(fā)酵程度更高，pH 降低及微生物活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致芹菜葉綠素?fù)p失率增加[30]。

2.2 不同發(fā)酵方式制備酸漿水整體品質(zhì)差異性分析

本研究使用PCA、MANOVA 和UPGMA，以電子舌和電子鼻測試指標(biāo)為對象，進(jìn)一步探究了不同發(fā)酵方式酸漿水整體感官品質(zhì)差異。由PCA 發(fā)現(xiàn)，總方差87.92%的貢獻(xiàn)率來自于前6 個(gè)主成分（principal component，PC），其方差貢獻(xiàn)率依次為32.89%、20.14%、13.65%、9.82%、6.40%和5.01%。由此可知，6 個(gè)主成分可以代表原始數(shù)據(jù)18 個(gè)變量的絕大部分信息?；赑C1 和PC2 不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)的因子載荷圖如圖2 所示。

由圖2 可知，影響接菌和引子發(fā)酵漿水整體品質(zhì)的關(guān)鍵感官指標(biāo)為澀味、酸味、W5S、W2W、W1W和W1C。澀味在PC1 中的系數(shù)為0.49，PC2 中載荷最高的正影響指標(biāo)為酸味，其載荷量為0.40，而在PC2 中載荷最高的負(fù)影響指標(biāo)為W1C（對芳香類物質(zhì)靈敏），其載荷量為0.26。即PC1 的主要差異集中在澀味，而PC2 的主要差異則集中在酸味和W1C?；赑C1 和PC2 不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)的因子得分圖見圖3。

圖2 不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)的因子載荷圖Fig.2 Factor load diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

圖3 不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)的因子得分圖Fig.3 Factor score diagram of Suanjiangshui quality with different fermentation methods

由圖3 可知，基于感官特征接菌發(fā)酵與加引子發(fā)酵漿水樣品具有明顯的分離趨勢，引子發(fā)酵酸漿水樣本主要集中在X 軸正軸方向，發(fā)酵乳桿菌接菌發(fā)酵樣品大多分布在第二、三象限，部分樣品在橫縱坐標(biāo)上均較為分散。此外，引子發(fā)酵酸漿水Z12 與接菌發(fā)酵樣本較為接近，而接菌發(fā)酵酸漿水T1、T7、T9 和T11 與引子發(fā)酵樣品聚在一起，究其原因，引子來源于不同家庭手工制作酸漿水其微生物組成及品質(zhì)不完全相同，因此15 個(gè)樣本并未完全重疊，而15 株發(fā)酵乳桿菌來源于對應(yīng)的15 個(gè)引子，引子和菌株發(fā)酵酸漿水部分樣本品質(zhì)會(huì)較為相近。引子發(fā)酵與接菌發(fā)酵對應(yīng)編號(hào)樣本間亦存在差異。結(jié)合因子載荷圖，與接菌發(fā)酵漿水相比，引子發(fā)酵酸漿酸澀味較濃但芳香味卻不及前者。整體上，乳酸菌純種發(fā)酵的酸漿水在滋味和風(fēng)味品質(zhì)上要優(yōu)于引子發(fā)酵。將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，采用UPGMA 對PCA 結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。其結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可知，當(dāng)平均距離為3.0 時(shí)，酸漿水樣品可分為3 個(gè)聚類。聚類Ⅰ共計(jì)18 個(gè)酸漿水樣品，其中，引子發(fā)酵樣品14 個(gè)，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵樣品4 個(gè)；聚類Ⅱ共計(jì)10 個(gè)酸漿水樣品，其中，乳酸菌發(fā)酵的樣品有9 個(gè)，僅1 個(gè)樣品為引子發(fā)酵；而聚類Ⅲ中2 個(gè)樣品，均為發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵漿水。由此可見，UPGMA 聚類分析的結(jié)果與PCA 基本一致，即乳酸菌純種發(fā)酵與引子發(fā)酵的酸漿水樣品在滋味和風(fēng)味品質(zhì)上存在明顯差異。

圖4 基于UPGMA 的不同發(fā)酵方式酸漿水滋味和風(fēng)味品質(zhì)評價(jià)Fig.4 Evaluation of the taste and flavor quality of Suanjiangshui by different fermentation methods based on UPGMA

2.3 不同發(fā)酵方式酸漿水品質(zhì)與各感官指標(biāo)間關(guān)系

本研究通過PCA 和UPGMA 聚類分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了不同發(fā)酵方式會(huì)對酸漿水的滋味和風(fēng)味品質(zhì)造成明顯的影響。通過t檢驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵方式的部分滋味和風(fēng)味指標(biāo)存在差異顯著（P＜0.05）。為進(jìn)一步探究導(dǎo)致酸漿水品質(zhì)整體結(jié)構(gòu)的不同的感官指標(biāo)，本研究采用RDA 這一有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對導(dǎo)致上述差異的指標(biāo)進(jìn)行解析，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 冗余分析雙序圖Fig.5 Biplot of redundancy analysis

由圖5 可知，W3S、W2W、W5S、W1W、W1C、W5C、W3C 和鮮味與RDA 排序約束軸上的酸漿水樣品具有良好的賦值相關(guān)，即上述8 個(gè)指標(biāo)代表了不同發(fā)酵方式制作酸漿水品質(zhì)總體結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)。W3S、W2W、W5S 和W1W 位于引子發(fā)酵一側(cè)，說明這4 個(gè)指標(biāo)在加引子發(fā)酵的酸漿水中強(qiáng)度高于乳酸菌純種發(fā)酵；而鮮味、W1C、W3C 和W5C 則呈現(xiàn)出相反的趨勢。結(jié)合2.1 中結(jié)果可知，W3S、W1C、鮮味、W3C 和W5C 在兩者中存在顯著性差異（P＜0.05），而W2W 和W5S 差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵制作的酸漿水中芳香類物質(zhì)含量較高、烷烴類物質(zhì)含量較低是導(dǎo)致其與加引子發(fā)酵方式制作的酸漿水品質(zhì)差異的主要原因。

3 結(jié)論

使用電子舌、電子鼻和色度儀并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法解析不同發(fā)酵方式的酸漿水品質(zhì)，結(jié)果顯示15 株發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵的酸漿水鮮味、芳香類風(fēng)味和明亮度等指標(biāo)均顯著高于加引子發(fā)酵酸漿水（P＜0.05），而酸味、澀味、有機(jī)硫化物等指標(biāo)強(qiáng)度呈現(xiàn)相反趨勢（P＜0.05）。整體上以發(fā)酵乳桿菌純種發(fā)酵制作的酸漿水品質(zhì)更優(yōu)。同時(shí)考慮到乳酸菌接菌發(fā)酵漿水品質(zhì)可控性更強(qiáng)、成品安全性較高的特點(diǎn)，后期可進(jìn)一步對菌株生長特性進(jìn)行研究，嘗試篩選互補(bǔ)菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵。