四種黏附連接功能群在睪丸中的作用回顧

沈建云，李永倩，李嬌嬌，聶海濤，陳德宇

（阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

1 四種黏附連接功能群

在睪丸中，依據(jù)不同連接形態(tài)和功能，主要存在三種不同的細(xì)胞連接類型：緊密連接、錨定連接及間隙連接。其中，錨定連接又主要有四種不同連接方式,分別為：黏附連接、粘著斑、橋粒連接和半橋粒連接。這四種細(xì)胞連接的具體附著點分別為：黏附連接主要是基于細(xì)胞-細(xì)胞肌動蛋白的連接，粘著斑主要是基于細(xì)胞-基質(zhì)肌動蛋白的連接，橋粒連接主要是基于細(xì)胞-細(xì)胞中間絲的連接，半橋粒連接主要是基于細(xì)胞-基質(zhì)中間絲的連接。黏附連接和粘著斑的附著位點是肌動蛋白絲，橋粒連接和半橋粒連接的附著位點是中間絲。

盡管以上4種錨定連接類型彼此不同，但是都有一個主要功能，即通過細(xì)胞或細(xì)胞骨架與其他細(xì)胞或胞外基質(zhì)連接形成一個網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，以保持組織的完整性。黏附連接作為錨定連接中重要的連接類型之一，是一種基于鈣粘蛋白及肌動蛋白絲的胞間連接。它對細(xì)胞間的黏附和分選、組織形態(tài)發(fā)生和完整性非常重要。在睪丸中已經(jīng)確定了四種基于肌動蛋白的細(xì)胞黏附連接功能群，它們分別為：鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白（Cadherin-Catenin）、Nectin-Afadin-Ponsin（又稱NAP）、整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白(Integrin-Laminin)和Vezatin-Myosin細(xì)胞黏附群[1]，見圖1。

圖1 四種多蛋白復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the molecular structure of four polyprotein complexes

這四種多蛋白復(fù)合物分別為：鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白（Cadherin-Catenin）、Nectin-Afadin-Ponsin、整合蛋白-層粘連蛋白(Integrin-Laminin)、Vezatin-MyosinVII，同時顯示了能調(diào)節(jié)支持及生殖細(xì)胞動力學(xué)的信號蛋白。

2 鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白

2.1 鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白結(jié)構(gòu)

鈣粘蛋白是一種蛋白分子量為115-140 kDa的跨膜蛋白，屬鈣依賴性細(xì)胞黏附分子家族。大多數(shù)鈣粘蛋白是由以下多個結(jié)構(gòu)域組成的糖蛋白：兩個胞質(zhì)域、一個跨膜域及五個鈣結(jié)合域（又稱為EC1-5）。研究發(fā)現(xiàn)在EC1結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在細(xì)胞黏附識別序列即His-Ala-Val[2]。睪丸中多種類型細(xì)胞的黏附連接都會受到His-Ala-Val合成肽或此肽抗體的影響，因此該序列在黏附連接功能的發(fā)揮中起著重要作用。

鈣粘蛋白在其胞質(zhì)區(qū)與連環(huán)蛋白p120ctn和β-連環(huán)蛋白結(jié)合，而β-連環(huán)蛋白又與α-連環(huán)蛋白結(jié)合，從而形成鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物。γ-連環(huán)蛋白也能夠結(jié)合鈣粘蛋白的C端并與α-連環(huán)蛋白相互作用。

2.2 鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白功能

一般基于鈣粘蛋白的黏附連接是通過鈣的依賴性胞外域形成同型跨細(xì)胞相互作用，而在細(xì)胞內(nèi)，連環(huán)蛋白介導(dǎo)鈣粘蛋白的鈣依賴性功能。

在睪丸中，至少有二十多種鈣粘蛋白，且這些蛋白有不同的表達(dá)模式。例如，多數(shù)N-鈣粘蛋白僅存在生精上皮的基底部分，N-鈣粘蛋白以階段特異性的方式與精子細(xì)胞頭部相關(guān)聯(lián)，表明它參與生精細(xì)胞的運(yùn)動。在體外培養(yǎng)的生精細(xì)胞中加入一種抗N-鈣粘蛋白抗體之后，其對支持細(xì)胞的黏附力增強(qiáng)。E-鈣粘蛋白是上皮組織中主要鈣粘蛋白亞型，參與細(xì)胞間接觸抑制、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、肌動蛋白細(xì)胞骨架的重塑和細(xì)胞極性建立等[3-4]。E-鈣粘蛋白還可以介導(dǎo)橋粒連接、緊密連接和間隙連接的組裝。

有研究表明，E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白之間的初始相互作用是引發(fā)細(xì)胞黏附級聯(lián)反應(yīng)所必需的[5]。鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物在外力的作用下能與F-肌動蛋白形成化學(xué)鍵，并且隨著力的增加，二者的結(jié)合狀態(tài)由弱迅速變?yōu)閺?qiáng)[6]。說明鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物與F-肌動蛋白的結(jié)合受到力的影響。有研究顯示，鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物是通過α-連環(huán)蛋白介導(dǎo)，從而直接地與肌動蛋白細(xì)胞骨架連接[7]，說明該連環(huán)蛋白特異性地募集并參與了黏附連接。有研究發(fā)現(xiàn)了一個反饋環(huán)路，通過該環(huán)路，收縮力刺激黏附連接肌動蛋白的聚合，增加E-鈣粘蛋白的募集，從而增強(qiáng)兩個連接點及其與肌動蛋白的連接[8]。此外，β-連環(huán)蛋白還能夠與埃滋蛋白（Ezrin）共定位。埃滋蛋白是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白[9]。在人體內(nèi)埃茲蛋白與精子獲能相關(guān)[10]。

p120ctn除了誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白的聚集外，它在酪氨酸和絲氨酸殘基上磷酸化位點的磷酸化狀態(tài)變化還會影響細(xì)胞黏附性。通常磷酸化減少使得細(xì)胞黏附更緊密，而磷酸化的增加則導(dǎo)致黏附性喪失。說明E-鈣粘蛋白和p120ctn之間的相互作用對于形成穩(wěn)定的黏附連接是必需的。

GTP酶可能是鈣粘蛋白和連環(huán)蛋白調(diào)控機(jī)制的一個至關(guān)重要因子。例如，通過p120ctn對Rho GTP酶的作用，發(fā)現(xiàn)p120ctn的過表達(dá)會增加細(xì)胞的運(yùn)動能力。

研究已經(jīng)顯示其他蛋白質(zhì)包括調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合并直接結(jié)合紐蛋白的VASP蛋白及哺乳動物中的可直接與β-連環(huán)蛋白結(jié)合的Lin-7蛋白都定位于黏附連接處。Rho家族的幾個成員如RhoA，Rac1和Cdc42也都定位于基于鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白的細(xì)胞黏附群上[11-12]。

3 Nectin-Afadin-Ponsin

3.1 Nectin-Afadin-Ponsin結(jié)構(gòu)

這一蛋白群是由Nectin、Afadin和Ponsin蛋白(也稱為NAP細(xì)胞黏附群)組成（圖1）。NAP細(xì)胞黏附群的組裝，一部分是由每個粘連蛋白家族成員介導(dǎo)的，這些粘連蛋白家族成員與對應(yīng)細(xì)胞膜上的另一個粘連蛋白分子同型或異型交互。研究顯示，Nectin-3的異型相互作用效果顯示出比其同型相互作用更強(qiáng)[13]，例如，Nectin-3與Nectin-1的交互。

3.2 Nectin-Afadin-Ponsin功能

在睪丸中，NAP細(xì)胞黏附群與鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)，并且這兩個單元協(xié)同作用形成功能性黏附連接。

Nectin由三個域組成：單次跨膜域、與Afadin絲狀肌動蛋白結(jié)合的胞漿域及三個免疫球蛋白樣胞外域[14]。Nectin及類Nectin分子即Necls是免疫球蛋白超家族中不依賴鈣的細(xì)胞黏附蛋白。已經(jīng)鑒定4種Nectin蛋白即Nectin 1-4以及5種Necls即Necls1-5。Nectins和Necls的最大區(qū)別是與Afadin的結(jié)合能力，前者可以與Afadin結(jié)合，Nectins在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域與肌動蛋白結(jié)合蛋白AF6/Afadin結(jié)合，而后者不與Afadin結(jié)合[15-16]。有研究顯示，Nectin-1，-3及Necl-5與整聯(lián)蛋白αvβ3相關(guān)聯(lián)[17-18]，而激活的整聯(lián)蛋白αvβ3對于由Nectin介導(dǎo)的錨定連接組裝來說是必不可少的。由此說明，Nectin及Necl與特定的錨定連接相關(guān)。研究已顯示它們在細(xì)胞黏附、極化、增殖、發(fā)育等各種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[19]。研究證實，Nectin-1，-2，-3，-4在睪丸中都有表達(dá)，在支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有Nectin-2的表達(dá)，而Nectin-3僅表達(dá)于精子細(xì)胞中。在小鼠睪丸中，Nectin-2δ與F-肌動蛋白共定位于伸長的精子細(xì)胞中，這與它在頂端外質(zhì)特化位點中的定位一致，表明它在精子發(fā)生過程中對生精細(xì)胞的運(yùn)動有一定的作用。更重要的是，敲除Nectin-2及Nectin-3的小鼠出現(xiàn)不同程度的不育現(xiàn)象[20]。表明NAP細(xì)胞黏附單元可能是通過基于Nectin的異型相互作用，從而誘導(dǎo)生精上皮中細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)精子發(fā)生的完成。

Necl-2，-4，-5在睪丸中表達(dá)，尚不清楚Necl-1或Necl-3在睪丸中是否表達(dá)。其中，Necl-2在不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，Necl-5在生精上皮中以手指狀分布。在Sertoli細(xì)胞內(nèi)，它與α-微管蛋白共定位，生精細(xì)胞中的Necl-2與支持細(xì)胞中的Necl-5結(jié)合[21]。Necl-2和Necl-5的這種嗜異性相互作用可能介導(dǎo)支持細(xì)胞和頂端外質(zhì)特化和/或支持細(xì)胞與基底位于生精上皮的早期生精細(xì)胞之間的伸長精子細(xì)胞之間的黏附。Necl-2還參與精子細(xì)胞分化過程。Necl-4在生精上皮中表現(xiàn)為從基底區(qū)到頂端區(qū)的手指狀過程，并與4.1G蛋白共定位。其中，4.1G蛋白的敲除導(dǎo)致膜上Necl-4的消失并導(dǎo)致男性不育[22]，這表明4.1G蛋白和Necl-4的相互作用對于睪丸中細(xì)胞黏附是非常關(guān)鍵的。

Afadin是一種包含肌動蛋白結(jié)合域和RAS結(jié)合域的支架蛋白，它在黏附連接處與Nectin、Ponsin形成復(fù)合物。Afadin具有兩種剪接變異體：l-Afadin和s-Afadin。l-Afadin是一種包含兩個Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域、PDZ結(jié)構(gòu)域和三個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域的F-肌動蛋白結(jié)合蛋白[23]，其PDZ結(jié)構(gòu)域與Nectin的胞質(zhì)域結(jié)合。然而s-Afadin則缺乏F-肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但其也與Nectins結(jié)合。有研究發(fā)現(xiàn)，s-Afadin比l-Afadin更優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞粘附分子Nectins[24]。Ensemble數(shù)據(jù)庫顯示，在人及小鼠中分別發(fā)現(xiàn)了7種和5種不同形式的l-Afadin和s-Afadin主要剪接變體[25]。由于NAP細(xì)胞黏附群需要α-連環(huán)蛋白定位到黏附連接上，而α-連環(huán)蛋白顯示含有完整的l-Afadin結(jié)合位點，說明在鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白和NAP細(xì)胞黏附群之間存在交叉作用。研究表明，l-Afadin的F-肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域是增強(qiáng)緊密連接和黏附連接的形成所必需的[26]。有研究顯示，Afadin是形成細(xì)胞間接觸過程中的鈣粘蛋白動力學(xué)所必需的[27]。但是目前鮮有關(guān)于睪丸中Afadin功能的報道。

Ponsin是NAP細(xì)胞黏附群的第三個成員，是一類睪丸中的接頭蛋白。其N端由一個SOHO結(jié)構(gòu)域，C端存在3個串聯(lián)的SH3結(jié)構(gòu)域，與l-Afadin或紐蛋白相互作用形成復(fù)合物。Ponsin作為一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，它與α-連環(huán)蛋白結(jié)合并被募集到黏附連接處[28-29]。它的募集可以增加與黏附連接相關(guān)的肌動蛋白絲數(shù)量，從而增強(qiáng)黏附連接的結(jié)構(gòu)和功能[30]。Ponsin和α-連環(huán)蛋白是機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)以及參與基于鈣粘蛋白連接處將復(fù)合物錨定到肌動蛋白的關(guān)鍵分子，且紐蛋白也在細(xì)胞-基底連接處起作用[31]。以上表明，Ponsin參與鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白和NAP細(xì)胞黏附群的連接。

4 整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白

4.1 整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白結(jié)構(gòu)

整聯(lián)蛋白是一類將細(xì)胞骨架與細(xì)胞外基質(zhì)連接起來的跨膜蛋白。層粘連蛋白是一種由α，β和γ鏈組成的糖蛋白，主要參與細(xì)胞黏附、生長、分化和遷移等。

4.2 整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白功能

整聯(lián)蛋白與鈣粘蛋白和選擇蛋白的相互作用已被認(rèn)為是整聯(lián)蛋白參與細(xì)胞間黏附所必需的[32]。層粘連蛋白通常作為整聯(lián)蛋白的配體，主要在細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)界面誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)[33]。

4.3 整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白主要成員及其作用方式

層粘連蛋白是基底膜中主要的細(xì)胞粘附蛋白，由α，β和γ鏈組成。在人體中有5條α鏈，4條β鏈及6條γ鏈，它們可產(chǎn)生10多種組合[34-35]?；ぶ械膶诱尺B蛋白α2可介導(dǎo)支持細(xì)胞中F-肌動蛋白的組裝，維持著血-睪屏障的完整性[36]。層粘連蛋白α2的缺乏會導(dǎo)致雄性小鼠不育[37]。

在成年大鼠睪丸中位于支持細(xì)胞/精子細(xì)胞連接處發(fā)現(xiàn)的α6β1整聯(lián)蛋白的結(jié)合伴侶為含γ3鏈層粘連蛋白[38]。有研究顯示，由于缺乏一種保守的谷氨酸殘基，含有γ3鏈同種型的層粘連蛋白不直接與整聯(lián)蛋白結(jié)合[39]。另外，在成年大鼠睪丸頂端外質(zhì)特化中，含α3鏈層粘連蛋白及β3鏈層粘連蛋白也可以與α6β1整聯(lián)蛋白相互作用。并且含α3，β3和γ3鏈層粘連蛋白僅限于正在伸長或已經(jīng)伸長的精子細(xì)胞中存在[40]。有研究表明，睪丸中的支持細(xì)胞-生殖細(xì)胞黏附連接動力學(xué)至少部分是由整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白復(fù)合物利用一些蛋白激酶（如PI3K、PKB、PAK-2）作為調(diào)節(jié)蛋白并通過ERK信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)的[41]。

5 Vezatin-Myosin VII

5.1 Vezatin-Myosin VII結(jié)構(gòu)

Vezatin是一種新型跨膜蛋白，在其長胞內(nèi)域處與MyosinVIIa結(jié)合。MyosinVIIa是一種以肌動蛋白為細(xì)胞骨架的運(yùn)動蛋白。其在結(jié)構(gòu)上除了與Vezatin相關(guān)，還與蛋白激酶A相關(guān)。

5.2 Vezatin-Myosin VII功能

Vezatin可將MyosinVIIa或鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物與肌動蛋白細(xì)胞骨架橋接。

5.3 Vezatin-Myosin VII主要成員及其作用方式

Vezatin與α-和β-連環(huán)蛋白免疫共沉淀，它可能通過與α-連環(huán)蛋白的羧基末端區(qū)域間接連接介導(dǎo)MyosinVIIa募集至黏附連接處。研究證實Vezatin僅在小鼠睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá)，在支持細(xì)胞外質(zhì)中不表達(dá)。而在單倍體生殖細(xì)胞中，Vezatin僅存在于頂體中，在成熟的精子細(xì)胞中，Vezatin似乎既在頂體又在頂體外頂膜中[42]。

Myosin VIIa是一種250 kDa的蛋白，主要存在于各種器官如腦、腸、肝、腎和睪丸中，是一類在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)姆肿?。在睪丸中，Myosin VIIa與支持細(xì)胞-生殖細(xì)胞外質(zhì)特化相關(guān)[43]，呈現(xiàn)高度表達(dá)狀態(tài)。由于Myosin VIIa在調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)中的固有特性，所以該蛋白可能參與了在外質(zhì)特化部位肌動蛋白絲的更新。另外，Myosin VIIa在維持外質(zhì)特化的細(xì)胞完整性和支持細(xì)胞功能方面起著重要作用。研究顯示，敲除大鼠睪丸支持細(xì)胞中的Myosin VIIa會導(dǎo)致生精組織肌動蛋白細(xì)胞骨架的紊亂[44]。在Myosin VIIa缺陷的馬尾附睪中注意到圓形/伸長的精子細(xì)胞的過早釋放和精子中的許多缺陷，這提示在大鼠精子發(fā)生過程中細(xì)胞粘附和精子運(yùn)輸方面存在嚴(yán)重問題。Myosin VIIa的激活刺激Ponsin募集到細(xì)胞-細(xì)胞連接處并使得內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附區(qū)增厚[45-48]。Myosin VIIa誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附和遷移由整聯(lián)蛋白αvβ5介導(dǎo)?？傊?，Myosin VIIa與整聯(lián)蛋白β5亞基相互作用并以整聯(lián)蛋白依賴性方式調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和運(yùn)動[49]。

6 總結(jié)及展望

男性生殖健康一直是社會關(guān)注的熱點，而男性避孕藥的開發(fā)也是研究睪丸生理結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制的一個具體應(yīng)用。主要對睪丸錨定連接中黏附連接相關(guān)蛋白進(jìn)行回顧，在基于肌動蛋白的細(xì)胞黏附連接功能群中，鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合物的研究一直比較多，與其相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能也漸清晰。而NAP復(fù)合物則在最近些年受到更多關(guān)注，Afadin蛋白在睪丸中的作用仍值得關(guān)注，Ponsin蛋白在睪丸中作用的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。整聯(lián)蛋白-層粘連蛋白復(fù)合物相關(guān)蛋白在其他組織中研究較多，在精子生成過程中扮演的角色研究仍待加強(qiáng)。Vezatin-Myosin VII復(fù)合物中的相關(guān)蛋白不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附連接還與外質(zhì)特化相關(guān)[43]。多數(shù)與黏附連接相關(guān)的蛋白質(zhì)研究是在體外其他上皮、組織或器官中進(jìn)行的，而調(diào)控黏附連接與生殖細(xì)胞運(yùn)動有關(guān)的蛋白質(zhì)研究則相對滯后。近些年對黏附連接功能群相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)和作用等有了一些新的認(rèn)識，如敲低睪丸Myosin VIIA蛋白，會誘導(dǎo)跨生精上皮的肌動蛋白和基于微管的細(xì)胞骨架的解體[44]，但是其機(jī)制方面仍值得不斷探索。