茵芋花粉生活力測定及其貯藏方法優(yōu)化

阮淑明

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 林學(xué)系，福建 南平 353000）

茵芋（Skimmia reevesiana Fortune）屬于蕓香科（Rutaceae）茵芋屬（Skimmia Thunb），常綠灌木，又名黃山桂，原產(chǎn)于我國長江中下游地區(qū)，在華南、云貴地區(qū)亦有野生種類分布[1-2]，據(jù)報道：茵芋屬的名稱是由日本語sikimi音譯過來的[3]?；▎涡裕咨玔4]，是觀葉、觀花、觀果俱佳的優(yōu)良花木。茵芋系芳香植物，花可提取芳香油，種子可榨油，是一種較好的輔助蜜粉源植物[5-6]，茵芋正成為重要的園林綠化植物，常作林緣種植，也可作盆景。

花粉生活力是指花粉具有存活、生長、萌發(fā)或發(fā)育的能力[7]?；ǚ凵盍Φ臏y定是檢測花粉質(zhì)量的重要手段，可用來對花粉貯藏效果進行鑒定，完善、改進花粉貯藏方法，研究花粉保存機理等，對于雜交育種有非常重要的意義[8]。

茵芋為雌雄異株，雌雄花期經(jīng)常不一致，因此花粉活力測定可能決定育種的成敗，可為茵芋推廣種植時授粉時間的遴選及生產(chǎn)中制定花期噴硼的促果技術(shù)等提供依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為福建省洋口國有林場提供的茵芋植株，采集正開放的花，由于茵芋花小，故直接取出花藥，進行花粉生活力測定，IBE 2000型倒置生物熒光顯示鏡下觀察并拍照。

1.2 花粉活力測定試驗

1.2.1 離體萌發(fā)試驗

花粉生活力狀況的主要衡量標(biāo)準(zhǔn)是其萌發(fā)率的高低[8]，離體萌發(fā)試驗是用體積分?jǐn)?shù)分別為0.7%，15%，0.05%和0.02%的瓊脂、蔗糖、硼酸、氯化鈉配制培養(yǎng)基[9]，將配制好的培養(yǎng)基平鋪一薄層于培養(yǎng)皿中，冷卻后用鑷子夾取花藥，把花粉均勻涂于培養(yǎng)基上。蓋上培養(yǎng)皿，放在鋪有濕紗布的白磁盤里，25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，24 h后觀察其萌發(fā)率，花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)[10]，試驗處理重復(fù)3次。

1.2.2 計算萌發(fā)率

每處理取3～4個視野，共10個視野，每個視野統(tǒng)計不少于50粒花粉。萌發(fā)率=（視野萌發(fā)花粉粒數(shù)÷視野總花粉粒數(shù)）×100%[11]。

1.2.3 三種花粉染色方法

參考I2-KI染色法[12-14]、TTC染色法[12-14]、紅墨水染色法[14-16]。每次染色前用鑷子夾取花藥，輕輕抖動將花粉散落在載玻片上，在花粉處滴上染色液，蓋玻片蓋住染色液，濾紙吸去多余染色液，放入倒置顯微鏡下觀察。測定茵芋花粉生活力，以期篩選出快速、準(zhǔn)確、有效的測定茵芋花粉生活力的方法。

I2-KI染色法結(jié)果判斷：凡是被染成藍(lán)色的為含有淀粉的活力較強的花粉粒，呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒。

TTC染色法結(jié)果判斷：凡是被染成紅色的為具較強生活力的花粉粒，呈淡紅色的為微弱活力的花粉粒，無色的判定為無活力或不育。

紅墨水染色法結(jié)果判斷：凡是被染成紅色的花粉為失去活力的花粉。未被染色的為活力較強的正?；ǚ?，淡紅色的活力次之。

每種染色法觀察3個制片，每片取3～4個視野，共10個視野，每個視野統(tǒng)計不少于50?；ǚ鄣娜旧?，計算有生活力花粉百分率的平均值?；ǚ刍盍?（有生活力的花粉數(shù)目÷花粉?？倲?shù)目）×100%。

1.3 花粉貯藏試驗

1.3.1 花粉貯藏預(yù)試驗

由于茵芋花較小，且花藥散粉不完全，故在盛花期，用鑷子采下當(dāng)天盛開的花朵，剝除花瓣，留下花藥，置于培養(yǎng)皿中，分別在室溫(16～31℃，白天平均濕度55%，晚上平均濕度89%)、4、0、-12、-20℃環(huán)境下貯藏花粉，1 d后開始測定花粉活力。

1.3.2 預(yù)處理后花粉貯藏試驗

將采集到的盛花期花藥置于稱量紙上在陰涼的室內(nèi)預(yù)先晾干2～4 h，使花粉水分下降到一定水平，再用錫泊紙包住放入底部放有干燥劑的5 mL指形管中，每管放入2～3個花藥，活力檢測時取出花藥自然散粉并進行活力檢測。

室溫貯藏：將帶花藥的指形管置于實驗室內(nèi)，室溫環(huán)境中；4℃冷藏：將帶花藥的指形管置于普通海爾冰箱冷藏室中貯藏；0℃低溫：將帶花藥的指形管置于普通海爾冰箱冷凍室中貯藏；-12℃低溫：取2支帶花藥的指形管依次在4℃冷藏室、0℃冷凍室過渡預(yù)冷4 h后再放進-12℃ DW-25L262型海爾醫(yī)用低溫保存箱中；-20℃低溫：取2支帶花藥的指形管依次在4℃冷藏室、0℃冷凍室、-12℃保存箱中過渡預(yù)冷4 h后再放進BCD-539WT型-20℃冷凍冰箱中。

以上各處理均在1 d后，根據(jù)采用染色法試驗中篩選出的較適宜方法，開始測定花粉活力。試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 花粉活力測定試驗

根據(jù)染色法的判斷結(jié)果統(tǒng)計，I2-KI染色法、TTC染色法的染色效果區(qū)別不明顯，而紅墨水染色法的試驗結(jié)果從表1可看出，與離體萌發(fā)法相近。

表1 茵芋花粉生活力測定方法比較Tab.1 Comparison of methods for determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune

離體萌發(fā)試驗：茵芋花粉從4 h開始萌發(fā)，從花粉粒表面長出透明狀突起，隨著時間的推移逐漸伸長形成花粉管，22 h后均達到萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

I2-KI染色法：全部花粉著色呈現(xiàn)紅褐色（圖1，A），按照此方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)，茵芋花粉生活力極差甚至無生活力，與離體萌發(fā)法差異大。

TTC染色法：花粉均不著色（圖1，B），按照此方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)，茵芋花粉生活力極差甚至無生活力，與離體萌發(fā)法差異大。

紅墨水染色法：紅墨水染色茵芋花粉，無活力花粉能均勻著色，并與有生活力花粉區(qū)別明顯（圖1，C），所得出有活力花粉的比率經(jīng)方差分析與離體萌發(fā)試驗差異不顯著。

圖1 染色花粉與室溫花粉Fig.1 Dyed pollen and room temperature pollen

三種染色法試驗中只有紅墨水染色能較明確區(qū)別茵芋有無生活力的花粉，也就是紅墨水染色法能夠快速有效地檢測花粉活力，故本次試驗采用紅墨水染色法進行花粉貯藏活力測定。

2.2 花粉貯藏試驗

2.2.1 花粉貯藏預(yù)試驗

未經(jīng)預(yù)處理的花粉，室溫中放置1 d后，在顯微鏡下可明顯觀察到花粉皺縮開裂，花粉內(nèi)容物溢出（圖1，D），已失去生命力。-12和-20℃環(huán)境中保存1 d的花粉，紅墨水染色后花粉已全部均勻著色，失去生命力。

從表2看出，未經(jīng)預(yù)處理的花粉，在4℃溫度下貯藏，花粉前3天還保持較高生活力，第7天下降比較大，第9天失去生活力。而在0℃溫度下貯藏，1 d后就下降較多，但在隨后的貯藏時間里（3、7、9 d）下降較為緩慢，第9天還有13.93%的生活力。

表2 不同溫度不同時間茵芋花粉生活力測定結(jié)果Tab.2 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and different time

花粉預(yù)試驗中，花藥未進行一定預(yù)處理，室溫環(huán)境、-12和-20℃環(huán)境貯藏1 d均出現(xiàn)花失去活力的情況，而4和0℃環(huán)境下花粉均能保持一定時間的活力，圖2可看出0℃環(huán)境下貯藏1 d就與4℃環(huán)境有顯著差異，0℃環(huán)境下貯藏3 d的活力繼續(xù)下降明顯，4℃環(huán)境下貯藏的花粉活力在第7 d開始出現(xiàn)極顯著下降趨勢，可能由于花粉中水分含量造成了細(xì)胞的損傷，說明茵芋花粉貯藏前的預(yù)處理是必要的。

圖2 不同溫度不同時間茵芋花粉生活力測定結(jié)果Fig.2 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and different time

2.2.2 預(yù)處理后花粉貯藏試驗

貯藏在室溫、4、0、-12、-20℃環(huán)境下預(yù)處理后的花粉在第1、7、15、30天的花粉活力分別如表3所示。

表3 預(yù)處理后不同溫度不同時間茵芋花粉生活力測定結(jié)果Tab.3 Determination of pollen viability of Skimmia reevesiana Fortune at different temperature and time after pretreatment

從上表可看出，花粉經(jīng)預(yù)處理后，貯藏在室溫、4、0、-12、-20℃環(huán)境下的活力在第1天，均能保持較高的活力；7 d后活力下降，各溫度間差異并不顯著，但在后續(xù)的15、30 d中變化有差異；在室溫中貯藏7 d開始出現(xiàn)下降，但還是高于50%，而貯藏15 d開始下降，顯著低于50%，貯藏30 d僅有19.5%的生活力，對于生產(chǎn)失去一定保存意義。其余試驗溫度環(huán)境下貯藏30 d與貯藏15 d差異均不顯著，且生活力均高于50%，對生產(chǎn)上花粉的應(yīng)用有一定意義。

3 討論

3.1 花粉活力測定

TTC染色后從20 min開始至48 h觀察結(jié)束花粉均未染色(無生活力)，造成判斷沒有生活力的結(jié)果，可能是茵芋花粉自身特性(如花粉壁的厚薄，花粉外壁的組成物質(zhì)，花粉內(nèi)各種酶活性的強弱等)的影響所致，I2－KI染色結(jié)果花粉均染成黃褐色(無生活力)，可能是因為花粉不含淀粉或含淀粉量極低難以檢測出來，結(jié)果有待進一步研究[17]；若深入研究TTC染色法、I2－KI染色法測定茵芋花粉生活力更多方面的影響條件參數(shù)，需要設(shè)計更多的影響因素處理組合，如增加不同染色溫度、時間組合，設(shè)計更多的染色液濃度梯度，并選用同屬不同品種等，才能夠更詳細(xì)分析茵芋花粉生活力染色的可信度。

花粉活力最可靠的檢測方法還是基于花粉發(fā)芽率，即花粉的離體萌發(fā)[18]，所以離體萌發(fā)試驗是現(xiàn)在雜交育種中花粉活力檢測的首選方法[8]，從本次紅墨水染色法和離體萌發(fā)試驗法的標(biāo)準(zhǔn)差來看，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，均可適用于茵芋花粉活力測定。并且紅墨水染色的效果好，時間快，在某些情況下，可單獨使用。而茵芋離體萌發(fā)法需在特定溫度(25℃)和較長時間(4 h以后)培養(yǎng)才能實現(xiàn)，因而有條件的情況，采用紅墨水染色法與離體培養(yǎng)法結(jié)合使用，以提高茵芋花粉生活力測定的準(zhǔn)確性，同時需要一定的重復(fù)試驗。

試驗離體萌發(fā)法的萌發(fā)率較低，與花粉最適宜的采集時間，萌發(fā)特性，以及茵芋萌發(fā)的主因素鈣，次因素蔗糖，輔助因素硼等營養(yǎng)的適宜濃度均有關(guān)系，此方面研究已另文發(fā)表[19]。

3.2 花粉貯藏試驗

許多研究表明，花粉活力受貯藏的溫度和時間影響較大[20]，同時也受低溫貯藏的預(yù)處理和解凍方式影響[21-22]。

未經(jīng)任何處理的茵芋花粉在常溫下1 d即變形失去生活力，說明茵芋花粉對溫度比較敏感。4和0℃貯藏溫度條件下，花粉生活力隨著時間的延長而下降。在4℃貯藏條件下，前3 d的生活力差異不顯著，到了第7天，生活力下降達到極顯著水平，9 d后花粉已全部失去生活力。在0℃貯藏條件下，第1天就下降明顯，但在隨后的7 d內(nèi)，花粉活力變化不顯著，9 d后變化顯著。

在相同的貯藏時間（3 d）下，4℃貯藏條件下的花粉生活力高于0℃貯藏條件下的花粉生活力。而到了7 d，4℃貯藏條件下的花粉生活力低于0℃貯藏條件下的花粉生活力。貯藏時間9 d后，4℃貯藏條件下的花粉已全部失去生活力，0℃貯藏條件下的花粉生活力為13.93%。在本次花粉貯藏試驗觀察的9 d時間內(nèi)，4℃貯藏條件下的花粉生活力下降速率更快，從長遠(yuǎn)的貯藏時間來說，應(yīng)該探討低溫以及超低溫貯藏的方法。

預(yù)試驗后將花粉經(jīng)適當(dāng)干燥并保存在放有干燥劑的指形管中，花粉貯藏活力得到顯著提高，室溫下的花粉7 d后仍有66.5%活力，15 d后下降明顯；而在4、0、-12、-20℃環(huán)境下貯藏30 d花粉生活力均高于50%，在生產(chǎn)上雜交育種方面有一定應(yīng)用。從短期保存上，7 d之內(nèi)的應(yīng)用可直接在室溫、或放入普通家用冰箱中；30 d之內(nèi)的應(yīng)用可放入普通家用冰箱中，冷藏室與冷凍室均可，比較經(jīng)濟實惠；而更長時間(如90 d)的保存與應(yīng)用，可選擇-12、-20℃環(huán)境下貯藏[23]，一般花粉保存在低溫、低濕和無氧條件下較能保持萌發(fā)力，主要原因是降低了呼吸強度和酶的活性。

由于花粉的生活力受遺傳特性和貯藏條件的影響，新鮮花粉由于含水量較高，在直接放入低溫的環(huán)境當(dāng)中，花粉細(xì)胞內(nèi)的水分容易結(jié)成冰晶，從而花粉活力降低[24]。因而花粉采集后必須進行適當(dāng)水分預(yù)干燥處理，再放入低溫度下貯藏，保證花粉的活力[25]。本實驗中的簡單預(yù)處理已達到較好效果，但關(guān)于茵芋花粉水分預(yù)干燥處理的適宜方法與最適含含水量以及合適的解凍方式，可進一步深入研究探討。