昆蟲幾丁質合成通路的研究進展

劉蘭蘭

昆蟲幾丁質合成通路的研究進展

劉蘭蘭

（西南林業(yè)大學云南昆明650224）

Candy等早在1962年就發(fā)表了完整的昆蟲幾丁質合成通路，并在沙漠蝗蟲中證實了該通路共有8種酶參與其中。為了進一步深入研究昆蟲幾丁質的合成通路，文章梳理了該通路中8種酶的相關研究現(xiàn)狀，通過對已有相關研究內容的綜合分析，以期為昆蟲幾丁質合成通路的后續(xù)科學研究提供新的思路。

幾丁質；合成通路；合成酶；研究進展

幾丁質作為昆蟲極其重要的結構性組分，參與昆蟲表皮及中腸圍食膜的形成[1]，能幫助昆蟲抵御機械損傷，減少不良環(huán)境的危害。Candy和Kilby于1962年在沙漠蝗蟲（desertlocust）中首次證實了完整的昆蟲幾丁質合成通路。整個通路起始于海藻糖，在8種酶的協(xié)助下，生成了最終的產(chǎn)物——幾丁質[2]。之后隨著越來越多的研究證實，這一昆蟲幾丁質合成通路已經(jīng)得到驗證及公認。

盡管昆蟲幾丁質合成通路中的8種酶都已經(jīng)明確，其研究深度也從蛋白質水平深入到基因水平，但8種酶基因的研究深度及研究進展是不平衡的?？傮w來說，海藻糖酶（Tre）和幾丁質合成酶（CHS）的研究較為深入，其余6種酶的研究較淺。對通路中8種酶的研究進展進行梳理，能更充分地了解昆蟲幾丁質合成通路的研究現(xiàn)狀，從而為進一步加強對幾丁質合成通路相關酶的研究及充分利用奠定基礎。

1 幾丁質的研究進展及其在昆蟲中的功能

1.1 幾丁質的發(fā)現(xiàn)

1811年，法國生物化學家Henri Braconnot發(fā)現(xiàn)了一種來自蘑菇的多糖，并稱之為“真菌素”。后來Odier于1823年發(fā)現(xiàn)這種存在于蘑菇中的多糖在昆蟲中也有存在，由于觀察到這種多糖所發(fā)揮的功能類似于一種包膜或是被膜，Odier在希臘單詞“殼聚糖”的基礎上，將這種多糖命名為“幾丁質”[3-4]。

1.2 幾丁質的結構

從化學結構上看，幾丁質是一種線性的多糖聚合物，純天然的幾丁質一般是由比例為5%～20%的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）殘基和氨基葡萄糖（GlcN）殘基所組成的雜聚物[5]。在結構上，幾丁質與纖維素的區(qū)別并不大，唯一的不同點是幾丁質單體第二個C原子上的乙酰氨基（—NHCOCH3）與纖維素單體第二個C原子上的羥基（—OH），如圖1所示。乙酰氨基的替代使得相鄰的幾丁質鏈之間的氫鍵大大增加了，從而增強了纖維支架結構的強度，也使其更易形成多鏈[6]，賦予了幾丁質可以構建各種細胞外基質支架的能力[7]。

圖1　幾丁質（左）與纖維素（右）的部分分子結構

1.3 幾丁質在自然界的分布

目前已經(jīng)有大量前人的研究證明，幾丁質是自然界中多種生物不容小覷的結構組分[8]，其豐富度已達到地球上僅次于纖維素，是第二豐富的有機物[7]。在前人的研究成果中，已發(fā)現(xiàn)幾丁質主要分布于甲殼動物、昆蟲外骨骼及中腸圍食膜，藻類、線蟲、真菌以及軟體動物的表皮中，且相關的大多數(shù)科研工作者認為，在高等植物、人類和其他脊椎動物體內沒有幾丁質的存在[9-11]。

1.4 昆蟲中幾丁質的功能

在昆蟲中，幾丁質既是昆蟲外骨骼的重要成分，也是昆蟲中腸圍食膜的重要成分[1]，其作用如下：

（1）幾丁質是昆蟲外骨骼的重要支撐成分，使得昆蟲在保持外在特定形態(tài)的基礎上，還能保護內部器官免受外界的物理損傷，抵御不良環(huán)境帶來的傷害。

（2）幾丁質參與昆蟲中腸圍食膜基質的形成，能保護腸道細胞免受硬度較大的食物顆粒的損傷[12]。前人利用x-射線衍射對昆蟲體內幾丁質的結構進行了分析，證實幾丁質在生物體中共有3種不同的結晶形式，如圖2所示，目前3種晶體都已在昆蟲中被證實存在[13-14]。

圖2　昆蟲幾丁質的三種晶體形式[14]

2 昆蟲幾丁質合成通路的發(fā)現(xiàn)及其相關酶的研究進展

2.1 昆蟲幾丁質合成通路的發(fā)現(xiàn)

1962年，Candy等在沙漠蝗蟲（desert locust）中驗證了完整的幾丁質合成通路。該通路全程有8種酶參與催化，首先是海藻糖酶（trehalase, Tre），中間經(jīng)過了糖酵解途徑的2種酶、己糖胺通路的4種酶，最后終止于通路中最重要幾丁質合成酶（CHS）[2]，如圖3所示。次年，Jaworski等就將這條通路在中得到證實，并在上發(fā)表了該成果[15]。之后隨著相關研究的不斷增多，這一昆蟲幾丁質合成通路已經(jīng)被多次驗證及公認。

圖3　昆蟲合成通路示意圖[16]

2.2 昆蟲幾丁質合成通路相關酶的研究進展

2.2.1 海藻糖酶

合成途徑中，第1個酶是海藻糖酶（trehalase, Tre; EC 3.2.1.28），Tre作為通路中的第一個催化酶，將一分子的海藻糖催化水解，從而產(chǎn)生兩分子的葡萄糖[17]。昆蟲中有可溶性海藻糖酶（Tre-1）與膜結合海藻糖酶（Tre-2）這兩大類別的基因。有關-基因的報道最早是在1992年，Takiguchi等用同源性基因篩選的方法從黃粉蟲雄性副腺中分離到一個-基因的cDNA[18]，而-基因直到2005年才被報道，Mitsumasu等完成了在家蠶（）中的-的分子克隆及其在幼蟲中腸中的定位[19]。Lee等于2007年克隆出了歐洲蜜蜂（European honeybee）的膜結合海藻糖酶基因-的cDNA序列[20]。隨后在甜菜夜蛾（）褐飛虱（）等昆蟲中都有基因的克隆、分子特征及表達模式的相關報道[21-22]。

2.2.2 己糖激酶

合成途徑中的第2個酶是己糖激酶（hexokinase, HK; EC 2.7.1.1），它開啟了糖酵解途徑，能催化多種功能蛋白的合成，并調控細胞凋亡及轉錄等活動。己糖激酶在昆蟲幾丁質合成通路中催化己糖磷酸化，并生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）[23-26]。

2.2.3 葡萄糖-6-磷酸異構酶

合成通路中的第3個酶是葡萄糖-6-磷酸異構酶（G6PI; EC 5.3.1.9），其也是糖酵解途徑的第2個酶。G6PI是一種二聚體酶，能使得果糖-6-磷酸（F6P）與葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）發(fā)生雙向的異構化[27-28]。G6PI不僅在合成幾丁質的過程中發(fā)揮重要的作用，作為二聚體酶對多物質的合成都起到了催化作用，同時G6PI的單體形式還可以作為一種細胞因子活動，如人類脊椎白血病細胞的分化介導因子和成熟介導因子，以及神經(jīng)白介素等[29-30]。

2.2.4 谷氨酸鹽:果糖-6-磷酸轉氨酶

合成通路的第4個酶是谷氨酸鹽:果糖-6-磷酸轉氨酶（GFAT; EC:2.6.1.16）。GFAT不但參與幾丁質的生物合成和蛋白質糖基化的調控，還是其他復雜有機物合成過程中的一種重要酶，如雄性黑果蠅（）唾液腺黏液蛋白合成的第一步就是由GFAT催化的[31]。GFAT也是誘導TGF-β1和纖維連接蛋白在系膜細胞中表達所必需的[32]，還被證實是一種胰島素調節(jié)酶，在培養(yǎng)細胞誘導胰島素抵抗中發(fā)揮重要作用[33]。Huang等（2007）在其研究中報道了一種來自長角血蜱（）的新型GFAT（GFAT）的分子特征和潛在功能，實驗過程使用RNA干擾GFAT后，成年雌性小鼠的充血率顯著降低。這一效應的潛在機制可能是限制了GFAT的表達后幾丁質的生物合成也受到了抑制，從而破壞了血液喂養(yǎng)過程中角質層的生長和圍食膜基質的形成[34]。Liu等（2015）的研究表明，凡納濱對蝦（）胰腺中GFAT的表達水平會受到海洋中重金屬殘留和化學污染物的影響。在pH=9.3和鎘的脅迫下，-基因的轉錄水平會明顯提升。然而，在這些脅迫下，mRNA的表達水平在不同的時間達到峰值。以上結果表明，堿性條件（pH=9.3）和鎘的脅迫可刺激-基因的表達，可能在凡納濱對蝦對抗環(huán)境脅迫中發(fā)揮關鍵的作用[35]。

2.2.5 葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉移酶

合成通路的第5個酶是葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉移酶（GNA; EC 2.3.1.4），催化葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate, GlcN6P）生成N-乙酰葡糖胺-6-磷酸（N-acetylglucosamine-6-phosphate, GlcNAc6P）[36-37]。在前人的研究中，已經(jīng)有布氏錐蟲（）、酵母菌和人類的GNA三級結構的報道[38-41]。埃及伊蚊（）的基因表達也已經(jīng)有了相關報道[42]。

2.2.6 乙酰氨基葡萄糖變位酶

合成通路的第6個酶是乙酰氨基葡萄糖變位酶（AGM; EC 5.4.2.3），它可以轉移分子內的磷酸基團（磷酸轉移酶或磷酸基化酶），并催化GlcNAc-6-P和GlcNAc-1-P的可逆轉化。在真核生物中，乙?；磻l(fā)生在分子內磷酸化轉移的步驟之前，而在原核生物中，乙酰化反應發(fā)生在分子內磷酸化轉移的步驟之后，因此原核生物和真核生物中UDP-GlcNAc的生物合成機制有所不同[43]。Kato等在2010年克隆了埃及伊蚊（）的基因，該基因在埃及伊蚊的整個齡期都有表達[44]。張政等在2019年利用RNAi實驗發(fā)現(xiàn)，基因的沉默會致使約30%飛蝗（）出現(xiàn)死亡表型，推測其在飛蝗的新表皮合成過程中發(fā)揮了重要作用[45]。

2.2.7 UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶

合成通路的第7個酶是UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP; EC 2.7.7.23），它廣泛分布于自然界中。從賈第鞭毛蟲（）、粗糙脈孢菌（）、豬肝細胞、小牛肝和酵母菌中均得到部分純化[46-50]。UAP作為關鍵糖基化蛋白質催化N-acetylglucosamine-1-phosphate和UDP-N-acetylglucosamine發(fā)生可逆反應，是昆蟲幾丁質合成通路中不可缺少的一個酶。目前在部分昆蟲中已經(jīng)得到基因的測序結果。Palaka等（2014）證明，埃及伊蚊在缺失UAP的情況下，昆蟲會由于個體發(fā)育和外骨骼的形成受到阻礙而死亡[51]。

2.2.8 幾丁質合成酶

昆蟲幾丁質合成通路中的第8個酶是幾丁質合成酶（chitin synthase, CHS; EC 2.4.1.16），對于昆蟲的幾丁質合成途徑來說，它是最關鍵、最重要的催化酶。CHS屬于糖基轉移酶家族，分子量超過170 kDa[52]，昆蟲中有兩種CHS，分別由（）基因和（）基因編碼。基因通常在昆蟲的表皮及氣管中表達，編碼的酶能催化表皮幾丁質、氣管幾丁質的形成?；騽t是在中腸圍食膜中表達，編碼的酶催化中腸圍食膜的形成[52-53]。目前在直翅目、鱗翅目、膜翅目、半翅目等多種昆蟲中都有基因的cDNA序列克隆及功能研究。如Ibrahim在2000年就克隆了埃及伊蚊中腸組織中基因的cDNA[54]，汪小東等（2014）采用同源基因克隆技術克隆了二斑葉螨（）的基因的cDNA全長，并進行了序列分析，結果表明該基因屬于基因類型[55]。

3 展望

盡管昆蟲幾丁質合成通路中的所有相關酶都已經(jīng)明確，其研究深度也從蛋白質水平深入到基因水平，但人們對昆蟲中幾丁質的生物合成途徑的研究仍不是透徹的，例如幾丁質合成酶的跨膜運輸模式至今仍然還是處在模型分析的階段。加強進一步的研究是該領域正在進行的重要工作。

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