粗脛翠尺蛾視蛋白基因的克隆及燈光對(duì)其表達(dá)量的影響

姚 瓊，全林發(fā)，徐 淑，董易之，李文景，池艷艷，陳炳旭

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

荔枝、龍眼是中國(guó)南方優(yōu)勢(shì)名貴水果，主要分布于廣東、廣西、福建、海南、四川及云南等省（自治區(qū)），是“南國(guó)四大果品”之首[1]。2019年全國(guó)荔枝和龍眼栽培面積分別高達(dá)54.1萬和27.6萬hm2，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[2]。以尺蛾為主要類群的食葉害蟲在荔枝、龍眼梢期所造成的葉片損失在病蟲害造成的葉片損失中占比超過80%，對(duì)荔枝、龍眼高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)造成巨大威脅[1,3]。危害廣東荔枝、龍眼的尺蛾種類主要為粗脛翠尺蛾(Thalassodes immissaria)，該蟲每年可發(fā)生7～8代，世代重疊，8—11月發(fā)生為害最嚴(yán)重[4-5]。粗脛翠尺蛾多于夜間羽化，羽化當(dāng)晚交尾，交尾后第2天即可產(chǎn)卵，雌性成蟲單雌產(chǎn)卵總量可高達(dá)180余粒，是荔枝、龍眼梢期的重點(diǎn)防控對(duì)象[3]。

視覺是昆蟲感知外界信息的最重要途徑之一，對(duì)昆蟲取食、躲避天敵、求偶、產(chǎn)卵等行為起關(guān)鍵作用[6]。昆蟲通過復(fù)眼上的光感受器將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成生物電位信號(hào)，再通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將其傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起視覺反應(yīng)[7]。其中，光感受器的感光色素因子的核心成分是視蛋白[7-8]。視蛋白是一種具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，分子量約為30～50 kDa[9]。根據(jù)其對(duì)不同波長(zhǎng)敏感性可分為紫外光視蛋白(ultraviolet wavelength sensitive opsin，UV)，藍(lán)光視蛋白(blue wave length sensitive opsin，BL)和長(zhǎng)波長(zhǎng)視蛋白(long wave length sensitive opsin，LW)3類，3種視蛋白在應(yīng)對(duì)不同光源中發(fā)揮不同的作用，其對(duì)應(yīng)的不同波長(zhǎng)分別為300～400、400～500、500～600 nm[8-11]。

燈光防控技術(shù)主要以昆蟲趨光性或負(fù)趨光性為理論基礎(chǔ)開發(fā)，對(duì)果園夜行性蛾類進(jìn)行誘捕、驅(qū)避或干擾以達(dá)到綠色防控目的[12-14]。目前，該項(xiàng)技術(shù)在中國(guó)主要荔枝和龍眼產(chǎn)區(qū)被推廣應(yīng)用，其相關(guān)研究主要針對(duì)荔枝、龍眼果期頭號(hào)害蟲——荔枝蒂蛀蟲，對(duì)于梢期頭號(hào)害蟲尺蛾的影響卻無研究報(bào)道[13-16]。筆者以粗脛翠尺蛾為試驗(yàn)對(duì)象，在該蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果基礎(chǔ)上鑒定2個(gè)視蛋白基因，并對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行克??；在對(duì)其序列特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，通過RT-qPCR技術(shù)測(cè)定2個(gè)視蛋白基因（TiLW和TiUV基因）的發(fā)育模式以及在光照處理后的表達(dá)變化，以期為闡明視蛋白在粗脛翠尺蛾應(yīng)激反應(yīng)中的生理功能研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

粗脛翠尺蛾采自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗(yàn)基地荔枝園，置于植物保護(hù)研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)長(zhǎng)期飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，光周期14:10(L:D)。幼蟲以荔枝嫰梢喂養(yǎng)，成蟲以10%的蜂蜜水為食。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol試劑分別提取粗脛翠尺蛾成蟲頭部的總RNA，采用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，再采用PrimeScript RT Reagent試劑盒(Takara，Tokyo，Japan)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，于-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 序列克隆與分析

以粗脛翠尺蛾轉(zhuǎn)錄組（數(shù)據(jù)待發(fā)表）測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，從成功注釋的unigene中搜索視蛋白(opsin)基因序列，將其對(duì)應(yīng)的蛋白序列與NCBI中的nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTP，驗(yàn)證是否屬于視蛋白。利用Primer 5.0軟件根據(jù)目的基因片段設(shè)計(jì)引物，用于獲得的粗脛翠尺蛾TiUV、TiLW視蛋白基因全長(zhǎng)序列（表1）。分別以1對(duì)特異性引物進(jìn)行5’和3’RACE擴(kuò)增。5’RACE反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。3’RACE反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。最后用DNAstar軟件將所得序列片段拼接為完整的序列。

表1 試驗(yàn)所用的引物

使用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行核酸序列的同源性分析，與不同物種進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用在線軟件ORF Finder查找序列的開放閱讀框，使用DNAstar軟件預(yù)測(cè)其編碼氨基酸序列。利用ProtParam軟件預(yù)測(cè)蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；ProtScale軟件進(jìn)行疏水性分析；TMHMM 2.0軟件分析跨膜結(jié)構(gòu)；SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)視蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，Prosite Scan和Motif Scan在線軟件分析其氨基酸序列的功能位點(diǎn)。采用MEGA 4.1軟件中的鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootrap為1000次。

1.4 光照處理

在不同人工氣候箱中（GXZ型，寧波江南儀器廠）分別設(shè)置24L:0D（光照處理組）和14L:10D（對(duì)照組），將當(dāng)天羽化的粗脛翠尺蛾成蟲共8頭(♀:♂=1:1)置于飼養(yǎng)盒中，將飼養(yǎng)盒置于不同處理的人工氣候箱中，用浸潤(rùn)10%蜂蜜水的棉球進(jìn)行飼養(yǎng)，分別于處理后24 h和48 h取樣。

1.5 熒光定量檢測(cè)

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)粗脛翠尺蛾的TiUV和TiLW基因的qPCR引物（表1）。采用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒（promega，麥迪遜，美國(guó)）進(jìn)行RT-qPCR。其反應(yīng)體系包括：10 μL GoTaq qPCR Master Mix，1 μL cDNA模板，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，8 μL DEPC水。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)。以Tiβ-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，數(shù)據(jù)分析使用比較比較CT值方法分析[17]。每次RT-qPCR需要3次技術(shù)重復(fù)，并且每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗脛翠尺蛾視蛋白基因的克隆與序列分析

以粗脛翠尺蛾成蟲頭部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到TiLW和TiUV視蛋白基因的ORF長(zhǎng)度為1504 bp和1762 bp；分別編碼為374個(gè)和378個(gè)氨基酸，蛋白分子量分另為41.04 kDa和41.52 kDa，等電點(diǎn)為7.01和5.69。序列二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，TiLW和TiUV蛋白序列主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成。其中，TiLW氨基酸序列中α-螺旋比例占45.01%，β轉(zhuǎn)角比例占2.70%，隨機(jī)卷曲比例占33.15%，延伸鏈比例占19.14%；TiUV的α-螺旋比例占2.93%，其序列β轉(zhuǎn)角、隨機(jī)卷曲和延伸鏈比例均高于TiLW（表2）。與其他已報(bào)道昆蟲視蛋白一樣，TiLW和TiUV均具有7個(gè)跨膜螺旋區(qū)。TiLW包含4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)，2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)G蛋白耦合受體家庭標(biāo)簽，1個(gè)視網(wǎng)膜結(jié)合位點(diǎn)；TiUV包含1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，9個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（圖1）。

圖1 粗脛翠尺蛾TiLW和TiUV視蛋白氨基酸序列

表2 粗脛翠尺蛾2個(gè)視蛋白基因及其編碼氨基酸的序列特征

2.2 基于UV和LW視蛋白氨基酸序列進(jìn)化樹的構(gòu)建與同源性分析

通過與其他昆蟲的同類蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，粗脛翠尺蛾TiLW和TiUV與其他物種的長(zhǎng)波長(zhǎng)視蛋白LW和紫外光視蛋白UV具有較高同源性。使用MEGA 5軟件鄰接法進(jìn)行1000次重復(fù)計(jì)算后構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。進(jìn)化關(guān)系分析表明，克隆得到的粗脛翠尺蛾視蛋白分屬于形成LW和UV 2個(gè)明顯的分支。其中，粗脛翠尺蛾TiLW同源性最高為樺尺蛾(Biston betularia)和松白條尺蠖(Operophtera brumata)同類蛋白，與TiUV同源性最高的有大蠟螟(Gallearia mellonella)、亞洲玉米螟(Ostrinia fumacalls)和柑橘鳳蝶(Paplllo xuthus)等多種鱗翅目昆蟲UV蛋白。

圖2 粗脛翠尺蛾與其他昆蟲的視蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 TiLW和TiUV在粗脛翠尺蛾不同發(fā)育階段及雌雄成蟲期表達(dá)量分析

對(duì)TiLW和TiUV在粗脛翠尺蛾不同發(fā)育階段表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，TiLW和TiUV在粗脛翠尺蛾不同發(fā)育階段均有所表達(dá)（圖3）。TiLW在3日齡雌成蟲有最高量表達(dá)，其次為2日齡雌成蟲；TiUV同樣在2、3日齡雌、雄成蟲體內(nèi)有高量表達(dá)，其次為卵期。TiLW和TiUV視蛋白基因在粗脛翠尺蛾成蟲期表達(dá)量普遍高于其他發(fā)育階段，而且從1日齡到3日齡雌雄成蟲體內(nèi)的基因表達(dá)量呈現(xiàn)逐步升高趨勢(shì)。比較而言，TiUV在卵期高于TiLW；在幼蟲階段低于TiLW，僅在4、5齡期幼蟲體內(nèi)表達(dá)與TiLW同期表達(dá)無顯著差異；在蛹期和雌性成蟲體內(nèi)，TiUV表達(dá)量遠(yuǎn)低于TiLW，但在雄性成蟲體內(nèi)兩者表達(dá)量無顯著性差異。推測(cè)TiUV在蟲體卵期扮演重要角色，TiLW在幼蟲和成蟲期有更重要的生理功能，TiLW在雌性成蟲視覺功能中居主導(dǎo)地位。

圖3 TiLW 和TiUV 視蛋白基因在粗脛翠尺蛾雌雄成蟲期的表達(dá)量

2.4 光照處理對(duì)粗脛翠尺蛾TiLW和TiUV視蛋白基因表達(dá)量影響

對(duì)光照處理組和對(duì)照組粗脛翠尺蛾頭部TiLW和TiUV視蛋白基因表達(dá)量變化進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。圖4結(jié)果顯示，成蟲頭部TiLW和TiUV的表達(dá)量在光照處理后均受到不同程度的影響。與對(duì)照組相比，光照處理后24 h，TiLW在雌、雄蟲頭部分別上升12.96倍和降低8.61倍，而TiUV僅在雄蟲頭部降低3.10倍；光照處理48 h后，僅TiLW在雌蟲頭部表達(dá)量與對(duì)照組無差異，在雄蟲頭部表達(dá)量下降3倍，而TiUV在雌蟲頭部下降1.84倍，在雄蟲頭部表達(dá)無差異。整體而言，光照處理24 h和48 h對(duì)粗脛翠尺蛾TiLW的表達(dá)影響要大于TiUV基因。

圖4 光照處理24 h與48 h對(duì)TiLW和TiUV視蛋白基因表達(dá)量的影響

3 討論

燈光干擾技術(shù)是一項(xiàng)重要的荔枝龍眼害蟲綠色防控措施，具有高效環(huán)保、無農(nóng)藥殘留危害、對(duì)害蟲不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)[14-16]。光對(duì)昆蟲影響有多種，包括趨光性、光適應(yīng)、干擾晝夜節(jié)節(jié)律、影響生長(zhǎng)發(fā)育等。燈光干擾技術(shù)則以上述靶標(biāo)害蟲的影響為基礎(chǔ)開發(fā)[12-13]。目前，該項(xiàng)技術(shù)在廣西和廣東無公害荔枝龍眼種植園廣泛推廣應(yīng)用，室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，24L:0D光周期處理后，荔枝蒂蛀蟲單雌產(chǎn)卵量由136.33粒降低至1粒；田間試驗(yàn)驗(yàn)證夜晚光照下荔枝蒂蛀蟲蛀果率可控制在4.00%以下[16]。由此可見，該項(xiàng)技術(shù)在荔枝龍眼農(nóng)藥減量化種植中有重要推廣意義。但是該項(xiàng)技術(shù)對(duì)于荔枝、龍眼梢期頭號(hào)害蟲——粗脛翠尺蛾的影響卻并無研究報(bào)道。本研究首次從粗脛翠尺蛾中克隆得到了2種視蛋白基因（TiLW和TiUV），在對(duì)其序列特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，通過RT-qPCR技術(shù)測(cè)定了2個(gè)視蛋白基因的發(fā)育模式以及在光照處理后的表達(dá)變化，以期為闡明燈光干擾技術(shù)對(duì)非靶標(biāo)害蟲影響提供線索，同時(shí)為視蛋白在粗脛翠尺蛾應(yīng)激反應(yīng)中的生理功能研究提供參考。

鱗翅目昆蟲視覺系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)，其視覺主要依賴于對(duì)不同光譜有吸收性的光感細(xì)胞，光感細(xì)胞對(duì)不同光譜的吸收主要由視蛋白和發(fā)色團(tuán)結(jié)合而成的視色素決定[11,18]。光周期、日齡、性別等因素都對(duì)昆蟲視蛋白基因的表達(dá)有一定影響，而且不同的視蛋白基因表達(dá)的影響因素不盡相同[9]。本研究所獲得的粗脛翠尺蛾TiLW和TiUV視蛋白，其編碼氨基酸經(jīng)序列分析顯示，兩者具有昆蟲同類蛋白所具有的多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，包括N-糖基化位點(diǎn)、酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)等，但是僅在TiLW中找到了G蛋白耦合受體家庭標(biāo)簽和視網(wǎng)膜結(jié)合位點(diǎn)。這些保守位點(diǎn)對(duì)于視蛋白結(jié)構(gòu)形成及與發(fā)色團(tuán)結(jié)合具有重要作用[9,18-19]。此外，基因表達(dá)時(shí)期和組織特點(diǎn)在一定程度上反映基因功能。對(duì)馬尾松毛蟲(Dendrolimus punctatus)的研究表明，LW和BL視蛋白基因在成蟲期高量表達(dá)，UV則在卵和幼蟲期高量表達(dá)[20]；柑橘木虱(Asian citrus)雌性成蟲中LW表達(dá)量顯著高于UV，而雄性成蟲中LW表達(dá)量略低于UV[21]；棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)雌、雄性成蟲中LW表達(dá)量均高于UV[22]。UV和LW視蛋白在不同昆蟲以及昆蟲不同發(fā)育時(shí)期的視覺刺激感知過程中的生理作用均有所區(qū)別。本研究中粗脛翠尺蛾TiUV在卵和成蟲期有較高量表達(dá)，而TiLW在幼蟲期和成蟲期有較高量表達(dá)，TiLW在雌性成蟲的表達(dá)量遠(yuǎn)高于雄性成蟲，推測(cè)TiUV可能與卵孵化相關(guān)，TiLW可能與幼蟲覓食和雌性成蟲產(chǎn)卵地點(diǎn)選擇更為相關(guān)。

昆蟲頭部和復(fù)眼是昆蟲感知光刺激的關(guān)鍵部位，其頭部視蛋白基因的表達(dá)與昆蟲生存環(huán)境息息相關(guān)[23-25]。因此通過克隆并研究視蛋白結(jié)構(gòu)的組成，進(jìn)一步了解視蛋白如何參與調(diào)控昆蟲感知周圍環(huán)境的光信號(hào)，對(duì)害蟲視蛋白與環(huán)境相適應(yīng)的機(jī)制研究非常重要。在本研究中，為研究光照對(duì)粗脛翠尺蛾視蛋白基因表達(dá)量的影響，使用成蟲頭部組織作為試驗(yàn)樣品。前期研究發(fā)現(xiàn)在持續(xù)黑暗條件下棉鈴蟲3個(gè)視蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量顯著性上調(diào)[22]，不同（顏色或強(qiáng)度）光源下，粘蟲(Mythimna separata)、赤擬谷盜(Tribolium castanem)和韭菜遲眼蕈蚊(Bradysia odoriphaga)等視蛋白基因的表達(dá)均受到不同程度的影響[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)光照處理后TiLW的表達(dá)變化要大過TiUV，在光照處理24 h后，TiLW在雌雄成蟲體中分別顯著上升12.96倍和下降8.61倍，TiUV僅在雄性成蟲中下降3.10倍；而在光照處理后48 h，粗脛翠尺蛾TiLW和TiUV表達(dá)量與對(duì)照組差別不大。結(jié)果表明參與粗脛翠尺蛾在光照刺激下的應(yīng)激過程，光刺激可引起粗脛翠尺蛾2個(gè)視蛋白基因表達(dá)變化，但在處理一定時(shí)間后該蟲可適應(yīng)光刺激，即燈光干擾技術(shù)對(duì)粗脛翠尺蛾視蛋白表達(dá)影響并不大。粗脛翠尺蛾依靠視覺和嗅覺信號(hào)尋找寄語、配偶、棲息地和產(chǎn)卵場(chǎng)所，但光感受器和嗅覺感受器如何協(xié)調(diào)作用調(diào)節(jié)這些生物行為的機(jī)理尚不清楚。粗脛翠尺蛾如何通過調(diào)節(jié)視蛋白基因的表達(dá)來感知和適應(yīng)其周圍環(huán)境、是否參與調(diào)控該蟲的其他生物習(xí)性、光干擾技術(shù)對(duì)粗脛翠尺蛾繁殖力影響等，均值得進(jìn)一步深入研究。