基于微流控芯片的生物傳感器發(fā)展現(xiàn)狀與展望*

楊曉君，張夢琦，任萌娜，李元岳，姚 釗

（青島大學微納技術學院，山東青島 266071）

1 引言

生物傳感器是一種對生物分子敏感并將生物分子與換能器結合，通過將濃度的變化轉換為電信號進行檢測的儀器。生物傳感器是由固定化的生物敏感材料作為識別元件（包括酶、抗體、抗原等生物活性物質）、加上適當?shù)睦砘瘬Q能器（如氧電極、光敏管、場效應管等）及硬件儀器組件構成的分析工具或具有接受器與轉換器功能的系統(tǒng)。

在醫(yī)學中，為了實現(xiàn)對病原微生物和激素等分析物更靈敏、精確和快速的檢測，一種小型化和實時的傳感設備對于即時護理和其他醫(yī)療應用具有重要意義，利用微流控技術可以實現(xiàn)檢測器件的小型化。微流控技術是一種快速發(fā)展的技術，通常將微流控裝置叫做微流控芯片，也被稱為芯片實驗室和微全分析系統(tǒng)，它將多個實驗室功能集成在一個芯片上，具有微型化和集成化等特征，可以對極少量流體（10-9～10-18L）進行檢測。微流體技術具有體積小、分析速度快、自動完成樣品分析全過程和集成規(guī)模越來越大的特點，為開發(fā)低成本、緊湊、一次性檢測儀器提供了很大的可能性。由于微流體涉及的樣品體積小，將檢測器與微流體芯片封裝在一起用于分析檢測仍然具有挑戰(zhàn)性，目前迫切需要開發(fā)針對不同目標分析物的高靈敏度生物傳感器。許多有效的檢測技術已經在微流控器件中得到應用，包括電化學方法、機械方法和光學方法。然而，它們有一些固有的弱點，如在液體環(huán)境中靈敏度低和使用光學生物標記物等，這會破壞生物樣品。相反，微波技術具有無接觸、無損、高靈敏度和快速傳感能力，是一個突出的候選技術。與微流體芯片封裝在一起的先進微波生物傳感器表現(xiàn)出設備小型化、非侵入性和操作簡單等明顯優(yōu)勢。

根據(jù)傳感器分類，基于微流控芯片的傳感器主要有光學傳感器、電化學傳感器和射頻傳感器3 類。光學傳感器根據(jù)檢測方法的不同，分為熒光檢測、光譜檢測和比色分析3 類；電化學傳感器根據(jù)微流控芯片制作材質的不同， 分為聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）和紙基2 類；而射頻傳感器根據(jù)應用場景不同，分為生物細胞監(jiān)測、溶液濃度檢測和生物小分子檢測3 類[1-3]。

本文綜述了微流控芯片在生物傳感器中應用的最新進展，詳細介紹了光學生物傳感器、電化學生物傳感器和基于微流控芯片的射頻生物傳感器的特性和原理，對未來的發(fā)展方向進行了展望，并提出了新一代生物微流控傳感器發(fā)展中存在的挑戰(zhàn)和應對問題的策略。

2 光學生物傳感器

2.1 熒光檢測法

基于熒光檢測的微流控芯片利用目標分子和熒光染料（熒光團）之間的相互作用或對具有熒光效應的物質直接進行檢測。熒光檢測過程包括3 個階段，即激發(fā)、激發(fā)態(tài)壽命和熒光發(fā)射。傳感過程使用適當波長的光源來誘導熒光團發(fā)光，產生的光被過濾后將發(fā)射光子與激光光子隔離，然后測量發(fā)射光子的強度并將其用作目標分析物濃度的指標[4-5]。

基于紙基微流控芯片的光學生物傳感器由紙基微流控芯片和迷你盒檢測系統(tǒng)組成，用于甲醛濃度檢測[6]。圖1（a）為紙基微流控芯片的制作步驟示意圖，設計之后通過蠟印打印機進行打印，再加熱使之具有疏水性，然后加熱濾紙使石蠟融化，實現(xiàn)疏水通道在濾紙上的聯(lián)通，最后反面使用蠟重新打印，以防止樣品泄露。將乙酰苯胺指示劑植入紙基微流控的反應區(qū)，再將甲醛樣品滴在反應區(qū)，二者會引發(fā)Hantzsch 反應，然后使用光誘導熒光技術評估甲醛濃度。圖1（b）是使用0～8×10-6濃度范圍內的甲醛樣品進行檢測的熒光圖像，實驗數(shù)據(jù)如圖1（c）所示。結果表明，甲醛濃度和熒光強度呈現(xiàn)指數(shù)相關，相關系數(shù)R2為0.9987。通過測量11 個食品樣品中的甲醛濃度，證明了所提出的基于微流控芯片的光學傳感器系統(tǒng)在實際生活中可以用來檢測甲醛氣體的濃度。

熒光檢測還常用于檢測微量水平的重金屬離子[7]，為了測量三價鉻[Cr（Ⅲ）]的濃度，設計使用微流控芯片，通過在線熒光衍生化和激光誘導熒光光譜對Cr（Ⅲ）進行檢測分析[8]，圖1（d）為在線衍生和檢測的流動注射微流控芯片示意圖。這種自組裝便攜式光纖熒光光譜儀與微流控芯片的結合實現(xiàn)了對實際水樣中Cr（Ⅲ）濃度的檢測。最后，該化學傳感器體現(xiàn)出高靈敏度、穩(wěn)定、快速響應和樣品消耗量低的優(yōu)勢。樣品溶液流速對絡合物（Rhodamine Derivative, R1）R1-Cr（Ⅲ）熒光強度的影響如圖1（e）所示，可以看出，在40～50 μL/min 的流速下，熒光強度最大。不同Cr（Ⅲ）濃度下R1（2 mmol/L）的光譜熒光強度如圖1（f）所示，可以看出，隨著Cr（Ⅲ）濃度的增加，光譜強度線性增加。文獻[8]通過使用基于金（Au）納米團簇的測試紙作為熒光傳感器，建立了一種簡單、便攜、可回收的實時檢測汞離子（Hg2+）和鉛離子（Pb2+）的方法，當Hg2+存在時觀察到試紙出現(xiàn)明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，而在Pb2+存在時觀察到顯著的熒光增強現(xiàn)象。

圖1 基于熒光檢測法的光學傳感器[6，8]

2.2 光譜檢測法

光譜檢測是根據(jù)物質的光譜來鑒別及確定其化學組成和相對含量的方法。光譜分析是一種高靈敏且無損的檢測方法，與熒光檢測相比，它提供窄光譜信號并克服了光漂白問題，因此該技術已成功應用于生物傳感器、細胞成像、疾病診斷以及化學物質的定量測量[9-10]。

為了分離和捕獲單個活細胞，圖2 給出一種由石英蓋玻片、帶有蝕刻微通道和微孔的玻璃板組成的簡單可重復使用的微流控芯片，圖2（a）為基于微流控芯片的單細胞表面增強拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）分析系統(tǒng)示意圖[11]，使用宮頸癌細胞（HeLa 細胞）作為模型癌細胞進行研究，然后采用SERS 來檢查活的癌細胞并評估細胞中銀納米顆粒（Silver Nanoparticles,Ag NPs）的數(shù)量及分布。結合細胞活力測定結果，將細胞中Ag NPs 的數(shù)量與細胞的毒性直接相關聯(lián)。圖2（b）為微流井的顯微圖像，可以看出單個細胞固定在微流井中。圖2（c）為每個細胞的NPs 數(shù)量和細胞活性與NPs 濃度的關系，從圖2（c）可以看出隨著NPs 濃度的增加，細胞活性降低，但NPs的數(shù)量增加也就意味著更高的細胞毒性。圖2（d）則為細胞的拉曼圖像。

圖2 基于光譜檢測法的光學傳感器[11，13]

除了檢測細胞活性，光譜檢測還可以用于測定離子的濃度[12]。圖2（e）為光譜檢測系統(tǒng)的耦合芯片詳細結構圖[13]。該耦合微流控芯片由反應芯片、氣體擴散芯片和檢測芯片組成，用于檢測NH4+的濃度。其中反應芯片由PDMS 組成，用于將NH4+轉化為NH3；氣體擴散芯片由兩片玻璃片和夾在玻璃片中間的一層PDMS材質的氣體透過膜組成，用于使NH3擴散進入待測溶液；檢測芯片使用多層結構將指示劑固定在其中。使用鋅卟啉作為指示劑，是因為鋅卟啉與NH3分子相遇會由綠色變成紫色，當周圍環(huán)境變成純水時，又能實現(xiàn)從紫色到綠色的逆變化，因此通過檢測光譜的變化就能得到NH4+濃度的變化。使用該微流控芯片為平臺，建立了一個光譜檢測系統(tǒng)，使用光譜儀作為分析儀器，通過測量450 nm 處的透射光譜強度變化△S，能夠實現(xiàn)對NH4+的定量測量，此外還對影響檢測結果的參數(shù)進行了研究。圖2（f）為NH4+濃度為20mg·L-1時光譜的時間響應，可以看出，變色過程大概有8 min，而復原過程則更慢，大約為變色過程的2 倍。指示劑的不同用量（1 mg、5 mg 和10 mg）情況下光譜強度變化與NH4+濃度的關系如圖2（g）所示，可以看出在NH4+濃度較低的情況下，三者的光譜變化差不多，但是隨著NH4+濃度的增加，5 mg 指示劑對應的光譜強度的變化最大，10 mg 的次之，因此5 mg 的指示劑為檢測的最佳選擇。

2.3 比色檢測法

比色檢測是光學生物傳感器最廣泛的技術之一，它具有操作簡單、檢測速度快、檢測精度高、靈敏度高和結果可視化等優(yōu)點。比色檢測利用被測物質本身的顏色或者是加入試劑反應后呈現(xiàn)的顏色變化，通過比較顏色深度以對被測物質進行分析。通常比色檢測中的檢測區(qū)域圖由掃描儀、手機攝像頭或CMOS 攝像頭直接收集，然后傳輸?shù)诫娔X或手機進行分析[14-15]。

使用噴漆技術可以用來制作紙基微流控芯片，該裝置使用氣溶膠噴漆來構建疏水屏障，并且使用簡單的打孔器獲得紙基的圖案層，這些改進的切割過程和疏水屏障的制造為紙基微流控芯片提供了一種便宜、簡單且適應性強的制作技術。圖3（a）中的Ⅰ和Ⅱ分別為2D 和3D 紙基微流控芯片噴涂制作工藝示意圖，Ⅲ為增加染料后的實物圖[16]。使用該噴漆式的紙基傳感器測定Fe2+的濃度，圖3（b）為藍色通道強度與Fe2+濃度之間的關系圖（濃度范圍為0～0.30 g/L），圖3（c）為低濃度時對應的線性擬合圖，可以看出，隨著Fe2+濃度的增加，藍色通道強度線性減小，且R2為0.9903，具有很強的相關性。文獻[16]還對影響鐵檢測靈敏度的參量進行了優(yōu)化，提出了一種用于Fe2+濃度檢測的紙基微流控芯片，具有低檢測限（0.0009 g/L）、良好的選擇性和可以接受的回收率等優(yōu)勢。

圖3 基于比色檢測法的光學傳感器[16]

除了噴漆的制作方法以外，蠟印技術也常被用于制作比色檢測的微流控芯片[17]。圖4 提出一種基于比色檢測方法的傳感器和基于掃描儀設備的紙基微流控芯片，用于確定乙酰膽堿酶（AchE）的活性和抑制劑篩選[18]。該紙基微流控芯片使用簡單的蠟印工藝制造，將蠟沉積在色譜紙的表面，然后加熱以形成疏水屏障[19-21]。在檢測過程中，5,5-二硫代雙的溶液和含有AchE 和乙酰硫代膽堿碘化物（ATC）的樣品被直接點在紙基微流控芯片上。該裝置顯示出對AchE 活性檢測的高靈敏度，因此在神經遞質活性量化方面具有顯著的應用潛力。同一課題組還提出了基于比色檢測方法和掃描儀設備的各種微流控芯片，分別用于分析lgG 抗體和葡萄糖。

除了基于顏色強度的比色分析，還有基于距離讀數(shù)的比色分析裝置[22]。圖4（a）為基于顏色強度的紙基裝置的制作過程，圖4（b）為基于距離讀數(shù)的紙基微流控芯片的制作過程。檢測原理是利用乳鐵蛋白對Fe3+的高親和力，乳鐵蛋白能夠從Fe3+復合物中置換指示劑，從而導致顏色變化。將復合物固定在紙基板上，復合物顆粒根據(jù)乳鐵蛋白濃度展示出顏色的變化。基于顏色強度的檢測裝置使用智能手機和顏色讀數(shù)應用程序對乳鐵蛋白進行定量分析，圖4（c）中分別為基于彩色掃描和智能手機的信號讀出以及乳鐵蛋白響應曲線?？梢钥闯?，在0～600 μg/mL 濃度范圍內，隨著乳鐵蛋白濃度的增加，色調值線性增加?；诰嚯x讀數(shù)的紙基微流控芯片根據(jù)彩色切片長度判斷乳鐵蛋白的濃度。圖4（d）為使用40 L 樣品溶液后裝置的彩色掃描圖以及距離和乳鐵蛋白濃度之間的關系，可以看出，在0～1000 μg/mL 范圍內，距離隨著乳鐵蛋白濃度的增加而線性增加。

圖4 基于比色檢測方法的蠟印工藝紙基微流控芯片[18-22]

3 電化學生物傳感器

電化學檢測的特點是靈敏度高、選擇性好、制作成本低、攜帶方便以及電力消耗低。因此，電化學檢測很適合采用微流控芯片，微流控電化學裝置使用的化學系統(tǒng)包括微電極、對流傳質、表面修飾電極、流動注射、信號放大、離子選擇性電極和離子交換膜等。此外，該類微流控芯片常用的材料包括PDMS、濾紙等。

3.1 PDMS 微流控芯片

使用PDMS 材料制作的微流控芯片能夠重復使用且可逆變形，不發(fā)生永久性破壞，而且具有彈性好、柔性好、電絕緣性好等優(yōu)點。用模型法高保真制備的微流控芯片能透過300 nm 以上的紫外可見光，耐用且價格低廉，但它不耐高溫，導熱系數(shù)低，表面改性的方法需進一步研究[23]。

為了檢測紅細胞（Red Blood Cell,RBC）和內皮細胞（Endothelial Cell,EC）之間的相互作用，文獻[25]提出了一種由電沉積制備的金柱陣列和集成檢測電極的微流控芯片。集成外泌體分離和分析平臺如圖5（a）所示，差分脈沖伏安響應及其線性結果分析如圖5（b）（c）所示。微流控芯片由具有兩個相鄰通道的PDMS 芯片和帶有嵌入式電極的聚苯乙烯底座組成，圖5（d）（e）分別為微流控芯片中PDMS 和聚苯乙烯底座的組裝圖和實物圖。內皮細胞可以通過紅細胞衍生的腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate,ATP）刺激釋放一氧化氮（Nitric Oxide, NO）。為了研究RBC-EC 之間的相互作用，將片上細胞固定，然后在單個微流控芯片中直接與紅細胞接觸檢測NO。利用格列本脲處理會抑制RBC 衍生的ATP 釋放，然后，使用曲前列環(huán)素處理會刺激紅細胞并釋放ATP。在圖5（f）中可以觀察到刺激和抑制RBC 釋放的兩個實驗結果的對比，其中，曲前列環(huán)素處理后的RBC 注射液會刺激內皮細胞并產生（1.80±0.20）nmol/L NO，格列本脲處理后的RBC 會產生（0.92±0.10）nmol/L NO。

圖5 基于PDMS 微流控的電化學生物傳感器[24-25]

3.2 紙基微流控芯片

基于紙基的微流控芯片以濾紙作為基材，使用蠟印刷、絲網印刷、光刻和化學氣相沉積等技術制作而成。由纖維素構成的濾紙表現(xiàn)出親水特性，所以允許水溶液通過濾紙的纖維層。與傳統(tǒng)的玻璃和聚合物基板微流控芯片相比，紙基微流控芯片具有許多實際優(yōu)勢，包括成本較低、制作過程簡單、毛細管作用強和良好的生物相容性等。因此，紙基微流控芯片越來越多地應用于生物醫(yī)學、環(huán)境、臨床診斷、食品加工和化學工業(yè)領域[26]。

近年來，可以看到很多基于折紙方法做成的紙基傳感器。圖6（a）為紙基微流控示意圖，實驗提出了一種在纖維素紙裝置中使用鎂作為陽極的紙基微流控原電池[44]。添加一滴水的原電池可以在一段時間內以一定的電位/電流運行，并持續(xù)運行到水徹底蒸發(fā)。采用蠟印刷技術制造紙基微流控芯片，使用蠟打印機打印到濾紙上，將芯片放置在熱板上形成3D疏水屏障以控制液體流動。該紙基微流控芯片實物如圖6（b）（c）所示。圖6（d）～（g）顯示了紙基微流控原電池的性能結果。通過優(yōu)化電解質的量，使電池的開路電勢最大，如圖6（d）所示；MgCl2的最終優(yōu)化量為3.33 mg，AgNO3為3.57 mg，見圖6（d）中的虛線框。根據(jù)圖6（e）所示，在放入80 mL 蒸餾水后，單個原電池的開路電位在1 h 內保持在2.2 V。圖6（f）顯示了持續(xù)1 h 的放電曲線有300 μA 的恒定電流。將80 mL 的蒸餾水裝入紙片頂部的入口后，電位立即升高，電位保持在1.6 V。圖6（g）中紅色發(fā)光二極管（Light-Emitting Diode,LED）至少需要50 μA 才能點亮，但電壓降低到1.5 V 左右，同時電流緩慢降低，紅色LED 也能被成功點亮。另外，為了證明此原電池的可行性，還使用該裝置結合發(fā)光二極管對堿性磷酸酶進行了熒光檢測。

圖6 紙基微流控電池[27]

除了折紙以外，還有很多種制作紙基微流控芯片的方法，比如絲網印刷、噴墨打印、蠟印等。圖7（a）為使用絲網印刷工作電極（Screen Printing Electrode,SPWE）的紙基微流控芯片制作過程，包括絲網印刷工作電極的制作過程和參比電極的制作過程[28]。文獻[28]提出了一種使用絲網印刷工作電極的高靈敏度無標簽紙基電化學免疫傳感器，用于癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）的檢測。為了提高檢測靈敏度并固定抗癌胚抗原，合成了氨基功能石墨烯/硫氨酸/金納米粒子納米復合材料并涂覆在絲網印刷工作電極上。免疫傳感器的檢測依賴于抗體-抗原免疫復合物的形成，硫氨酸的反應電流與相應抗原的濃度成正比。免疫測定法能夠測定50～500 pg/mL 濃度范圍內的CEA 溶液，并且電流隨著濃度的增加而線性減小，實驗結果如圖7（c）（d）所示。另外所提出的免疫傳感還可以用于測定臨床血清樣品，這種新型紙基電化學免疫傳感器可以為癌癥檢測提供一種低成本、高靈敏的即時診斷新平臺。此外帶有滴鑄電極的絲網印刷生物傳感器可用于檢測啤酒樣品中的乙醇[29-31]。在該裝置中，由炭黑和普魯士藍納米粒子組成的納米復合材料用作電催化劑來檢測醇氧化酶和乙醇之間的酶促反應產生的過氧化氫。該傳感器能夠定量檢測乙醇的濃度，最高檢測濃度達到10 mmol/L，靈敏度為9.13 μA·cm2/（mmol·L-1），檢測限為0.52 mmol/L。

圖7 無標記紙基微流控電化學傳感器[28-31]

圖7（b）為離子選擇性電極裝置的制備過程，使用濾紙作為基底的材料，進行噴蠟打印后，通過在濾紙上滴涂導電碳漿以及Ag/AgCl 漿，分別制成了固態(tài)聚合物膜鈣離子選擇性指示劑和參比電極，形成了紙芯片離子選擇性電極系統(tǒng)。對離子載體的含量和離子選擇性敏感膜的厚度進行了優(yōu)化，同時也對參比電極的穩(wěn)定性和指示電極的選擇性進行了研究。以0.5 mol/L NaCl 模擬海水為背景，檢測紙芯片離子選擇性電極系統(tǒng)的電位響應性能，實驗結果如圖7（e）所示。結果表明該系統(tǒng)在1×10-4～3×10-2mol/L CaCl2濃度范圍內，隨著濃度的增加，電位響應也隨之線性增加。

4 基于微流控芯片的射頻生物傳感器

4.1 用于生物細胞生長檢測的射頻諧振器

微流控技術可以將樣品檢測的多個實驗步驟集中在一個小芯片上進行，也可以實現(xiàn)器件的小型化。微流控芯片具有體積小、響應速度快、自動化程度高、集成度高的特點，這為開發(fā)高成本、緊湊型器件提供了可能性[32]。目前，許多有效的檢測技術已經在微流控器件中得到了證實，包括光電化學方法[33]、熒光檢測方法[34]和光學方法[35]。

然而，它們也有一些固有的檢測限制，比如，在液體環(huán)境中靈敏度低和使用光學標記會破壞生物樣品。相反，微波技術具有非侵入性、高靈敏度和快速傳感的優(yōu)勢，可作為一個突出的候選技術。目前，由聚苯乙烯薄膜與固定化微生物細胞和微波電動力學諧振器組成的傳感器可以對固定化細胞大腸桿菌的相互作用進行研究[36]。此外，有研究開發(fā)了一種快速、靈敏、自動檢測沙門氏菌的微流體生物傳感器，在該結構中金屬有機框架通過模擬過氧化物酶活性來放大生物信號，并結合自行開發(fā)的軟件來分析彩色圖像，從而可以獲得樣品的最低檢測限[37]。

感染診斷和抗生素敏感性試驗是耗時且費力的臨床實踐。而利用微波微流控生物傳感器可用于快速、非接觸和無創(chuàng)檢測不同pH 培養(yǎng)基中大腸桿菌的濃度和生長[38]，進而提高了臨床微生物實驗的有效性。微流體通道與微波諧振器之間的薄層接口提高了檢測的靈敏度。將細菌樣品注入到采用標準軟光刻技術制作的微流控芯片中，然后利用該微波傳感器檢測細菌的濃度和生長。通過篩選微波系統(tǒng)的共振振幅和頻率響應的變化，檢測不同pH 溶液中不同濃度的細菌。從實驗結果中觀察到，在不同pH 值的條件下，器件的響應變化與細菌濃度表現(xiàn)出良好的線性關系。

微流控芯片使用雙面膠帶固定在諧振器上，結構如圖8（a）所示[39-40]。通過觀察S21參數(shù)可獲得不同濃度的細菌在不同pH 水平下的共振頻率和振幅。在測量過程中，盡量保持每隔1 min 進行一次測量，以確保細菌液在芯片內的均勻分布。諧振腔有源區(qū)域上方微流控腔內pH=6 溶液的OD600 值與共振振幅和共振頻率的線性關系如圖8（d）所示。

微波發(fā)夾生物傳感器是由PDMS 和負光刻膠組成的微流控芯片[41]，采用微機電系統(tǒng)（Micro-Electro-Mechanical System, MEMS） 技術對液體介質中的B16F10 黑色素瘤細胞進行捕獲、測量和分析。該傳感器由2 個發(fā)夾形半波長步進阻抗諧振器構成，用于液體和細胞檢測，實物如圖8（c）所示。發(fā)夾諧振器是由2條或多條具有不同特征阻抗的傳輸線組成的橫向電磁場（Transverse Electric and Magnetic Field,TEM）或準TEM 模式諧振器。傳感區(qū)域定義在耦合區(qū)域，為了滿足微通道對細胞運輸和捕獲的需求，對耦合區(qū)域的尺寸進行優(yōu)化，最后得到基于微流控的發(fā)夾諧振器生物傳感器和負性光刻膠細胞俘獲結構的照片，如圖8（c）所示。S 參數(shù)是網絡分析中常用的參數(shù)，其中，S11和S21分別表示網絡阻抗失配引起的反射和傳輸特性。通過使用一對耦合微波諧振器來產生用于細胞檢測的共振，這些共振是由耦合區(qū)域的介電特性決定的。隨著耦合區(qū)域介電特性的改變，共振的大小也隨之改變。通過S 參數(shù)可以觀察和分析共振的變化。圖8（e）（f）顯示了不同細胞數(shù)量引起的S21和S11的變化，圖中DMEM 指細胞培養(yǎng)基。隨著細胞數(shù)量的增加，S11的衰減減小，而S21無明顯變化。顯然，S11共振峰的變化比S21的更清晰可辨。因此，在后續(xù)的分析中，可以通過觀察S11的響應來檢測細胞的介電特性變化。

圖8 用于細胞生長監(jiān)測的微流控射頻生物傳感器[39-40]

目前存在的問題是，該發(fā)夾諧振傳感器雖然在生物細胞分析方面有潛力，但靈敏度有限。為了提高靈敏度，電極的尺寸需要縮小并進行微調以匹配電池的尺寸。電極尺寸的減小也會降低DMEM 的影響。此外，本實驗中捕獲的細胞僅由流體控制，很難控制細胞的數(shù)量，也很難從懸浮細胞中選擇特定類型的細胞，因此需要一種新的捕獲方法來減少捕獲時間并選擇不同類型的細胞。

4.2 用于溶液濃度檢測的射頻天線

為了測量小體積的液體生物樣品設計了一種由印刷電路板（Printed Circuit Board, PCB）和PDMS 制成的微流控通道集成射頻諧振器[42]。該傳感器包含一個叉指電極（Interdigital Electrode,IDE）結構和一個穩(wěn)健流體端口的真空動力樣品輸送系統(tǒng)，用于檢測水中125～155 mmol/L 的NaCl 含量，這是健康人血漿中的典型濃度。

叉指電極結構的優(yōu)點是它可以在一個相對較窄的頻帶內提供多個共振并且能夠使用較小的占地面積將結構共振調到測量頻帶。傳感器原理如圖9（a）所示，該傳感器使用不同濃度的水-異丙醇溶液進行測試，并使用微升體積的樣品檢測生物范圍內的生理鹽水濃度。圖9（b）顯示了在IDE 區(qū)域的強電場耦合[43]。該傳感器由印刷電路板制成，使用數(shù)控機床切割PCB并打孔，在角落上做對準標記。激光器利用對準標記在PCB 上制作IDE 結構和傳輸線，將微流控的入口、出口和一個母型SMA 連接器通過焊接連接到基板上。通過模具復制和浸涂技術與PDMS 相結合制造的流體通道如圖9（c）中橙色線所示。采用異丙醇-水樣品對該傳感器進行了表征，該傳感器在第二次共振和第三次共振時表現(xiàn)出了最佳的性能。圖9（d）～（f）顯示了傳感器測量結果與線性擬合曲線的對比，這些數(shù)據(jù)可作為異丙醇測量的線性擬合校準曲線。

圖9 用于溶液濃度檢測的微流控射頻生物傳感器[43]

另一種用于測量水溶液中葡萄糖濃度的實時無創(chuàng)微波微流控傳感器是由互補開環(huán)諧振器（Complementary Split Ring Resonator,CSRR）的開放式微帶傳輸線制成[44-45]。CSRR 在共振時具有非常強的電場濃度，這對介質樣品加載非常敏感[46]。在傳感器上集成一個微流控通道，利用該微流控通道將葡萄糖溶液輸送到設備的敏感區(qū)域，然后觀察反射系數(shù)S11和共振頻率的偏移。最后，利用共振頻移和Δ|S11|對葡萄糖-水溶液的測量結果建立了數(shù)學模型，使用該研究開發(fā)的傳感模型就可以檢測血糖水平。圖10（a）（b）分別給出了制作完成的該射頻生物傳感器的頂部和底部視圖[47]。圖10（c）展示了用于測量和驗證的測試裝置的照片以及安裝微流控通道和聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl Methacrylate,PMMA）框架后的傳感器原型，其中傳感器連接到VNA，用于測量S11。

為了校準傳感器并建立數(shù)學模型來測量水溶液中的葡萄糖濃度，首先使用0 mg/mL、10 mg/mL、30 mg/mL、50 mg/mL 和70 mg/mL 葡萄糖濃度的液體樣品對傳感器進行測試，并記錄每個樣品的反射系數(shù)，圖10（d）顯示了這組測試樣品的生物傳感器測量的反射系數(shù)。測量的頻率范圍為2.4～2.6 GHz，包含801 個數(shù)據(jù)點。由于傳感器在諧振時的質量因子Q 較高，因此在不同的測量中，測量曲線很容易區(qū)分。通過增加溶液中葡萄糖的濃度，傳感器的共振頻率向上移動。頻率偏移還會導致固定頻率2.48 GHz 處的S11水平發(fā)生變化，該頻率是蒸餾水的諧振頻率。共振頻率隨葡萄糖濃度的偏移如圖10（e）所示，其中蒸餾水被視為參考樣品。此外，在2.48 GHz 時，反射水平變化Δ|S11|隨葡萄糖濃度的變化如圖10（f）所示。結果表明，共振頻率的偏移與溶液中葡萄糖濃度呈線性關系。然而，在考慮的濃度范圍內，S11水平的變化與葡萄糖濃度呈非線性關系，圖10（e）（f）中的點是通過重復測量10次得到的。利用葡萄糖濃度與測量的共振頻移和S11水平的回歸分析，為所設計的生物傳感器開發(fā)了一個數(shù)學傳感模型。

圖10 用于葡萄糖濃度檢測的微流控射頻生物傳感器[47]

4.3 用于小分子檢測的電磁超材料

通過將一個微小的微流控通道放置在雙間隙的亞原子分裂環(huán)諧振器的間隙中，然后利用集成的PDMS 微流控傳感器的超原子開環(huán)諧振器（Split Ring Resonator,SRR）可以檢測液體樣品的介電特性。內置的微流體傳感通道在SRR 間隙的內部，因為該區(qū)域對介電變化非常敏感。該傳感器根據(jù)被測諧振頻率和峰值衰減的變化來確定液體樣品的復介電常數(shù)。圖11（a）顯示了該微流控傳感器的主要組成部分——超原子SRR 傳感器結構[48-49]。雙間隙SRR 設計使得微流通道可以直接通過如圖11（a）所示的電磁傳感結構，實現(xiàn)集成的超表面SRR 傳感器，從而提高靈敏度。使用自由空間測量系統(tǒng)，SRR 傳感器陣列被放置在2 個喇叭天線之間，這些喇叭天線永久連接到矢量網絡分析儀的2 個端口，因此，傳感測量過程無需與傳感器直接連接任何微波測試電纜。該生物傳感器測量了不同濃度的水-甲醇混合物得到共振頻率和峰值衰減的傳輸響應，結果具有較好的準確性，如圖11（c）所示。

此外，實驗表明，基于微流體陣列的超材料諧振器可以實現(xiàn)對不同大小的微粒有選擇性地捕獲和檢測。將超材料傳感的概念擴展到“捕獲和傳感”，通過在分裂間隙附近設計梯形結構，使微粒能夠在每個SRR 的劈裂間隙區(qū)域捕獲。該微流體超材料傳感器能夠根據(jù)工作在太赫茲光譜區(qū)域共振模式的透射振幅和共振頻率的變化來感知不同折射率的微粒子。該方法利用了微流體、超材料和太赫茲技術的優(yōu)勢，形成了一個理想的平臺，用于超敏感、無標簽、遠程和非破壞性的微物質檢測。

圖11（d）顯示了用于微粒選擇性捕獲和傳感的微流體超材料傳感器裝置的原理。超材料諧振腔選用了分裂環(huán)形諧振腔結構。在這種設計中，微?？梢酝ㄟ^位于SRR 電容間隙的2 個梯形結構之間的液體流動被困在空槽中。然而，一旦1 個粒子被困住，2 個梯形之間的流動阻力就會增加，從而導致后面的液體會繞過該槽，這就確保了只有1 個粒子被捕獲在SRR 的電容間隙中，所以這是定量估計被捕獲微粒的關鍵。將SRR 結構周期性地排列成蜂窩狀的超材料結構，然后利用三維電磁仿真軟件對該結構進行模擬，從而研究粒子俘獲對SRR 超材料共振傳輸響應的影響。在1.04 THz處設計了無陷波結構的平面SRR 的LC 基模諧振，4 種條件下的太赫茲透射譜如圖11（e）所示。使用直徑為20 μm 的聚苯乙烯顆粒作為粒子進行捕獲和探測的演示。用純異丙醇（Iso-Propyl Alcohol,IPA）填充通道后，用注射泵注入懸浮在IPA 溶液中的聚苯乙烯顆粒。從光學顯微鏡觀察到，15%的SRR 被隨機排列的顆粒所占據(jù)。然后測量顆粒在IPA 溶液中的透射光譜，并在0.92 THz 處觀察到共振傾斜，見圖11（f）。實驗結果表明，在含聚苯乙烯顆粒和不含聚苯乙烯顆粒的情況下，超材料傳感器的諧振頻移均達到10 GHz。共振偏移是由于聚苯乙烯相對于IPA 的低折射率引起的。由于發(fā)射信號是每個超原子的集體響應，捕獲粒子的SRR 數(shù)量的減少也導致共振強度的降低。超材料諧振器的多功能性，以及在低能太赫茲光譜范圍內操作的微流體的選擇性捕獲功能，將為太赫茲和紅外頻率下的無標記檢測、生物分子傳感和微粒子定量開辟新的研究機會。

圖11 用于小分子檢測的電磁超材料微流控生物傳感器[48-49]

另一種常用于小分子檢測的是基于化學物質固有介電特性的低成本紙基傳感器。該傳感器基于每個諧振器的電容變化對其共振位移的影響實現(xiàn)最終檢測，設計的新穎之處是在常見的紙基板上實現(xiàn)了超材料。在室溫下，利用打印機制作紙基電磁超材料生物傳感器的流程如圖12（a）所示[50]。選擇打蠟的色譜紙，在打蠟和未打印區(qū)域分別留下疏水和親水區(qū)域。蠟印后，基材被加熱，使蠟能滲透到紙的另一邊，形成一個液體無法滲透的區(qū)域。這種蠟基紙圖案可以創(chuàng)建微流控通道，這樣液體樣品可以通過自然毛細管的作用傳輸?shù)揭r底上的超材料陣列中的每個諧振器的電容間隙。然后采用CO2切割機在聚酰亞胺膠帶上切割出與諧振腔單元對應的周期性設計圓的模板，粘在襯底紙上，并在靠近微流控通道的蠟紙上對齊。聚酰亞胺片粘在蠟紙上之后，整個空間再使用AG-510 銀導電油墨進行銀墨繪制。最后，聚酰亞胺片剝離紙留下的圓形導電銀部件在蠟區(qū)域合成。電磁超材料的單元格如圖12（b）所示，并列出了相應結構的關鍵尺寸。圖12（c）顯示了導電部件的不均勻性，可以證明實驗透射光譜的展寬是合理的。電磁超材料的諧振頻率偏移如圖12（d）所示，其與化學物質的介電常數(shù)呈線性趨勢，說明該傳感器可以用于生物標志物濃度的檢測。

圖12 用于小分子檢測的電磁超材料紙基生物傳感器[50]

5 挑戰(zhàn)和展望

盡管微流控芯片與生物傳感器的結合在實際診斷和即時檢測（Point-of-Care Testing,POCT）應用方面有許多優(yōu)勢，但仍然存在許多重大挑戰(zhàn)需要克服。比如，滯留和蒸發(fā)的問題會導致樣品在運輸過程中產生損失。光學生物傳感器和電化學生物傳感器檢測過程中使用的試劑，例如酶、抗原和抗體，必須能夠承受運輸和儲存過程中的惡劣環(huán)境。此外，光學生物傳感器環(huán)境適應性差，雖然選用激光光源可以有所改善，但不在密封環(huán)境中使用就很容易被污染導致失效。另外電化學生物傳感器主要的缺點在于對溫度比較敏感、壽命短而且容易與其他待測液體發(fā)生交叉感染，而且光學生物傳感器和電化學生物傳感器都需要使用酶和被測物質反應來進行檢測。

基于超材料的結構可以提供高質量因子并實現(xiàn)小型化。近十年來，業(yè)界開發(fā)了基于超材料的化學傳感器，但這些射頻傳感器沒有使用微流控技術。由于缺乏微流控通道，在測試過程中實驗樣品暴露在大氣環(huán)境下從而產生生物污染。而集成射頻傳感器的微流控技術徹底改變了傳感技術，利用該技術只需要對微升或納升體積的樣本進行測試，這對于昂貴液體樣品的檢測不失為一個好的解決辦法。微流體通道由生物相容性材料制成，從而可以保證待測樣品的安全性。為了保護基材以及微流控通道與基材的結合，采用先進的材料、涂層和膠膜構建了穩(wěn)定的結構。一般來說，微流控通道是使用低成本材料和簡單的制作過程來實現(xiàn)的。

大多數(shù)基于微流控芯片的微波生物傳感器不能進行實時監(jiān)測，因為它們不能作為獨立的系統(tǒng)工作，除非連接讀數(shù)電路或分析設備，如VNA 和頻譜分析儀等。盡管VNA 在識別生物傳感信息方面是準確的，但它們價格昂貴且笨重。所有這些缺點使得它們不適合便攜式設備和實時測量的情況，例如POCT 應用場景。為了實現(xiàn)一個完整的集成微系統(tǒng)，不僅需要對傳感器進行集成，還需要對分析和測試部分進行集成。通常微波器件定制的檢測電路精度和靈敏度與商用VNA 相當，主要由3 個子系統(tǒng)組成：信號發(fā)生器、功率耦合單元和增益檢測器。微系統(tǒng)集成是實現(xiàn)小型化和便攜式的重要途徑。展望未來，下一代基于微流控芯片的微波生物傳感器應該是完全集成的設備，能夠在POCT 應用中提供準確和自主的診斷，而不需要借助實驗室分析。未來的發(fā)展方向是解決存在的問題并向超小型高集成度射頻傳感器、可穿戴設備、非侵入式、實時監(jiān)測的方向發(fā)展。此外，此類生物傳感器如果能與智能手機進行集成，在日常生活中也將具有巨大的應用潛力。

6 結論

本文回顧了近年來以光學、電化學和微波為技術代表的3 類生物傳感器的研究進展，綜述其在生物和醫(yī)學領域的應用。以上傳感器通過與微流控芯片的結合構建了高靈敏性、可重復和便攜的檢測系統(tǒng)。其中，微波傳感器由于具有高靈敏度、快速響應和非侵入性檢測的特點，進一步與微流控芯片進行集成是一個新的研究熱點。該技術目前仍處于早期階段，還需要多學科交叉融合發(fā)展，以及在生物醫(yī)學、生命健康等領域的多功能、便攜式、實時和現(xiàn)場檢測設備的開發(fā)。