基于便攜式拉曼高光譜成像技術(shù)的散裝奶粉中硫脲可視化現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法研究

楊巧玲，陳 沁，鈕 冰，鄧曉軍，馬金鴿，古淑青，于永愛, 郭德華，張 峰

1. 上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444 3. 上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135 4. 上海如海光電科技有限公司，上海 201201 5. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176

引 言

近十年來，“三聚氰胺毒奶粉”事件使乳制品的質(zhì)量安全成為消費(fèi)者和科學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)，并促使相關(guān)部門建立對(duì)乳制品質(zhì)量進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)管措施[1]。 乳制品的進(jìn)口量呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。 2010年—2019年間，乳制品年均復(fù)合增長(zhǎng)率達(dá)16.5%，其中2020年散裝奶粉進(jìn)口量達(dá)131.0萬t，同比增長(zhǎng)10.2%[2]。 而進(jìn)口奶粉中的蛋白摻假事件近期也屢有發(fā)生，如2013年新西蘭進(jìn)口奶粉中檢出雙氰胺污染[1]。 面對(duì)乳制品質(zhì)量安全的嚴(yán)格管控以及大批次散裝奶粉的進(jìn)口通關(guān)，口岸現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)管只能采用隨機(jī)抽樣后送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的方式，監(jiān)管流程長(zhǎng)效率低，缺乏現(xiàn)場(chǎng)快速實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)的技術(shù)手段。

硫脲是一種含氮量高的重要化工原料，常用于制造樹脂、 染料、 壓塑粉、 橡膠的硫化促進(jìn)劑等。 而在食品領(lǐng)域，非法商家使用硫脲增加奶粉的表觀蛋白質(zhì)含量。 研究表明，長(zhǎng)期接觸或食用硫脲會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞減少、 甲狀腺功能減退以及其他甲狀腺類疾病[3]，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署[4]和國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)[5]將硫脲及其衍生物分類為對(duì)人類有毒和致癌的物質(zhì)。 目前食品、 污水、 空氣、 土壤中硫脲的檢測(cè)主要有高效液相色親法[6]、 比色法[7]、 傅里葉變換紅外光譜法[8]等。 舒友琴等[6]用高效液相色譜法成功對(duì)面粉中的硫脲進(jìn)行定量分析，樣品的檢出限和定量限分別為1.2和4.0 mg·kg-1。 現(xiàn)有的檢測(cè)方法普遍存在前處理復(fù)雜、 檢測(cè)成本高、 周期長(zhǎng)、 效率較低等問題，不適用于口岸現(xiàn)場(chǎng)大批次樣品中硫脲的快速篩查。

近年來，基于光譜成像的可視化無損快檢方法發(fā)展迅速，如近紅外光譜成像技術(shù)、 拉曼光譜成像技術(shù)、 傅里葉變換紅外光譜成像技術(shù)等。 這些技術(shù)能同時(shí)獲得樣品的光譜特征和圖像信息，具有無損、 快速、 可視化等優(yōu)點(diǎn)[9]，廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量安全領(lǐng)域如非法添加物的檢測(cè)[10]、 營(yíng)養(yǎng)成分的鑒定[11]、 摻偽物質(zhì)的篩查[12]等。 其中點(diǎn)掃描拉曼光譜成像是拉曼光譜技術(shù)和點(diǎn)掃描成像技術(shù)的結(jié)合，通過采集空間中每個(gè)像素點(diǎn)的拉曼光譜信息，將分子信息在空間上展現(xiàn)，并定性、 定量、 定位地分析物質(zhì)分子。

本工作采用自主搭建的便攜式點(diǎn)掃描二維拉曼高光譜成像儀器對(duì)不同濃度梯度(0.005%～2.000%)的硫脲奶粉混合物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合自主研發(fā)的軟件系統(tǒng)，對(duì)硫脲進(jìn)行在線實(shí)時(shí)的定性、 定量和污染物分布分析，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)奶粉中硫脲的濃度。 本研究為開發(fā)快速、 無損、 可視化檢測(cè)奶粉中非法添加物提供技術(shù)支持，可應(yīng)用于口岸現(xiàn)場(chǎng)散裝奶粉的通關(guān)檢測(cè)，確保進(jìn)出口奶粉質(zhì)量品質(zhì)檢測(cè)的科學(xué)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品與試劑

檢測(cè)所用樣品為奶粉(市售奶粉)，試劑為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%； 購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 便攜式點(diǎn)掃描拉曼高光譜顯微系統(tǒng)

硬件裝置主要由高精度定位掃描裝置、 光學(xué)顯微鏡平臺(tái)、 拉曼光譜儀模塊三部分組成，如圖1所示。 高精度定位掃描裝置由一個(gè)定位精度優(yōu)于5 μm的二維微區(qū)定位電動(dòng)平臺(tái)和一個(gè)最小步長(zhǎng)為0.1 μm的電動(dòng)對(duì)焦平臺(tái)組成。 光學(xué)顯微鏡使用無限遠(yuǎn)校正物鏡，方便在顯微鏡光路中插入拉曼光譜儀模塊。 拉曼光譜儀模塊通過一個(gè)分束器與顯微鏡光路結(jié)合，拉曼探頭發(fā)射的平行光束通過分束器反射后經(jīng)顯微物鏡聚焦于樣品，用CMOS相機(jī)可以觀察到激光光斑和樣品的成像。 點(diǎn)掃描激光器的激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，最大輸出功率為600 mW，譜寬0.076 nm，對(duì)應(yīng)的拉曼成像光譜儀采集范圍為200～3 200 cm-1，光譜分辨率為0.7 nm； 電動(dòng)載物平臺(tái)的最大速度為20 mm·s-1，定位精度≤±5 μm，最小步長(zhǎng)為0.1 μm； CMOS相機(jī)的分辨率為2 048×1 536，采集的像素點(diǎn)尺寸為3.2×3.2。 采集高光譜圖像時(shí)，點(diǎn)激光經(jīng)二向色鏡反射到樣本表面，CMOS相機(jī)和光譜儀采集對(duì)應(yīng)點(diǎn)的樣本數(shù)據(jù)，隨著電動(dòng)載物臺(tái)沿X和Y軸移動(dòng)最終完成整個(gè)樣本的掃描。

軟件系統(tǒng)為自主研發(fā)的拉曼高光譜信息采集軟件，可以控制電動(dòng)載物臺(tái)的平移、 調(diào)整拉曼高光譜采集參數(shù)、 切換拉曼光譜預(yù)處理方式等，同時(shí)還具有數(shù)據(jù)庫相似度匹配功能，對(duì)盲樣物質(zhì)進(jìn)行初步的定性判別。 本實(shí)驗(yàn)中的采集參數(shù)為激光功率300 mW，積分時(shí)間1 000 ms，此時(shí)完成一種質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣本的數(shù)據(jù)采集需要約6 min。

圖1 點(diǎn)掃描二維拉曼光譜成像系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of point scanning two-dimensional Raman spectroscopy imaging system

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

樣本分為拉曼信號(hào)穿透厚度檢測(cè)的雙層樣本和硫脲含量測(cè)定的奶粉混合樣本，樣本制備過程如圖2所示。 圖2(a)為穿透深度檢測(cè)中樣本制備模具，體積75 mm×25 mm×8 mm，中央的樣本盛放池尺寸24 mm×24 mm×7 mm，中間鏤空的圓洞直徑14 mm，金屬墊片體積為24 mm×24 mm×1 mm。 通過增減金屬墊片的數(shù)目可以調(diào)整樣本盛放池的深度，鏤空的圓洞方便金屬墊片的拿取。 圖2(b1)為雙層樣本，上層為奶粉，下層為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品，制備過程中在樣本盛放池底部放一個(gè)金屬墊片，加入1 mm厚度的硫脲標(biāo)準(zhǔn)品粉末，鋪上奶粉層進(jìn)行高光譜采集，保持硫脲標(biāo)準(zhǔn)品厚度不變，依次增加金屬墊片的數(shù)目，控制奶粉層的厚度，直至奶粉層與樣本盛放池頂部平齊，完成拉曼信號(hào)在奶粉層的穿透厚度檢測(cè)。

圖2 樣本制備示意圖(a)： 雙層樣本所需模具圖；(b1)： 雙層樣本圖； (b2)： 混合樣本圖Fig.2 Schematic diagram of sample preparation(a): Mold drawing required for double-layer sample;(b1): Double-layer sample drawing; (b2): Mixed sample drawing

根據(jù)硫脲標(biāo)準(zhǔn)品拉曼信號(hào)在奶粉層中穿透厚度的檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室定制了一種鋁合金材質(zhì)的樣本檢測(cè)模具用于制備硫脲奶粉混合樣本。 樣本檢測(cè)模具體積為24 mm×24 mm×2 mm，樣本盛放池尺寸為24 mm×24 mm×1 mm，硫脲奶粉混合樣本制備如圖2(b2)所示。 實(shí)驗(yàn)制備硫脲奶粉混合樣本共11份，濃度(W/W)范圍為0.005%～2.000%，每份樣本質(zhì)量為1 g。 制備樣本前，用研缽將奶粉和硫脲標(biāo)準(zhǔn)品顆粒分別研磨2 min，稱量取樣，倒入5 mL離心管中，渦旋5 min得到硫脲奶粉混合樣本。 高光譜采集時(shí)，一份相同添加濃度的奶粉混合樣本分三次放入樣本盛放池中，用載玻片刮平表面，樣本放在電動(dòng)平移臺(tái)上重復(fù)采集三次，光譜數(shù)據(jù)平均求和得到感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的拉曼高光譜信息。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理與分析

點(diǎn)掃描拉曼高光譜顯微成像系統(tǒng)采集的信息是含有2 048個(gè)波段的三維數(shù)據(jù)，為了減小高光譜數(shù)據(jù)處理的運(yùn)算量，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后再進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)處理流程如下：

(1)單光譜有效數(shù)據(jù)截取。 從2 048個(gè)波段中提取921個(gè)有效波段(330～2 199 cm-1)進(jìn)行處理，波段選取在軟件UspectralPlus5.1.0(上海如海光電科技有限公司研發(fā))中完成。

(2)光譜平滑和熒光背景去除。 利用軟件系統(tǒng)中的Whittaker平滑方法[13-14]和自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘算法[15](adaptive iteratively reweighted penalized least squares，airPLS)消除背景隨機(jī)噪音信號(hào)和熒光背景干擾。

(3)峰值識(shí)別。 提取硫脲特征峰[(732±5) cm-1]處的全部拉曼光譜數(shù)據(jù)，按照感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的采集方向，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行10×10矩陣的重新排列。

(4)空間多維光譜組裝和可視化。 將奶粉在732 cm-1(±5 cm-1)波數(shù)處的最大拉曼強(qiáng)度值設(shè)為閾值。 當(dāng)像素點(diǎn)在732 cm-1波數(shù)處的拉曼強(qiáng)度高于閾值判定為硫脲顆粒并在二值圖像上用黑紅色顯示，低于閾值判定為奶粉背景用白色顯示，得到感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的二值圖像，通過二值圖像可以清晰地展示出硫脲顆粒的檢出情況和空間分布。 單波段圖像二值化處理過程在軟件Prism8.0(GraphPad Software .USA)中進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 點(diǎn)掃描拉曼高光譜成像儀器的采集參數(shù)確定

分別以固態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品硫脲和奶粉為樣品，在不同的激光功率和積分時(shí)間下，采集拉曼光譜，結(jié)果圖3所示。 不同激光功率、 積分時(shí)間下硫脲的拉曼原始光譜圖如圖3(a)所示。 由圖可知，隨著激光功率和積分時(shí)間的增加，硫脲標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼特征峰不斷增強(qiáng)，當(dāng)積分時(shí)間為1 000 ms，積分功率分別為400和500 mW時(shí)，475 cm-1處的峰強(qiáng)度值達(dá)到最大值[圖3(a2)]，由于信息溢出會(huì)影響拉曼特征峰強(qiáng)度的準(zhǔn)確判斷，故選擇硫脲標(biāo)準(zhǔn)品的最佳采集參數(shù)為激光功率300 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。

圖3 不同積分時(shí)間、 激光功率下硫脲和奶粉的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of thiourea and milk powder under different integration time and laser power

不同激光功率、 積分時(shí)間下奶粉的拉曼原始光譜圖如圖3(b)所示。 由圖可知，奶粉的拉曼特征峰強(qiáng)度隨著激光功率和積分時(shí)間的增加而增強(qiáng)，且未出現(xiàn)信號(hào)值飽和現(xiàn)象，由于拉曼特征峰強(qiáng)度越高越有利于特征峰辨別和數(shù)據(jù)處理，對(duì)比圖3(b1)和(b2)可知，采集奶粉的最佳儀器參數(shù)是激光功率500 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。 綜合考慮，點(diǎn)掃描二維拉曼光譜儀器采集硫脲奶粉混合樣本的最佳參數(shù)為激光功率300 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。

2.2 硫脲拉曼信號(hào)在奶粉層的穿透厚度分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置雙層樣本，上層為奶粉，下層為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品，奶粉厚度分別為0，1，2，3，4和5 mm。 利用點(diǎn)掃描拉曼光譜成像儀器分別采集雙層樣本表面拉曼光譜信息以及24 mm×24 mm區(qū)域內(nèi)10×10個(gè)像素點(diǎn)的高光譜信息，結(jié)果如圖4和圖5所示。 雙層樣本表面的拉曼光譜信息如圖4所示，由圖可知，隨著奶粉厚度的增加，732 cm-1的強(qiáng)度值越來越低，說明激光的能量在穿透奶粉的過程中不斷被削弱，當(dāng)奶粉厚度為2 mm時(shí)，特征峰732 cm-1基本消失，此時(shí)無法檢測(cè)到下層硫脲的拉曼信息。

圖4 不同奶粉厚度下雙層樣本表面拉曼光譜圖(n=3)Fig.4 Raman spectra of double-layer samples with different milk powder thickness (n=3)

雙層樣本的拉曼高光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過二值化處理后得到二值熱圖，結(jié)果如圖5所示。 由圖可知，隨著奶粉厚度的增加，感興趣區(qū)域內(nèi)含硫脲的像素點(diǎn)數(shù)目即硫脲檢測(cè)點(diǎn)越來越少，當(dāng)奶粉厚度為1 mm時(shí)，硫脲檢測(cè)點(diǎn)數(shù)目為100，當(dāng)奶粉厚度大于2 mm時(shí)，硫脲的檢出概率低于100并不斷降低，說明在本實(shí)驗(yàn)參數(shù)下，硫脲標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的拉曼信號(hào)能夠穿透2 mm厚的奶粉層。 為了確保最底部硫脲顆粒產(chǎn)生的拉曼信號(hào)能被系統(tǒng)完全采集到，避免樣本信息的丟失，研究定制樣本模具使檢測(cè)樣本的厚度維持在1 mm左右。

圖5 不同奶粉厚度下雙層樣本的二值圖像(n=3)Fig.5 Binary images of double-layer samples withdifferent milk powder thickness (n=3)

2.3 散裝奶粉中硫脲的可視化快速檢測(cè)

2.3.1 奶粉中硫脲的定性分析

以硫脲標(biāo)準(zhǔn)品為添加劑，分別制備添加濃度(W/W)為0.005%，0.010%，0.050%，0.250%，0.500%，0.750%，1.000%，1.250 0%，1.500%，1.750%和2.000%的硫脲奶粉混合樣本，采集混合樣本24 mm×24 mm區(qū)域內(nèi)100個(gè)像素點(diǎn)的拉曼高光譜信息，經(jīng)過閾值處理后的二值熱圖如圖6所示。 由圖可知，在感興趣區(qū)域內(nèi)，隨著添加物濃度的增加，硫脲檢測(cè)點(diǎn)數(shù)目增多。 當(dāng)添加濃度為0.050%時(shí)，感興趣區(qū)域內(nèi)可檢測(cè)到1個(gè)硫脲檢測(cè)點(diǎn)，說明基于該實(shí)驗(yàn)參數(shù)，硫脲在奶粉中的最低檢出濃度為0.050%，比已有研究中的檢出限(0.1%)更低[16]，采集時(shí)間(20 min)更短[17]。

圖6 硫脲奶粉混合樣本的二值熱圖(n=6)Fig.6 Binary heat map of mixed sample ofthiourea milk powder (n=6)

2.3.2 奶粉中硫脲的定量分析

研究將感興趣區(qū)域內(nèi)硫脲像素點(diǎn)數(shù)目與添加濃度進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖7所示。 由圖可知，線性擬合的決定系數(shù)(R2)為0.991 3，具有很好的線性關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)中的樣本厚度為1 mm，比文獻(xiàn)中樣本厚度小[17]，系統(tǒng)能完全采集到底部樣本信息(圖5)，不存在樣本信息遺漏，且平行多次混合后采樣能讓表層和亞表層樣本信息全部采集到，減少樣本信息覆蓋的誤差，因此隨著添加濃度的增加，樣本中硫脲檢測(cè)點(diǎn)

圖7 硫脲濃度與像素點(diǎn)數(shù)目的線性擬合圖Fig.7 Linear fitting graph of thiourea concentration and the number of pixels

的數(shù)目呈線性增長(zhǎng)[18]，可以根據(jù)感興趣區(qū)域內(nèi)硫脲檢測(cè)點(diǎn)數(shù)目預(yù)測(cè)奶粉中硫脲的添加濃度。

2.3.3 方法的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，以三種不同品牌奶粉為基質(zhì)，制備4個(gè)不同濃度的硫脲奶粉混合樣本，分別為0.25%，0.60%，1.20%和1.50%，重復(fù)制樣6次，采集拉曼高光譜信息并進(jìn)行二值化處理，記錄硫脲檢測(cè)點(diǎn)的數(shù)目并利用圖7的線性關(guān)系預(yù)測(cè)硫脲的濃度，結(jié)果如表1所示。 由表1可知，在0.25%，0.60%，1.20%和1.50%的添加水平下，預(yù)測(cè)濃度的相對(duì)誤差范圍為-9.41%～4.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可以用于檢測(cè)奶粉中添加物的濃度。

表1 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證表Table 1 Methodaccuracy verification form

3 結(jié) 論

搭建了一套便攜式點(diǎn)掃描拉曼高光譜成像檢測(cè)系統(tǒng)，針對(duì)奶粉中的硫脲進(jìn)行快速無損檢測(cè)研究，結(jié)果顯示該檢測(cè)方法的檢出限為0.05%，硫脲像素點(diǎn)數(shù)目與添加濃度呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，線性決定系數(shù)為0.991 3，預(yù)測(cè)濃度的相對(duì)誤差范圍為-9.41%～4.01%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)硫脲在奶粉中的濃度。 相比傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，本研究開發(fā)的硫脲快檢方法具有以下優(yōu)勢(shì)： (1)儀器便攜，綠色環(huán)保，可在口岸現(xiàn)場(chǎng)操作。 避免采用常規(guī)色譜、 光譜方法所需的前處理過程，測(cè)定過程基本無有機(jī)試劑等有害化合物的使用； (2)方法檢測(cè)時(shí)間短，效率高。 整個(gè)檢測(cè)過程包括前處理能在10 min內(nèi)完成，而且結(jié)果直觀可視。 高效液相色譜法包括前處理過程至少需要50 min[6]，劉宸等[17]利用線掃描拉曼高光譜成像檢測(cè)奶粉中的硫氰酸鈉需要20 min。 同時(shí)利用二值熱圖法可以清晰地展示添加物質(zhì)的空間分布； (3)準(zhǔn)確性好，穩(wěn)定性高，成功預(yù)測(cè)添加水平下硫脲濃度，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%； (4)方法檢出限(0.05%)低于現(xiàn)有高光譜方法，靈敏度高。 陳秀明[16]等利用近紅外光譜成像技術(shù)結(jié)合Adulterant Screen 算法對(duì)嬰幼兒奶粉中的硫脲進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.1%。 本研究搭建的便攜式點(diǎn)掃描拉曼光譜成像系統(tǒng)不僅適用口岸現(xiàn)場(chǎng)奶粉中非法添加物的快速篩查，在其他固體顆粒摻假中也具有較好應(yīng)用前景。