血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽Leu-Lys-Pro(LKP)抑制機(jī)理的研究

徐曉晴，周 倩，孫建華，孫麗霞，馮學(xué)珍, 2，徐永芳，童張法，廖丹葵*

1. 廣西石油資源加工及過(guò)程加強(qiáng)化技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530000 2. 廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣西 柳州 545006

引 言

高血壓作為最常見(jiàn)的慢性病，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅，已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性過(guò)高會(huì)使血壓升高，通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE)的活性降低血壓已證明是治療高血壓的有效方法之一，ACE抑制劑類(lèi)藥物如卡托普利等具有較好的降壓效果，但會(huì)引起咳嗽、 皮疹等副作用[2]。 近年來(lái)，從食源性蛋白中分離出多種ACE抑制肽，與化學(xué)合成的降血壓藥物相比，具有副作用小、 吸收好等優(yōu)點(diǎn)[3]，可在一定范圍內(nèi)有效改善調(diào)節(jié)血壓。

以往研究多集中在ACE抑制肽的提取與鑒定，關(guān)于ACE與抑制肽在分子水平上相互作用的研究還處于起步階段，而兩者的作用機(jī)制研究是研發(fā)新藥的基礎(chǔ)。 Yan等[4]通過(guò)3D-QSRA、 分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)研究了C-末端為色氨酸的ACE抑制肽VKW與GTW和ACE相互作用，結(jié)果表明ACE-VKW復(fù)合物比ACE-GTW復(fù)合物更穩(wěn)定，因此VKW與ACE具有更高的親和力和活性。 Lan等[5]利用光譜法、 等溫滴定量熱及分子對(duì)接模擬研究了GF-6與ACE的相互作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)GF-6主要通過(guò)氫鍵作用結(jié)合在ACE非活性部位。 迄今為止，仍有大量ACE抑制肽與ACE的作用機(jī)制缺乏研究。

熒光光譜、 紫外-可見(jiàn)吸收光譜可以分析蛋白質(zhì)大分子與小分子作用類(lèi)型，分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，是研究分子間相互作用的重要方法[6]。 圓二色譜可以表征蛋白質(zhì)分子與小分子結(jié)合前后二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)可根據(jù)焓變與熵變的不同推測(cè)結(jié)合驅(qū)動(dòng)力等信息，更加深入了解大分子與小分子結(jié)合的作用機(jī)制。 分子對(duì)接可以有效分析蛋白質(zhì)大分子與小分子的相互作用[7]。 本工作采用多光譜法、 等溫滴定量熱以及分子對(duì)接研究分析ACE與LKP相互作用機(jī)理，為ACE抑制肽的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

試劑： 豬肺ACE由本實(shí)驗(yàn)室自提(1.23 U·mg-1)，用pH 7.0 HEPES緩沖溶液(含0.3 mol·L-1NaCl)配制成2.0×10-6mol·L-1的儲(chǔ)備液，LKP(純度>98%，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IC500.32 μmol·L-1由上海拜爾迪公司合成)，用上述緩沖液配制成0.01 mol·L-1的儲(chǔ)備液。 HEPES(上海麥克林公司)，NaCl(四川成都科隆有限公司)。

儀器： Nano等溫滴定量熱儀(美國(guó)TA公司)； UV-2501PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)； MOS-450圓二色譜儀(法國(guó)Biologi公司); SF QY-9000熒光分光光度計(jì)(北京卓立漢光儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 熒光及紫外光譜分析

ACE的濃度為1.0×10-6mol·L-1，加入不同濃度的LKP，以相應(yīng)濃度的LKP溶液為參比，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫均為5 nm，在不同溫度(288，293和298 K)下，掃描反應(yīng)體系300～500 nm的發(fā)射光譜，研究LKP對(duì)ACE的猝滅機(jī)制。

以相應(yīng)濃度的LKP溶液為參比，掃描200～350 nm的紫外吸收光譜，研究在不同溫度(288，293和298 K)下，ACE-LKP體系光譜變化規(guī)律。

1.2.2 圓二色譜

ACE的濃度為1.0×10-6mol·L-1，用HEPES緩沖液進(jìn)行背景測(cè)試，用0.1 cm比色皿測(cè)定190～260 nm的CD譜。 研究LKP對(duì)ACE二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.3 等溫滴定量熱

將250 μL ACE(0.4×10-6mol·L-1)溶液注入樣品池，LKP(2.8×10-3mol·L-1)裝入注射器，待溫度(288，293和298 K)穩(wěn)定后，開(kāi)始向樣品池中連續(xù)滴加20滴LKP溶液，每滴2.5 μL，研究ACE與LKP的相互作用。

1.2.4 分子對(duì)接

使用軟件Auto Dock Vina進(jìn)行分子對(duì)接模擬。 LKP的結(jié)構(gòu)使用Chemdraw生成并優(yōu)化。 ACE的晶體結(jié)構(gòu)在 Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)下載。 對(duì)接運(yùn)行后獲得具有最低結(jié)合能的構(gòu)象。 對(duì)接結(jié)果及相互作用力分析使用PyMOL(De Lano Scientific LLC, USA)軟件，研究LKP與ACE結(jié)合機(jī)制。

2 結(jié)果與討論

2.1 LKP對(duì)ACE的熒光猝滅機(jī)制研究

ACE的熒光主要是由色氨酸、 酪氨酸以及苯丙氨酸殘基發(fā)出，在不同溫度下，不同濃度LKP與ACE作用的熒光光譜如圖1(a—c)所示。

圖1 不同溫度下ACE與LKP結(jié)合的熒光發(fā)射光譜(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1Fig.1 Fluorescence emission spectra of ACEwith LKP at different temperatures(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1

由圖1結(jié)果可知，隨著LKP濃度的增加，ACE的熒光強(qiáng)度不斷降低，表明LKP能引起ACE的熒光猝滅，熒光猝滅過(guò)程分為靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅[8]。 做不同溫度下F0/F對(duì)[Q]的Stern-Volmer曲線(xiàn)[9](F0： 未加猝滅劑；F： 加猝滅劑熒光強(qiáng)度)，結(jié)果如圖2。

由表1可知，隨溫度升高猝滅常數(shù)Ksv減小，且Kq均遠(yuǎn)大于2.0×1010L·s-1·mol-1(Kq： 猝滅過(guò)程速率常數(shù))由此判斷LKP對(duì)ACE的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。 此外，隨LKP濃度的增加，ACE最大發(fā)射峰位置先紅移后藍(lán)移，說(shuō)明ACE熒光生色基團(tuán)所處的微環(huán)境發(fā)生改變。 為進(jìn)一步研究LKP對(duì)ACE蛋白空間構(gòu)象的影響，采用紫外-可見(jiàn)吸收光譜和圓二色譜進(jìn)行分析。

圖2 ACE與LKP結(jié)合的Stern-Volmer圖Fig.2 The Stern-Volmer plots of ACE with LKP

表1 不同溫度下ACE與LKP結(jié)合的猝滅常數(shù)Table 1 Quenching constants of ACE withLKP at different temperatures

2.2 LKP對(duì)ACE結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 紫外可見(jiàn)吸收光譜

不同溫度下，ACE與LKP結(jié)合的紫外可見(jiàn)吸收光譜如圖3(a—c)所示。

由圖3可知，ACE的吸收光譜具有兩個(gè)吸收峰，221 nm處的強(qiáng)吸收峰為肽主鏈的特征峰，280 nm處的弱吸收峰為芳香族氨基酸的特征峰[10]。 隨著LKP濃度的升高，ACE的吸收光譜發(fā)生減色效應(yīng)，221 nm吸收峰紅移，溫度越高移動(dòng)越明顯，分析認(rèn)為L(zhǎng)KP的π*空軌道與ACE分子上氨基酸殘基的π電子軌道之間發(fā)生偶合，導(dǎo)致能級(jí)下降[11]，以及芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變[12]。 由此說(shuō)明ACE與LKP結(jié)合生成復(fù)合物，使ACE的構(gòu)象改變。

2.2.2 圓二色譜

不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的圓二色譜CD譜帶的位置以及吸收強(qiáng)弱都是不同的[13]。 為進(jìn)一步了解LKP對(duì)ACE蛋白構(gòu)象的影響，測(cè)量LKP與ACE結(jié)合的CD光譜，結(jié)果如圖4所示。

采用CDpro軟件對(duì)CD數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，ACE的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量由大到小依次是： 無(wú)規(guī)則卷曲，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角，α-螺旋。 其中α-螺旋含量由10.8%降至0.1%后上升至10.2%； β-折疊由22.9%升至38.8%后降到34.8%； β-轉(zhuǎn)角由13.8%降至9.5%后升到11%； 無(wú)規(guī)則卷曲由49.4%升至50.8%后降至41.5%。 說(shuō)明當(dāng)LKP含量較少時(shí)，ACE的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由α-螺旋逐漸向β-折疊與無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，說(shuō)明ACE肽鏈結(jié)構(gòu)逐漸舒展，結(jié)構(gòu)變得松散； LKP逐漸增加后，肽鏈結(jié)構(gòu)又進(jìn)行了折疊收縮，結(jié)構(gòu)變得緊密，最終ACE的空間結(jié)構(gòu)比未加入LKP時(shí)松散，表明LKP能夠使ACE的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，原因可能為L(zhǎng)KP與ACE結(jié)合使蛋白質(zhì)原有的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起肽鏈的重排，從而導(dǎo)致空間構(gòu)象的改變。

圖3 不同溫度下ACE與LKP結(jié)合的紫外吸收光譜(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=1.0×10-6 mol·L-1，c(LKP)(0—4): 0，0.28，1.4，2.8，4.2×10-3 mol·L-1Fig.3 UV absorption spectra of ACE withLKP at different temperatures(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=1.0×10-6 mol·L-1，c(LKP)(0—4): 0，0.28，1.4，2.8，4.2×10-3 mol·L-1

2.3 LKP與ACE的熱力學(xué)參數(shù)及作用力類(lèi)型

LKP與ACE作用的等溫滴定量熱曲線(xiàn)圖如圖5(a—c)，采用NanoAnalyze軟件分析得到的熱力學(xué)參數(shù)列于表2。

由公式ΔG=ΔH-TΔS可知，吉布斯自由能的變化ΔG包括兩個(gè)部分，即焓變項(xiàng)(ΔH)和熵變項(xiàng)(-TΔS)。 由表2結(jié)果可知，ΔG<0證明反應(yīng)具有自發(fā)性，ΔH>0說(shuō)明LKP與ACE的結(jié)合過(guò)程是吸熱的。 ΔS值大說(shuō)明有較大的疏水作用，因此結(jié)合力主要表現(xiàn)為疏水作用力。 三個(gè)溫度下，|-TΔS|>|ΔH|，說(shuō)明LKP與ACE的結(jié)合主要以熵驅(qū)動(dòng)為主，ΔCp為較大的負(fù)值，說(shuō)明LKP與ACE結(jié)合屬于非剛性結(jié)合，結(jié)合過(guò)程中ACE表面的疏水基團(tuán)被親水基團(tuán)包埋，蛋白質(zhì)產(chǎn)生的空間構(gòu)象變化使得表面的結(jié)合位點(diǎn)不能再和抑制肽結(jié)合。 288 K時(shí)，LKP與ACE的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為0.131，與另外兩個(gè)溫度的結(jié)果差異較大是因?yàn)闇囟容^低導(dǎo)致ACE失活嚴(yán)重，因此與LKP的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)較小。 隨著溫度的升高，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)逐漸增大，溫度升高會(huì)使ACE的空間構(gòu)象發(fā)生變化，ACE的肽鏈伸展，使氨基酸殘基暴露出來(lái)，更有利于與LKP的結(jié)合。

圖4 ACE與LKP結(jié)合的圓二色譜圖298 K, c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1Fig.4 CD spectra of ACE with LKP298 K, c(ACE)= 1.0×10-6 mol·L-1

圖5 不同溫度下LKP滴定ACE的熱流曲線(xiàn)圖(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=0.4 μmol·L-1，c(LKP)=2.8 mmol·L-1Fig.5 The heat flow of binding LKP to ACE(a)—(c): 288，293，298 K，c(ACE)=0.4 μmol·L-1，c(LKP)=2.8 mmol·L-1

表2 LKP與ACE結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamics parameter of binding of LKP and ACE

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LKP與ACE的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，與ACE的抑制劑卡托普利、 依那普利等的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)相近，但LKP與ACE的結(jié)合常數(shù)都遠(yuǎn)小于卡托普利、 依那普利等抑制劑與ACE的結(jié)合常數(shù)[14]。 卡托普利、 依那普利等藥物的分子結(jié)構(gòu)中的官能團(tuán)能夠和鋅離子結(jié)合形成穩(wěn)定的多面體結(jié)構(gòu)，這個(gè)作用過(guò)程對(duì)親和力的影響非常大[15]。 說(shuō)明LKP是與活性中心的結(jié)合口袋發(fā)生作用，沒(méi)有和鋅離子結(jié)合。 綜上所述，LKP與ACE的活性中心結(jié)合作用，反應(yīng)為自發(fā)進(jìn)行的吸熱過(guò)程，主要驅(qū)動(dòng)力為熵驅(qū)動(dòng)，結(jié)合作用力為疏水作用力。

2.4 分子對(duì)接

選擇tACE作為蛋白質(zhì)大分子，以鋅離子為中心設(shè)置結(jié)合口袋中心，調(diào)整結(jié)合口袋體積，對(duì)接盒子范圍為(40 ?×40 ?×40 ?)。 LKP與ACE的對(duì)接結(jié)果如圖6(a,b)所示，結(jié)構(gòu)能量為-7.5 kcal·m-1。

圖6 LKP與ACE的分子對(duì)接(a)： LKP與ACE的對(duì)接模型；(b)： LKP與ACE分子上氨基酸殘基的相互作用Fig.6 The docking simulation of LKP binding to ACE(a): The docking simulation of LKP binding to ACE;(b): The interaction between LKP and the residues of ACE is shown

3 結(jié) 論

通過(guò)多光譜法結(jié)合等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)、 分子對(duì)接等方法研究LKP與ACE相互作用。 熒光光譜表明LKP通過(guò)靜態(tài)猝滅機(jī)制有效猝滅ACE的內(nèi)源熒光。 紫外可見(jiàn)吸收光譜、 圓二色譜實(shí)驗(yàn)表明，在抑制肽LKP的作用下，ACE二級(jí)結(jié)構(gòu)比未加入LKP時(shí)疏松，LKP對(duì)ACE的空間構(gòu)象具有顯著影響。 ITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LKP與ACE為非剛性結(jié)合，是由熵驅(qū)動(dòng)的自發(fā)吸熱反應(yīng)，主要作用力為疏水作用。 分子對(duì)接模擬表明LKP通過(guò)疏水作用與ACE在活性中心S1口袋進(jìn)行結(jié)合。 本研究有助于了解ACE與其抑制肽相互作用機(jī)理，為開(kāi)發(fā)新的治療高血壓藥物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。