洛匹那韋固體脂質(zhì)納米粒的制備及藥劑學(xué)性質(zhì)評(píng)價(jià)

丁 瑞，高洋洋，趙 曄

大連市第三人民醫(yī)院藥劑部，大連 116033

洛匹那韋（LPV）是一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶抑制劑，用于預(yù)防和治療人類免疫缺陷病毒（HIV）感染［1］。LPV 屬于生物制藥分類系統(tǒng)（BCS）Ⅳ類藥物，溶解性和滲透性均較差［2］，且存在較強(qiáng)的肝臟首過(guò)效應(yīng)，口服生物利用度較低［3］。固體脂質(zhì)納米粒（SLNs）在提高難溶性藥物的口服生物利用度方面表現(xiàn)出巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，受到廣泛關(guān)注［4］。本研究擬將LPV 開發(fā)成固體脂質(zhì)納米粒（LPV-loaded-SLNs），通過(guò)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化［5］，并對(duì)其藥劑學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為評(píng)價(jià)LPV-loaded-SLNs在動(dòng)物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EClassical 3100高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；DF-101Q 系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）；JY88-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀（上海熙揚(yáng)儀器有限公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）；DSC-500C 差示掃描量熱儀（上海研錦科學(xué)儀器有限公司）；JEM-F200場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 試藥

洛匹那韋（LPV，廣州貝爾卡生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%，批號(hào)LOP000126）；單雙硬脂酸甘油酯（江西阿爾法高科藥業(yè)有限公司）；泊洛沙姆188（德國(guó)巴斯夫公司）；二氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純化水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 LPV-loaded-SLNs的制備

采用乳化超聲低溫固化法制備LPV-loaded-SLNs［6］。取處方量的單雙硬脂酸甘油酯和LPV 加入到二氯甲烷10 m L 中溶解，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干有機(jī)溶劑，取固體混合物加熱至75℃±1℃形成澄清透明的溶液，作為油相，保溫備用；另取處方量泊洛沙姆188 溶解到純化水20 m L 中，加熱至75℃±1℃，作為水相，保溫備用；將該熱水相加入到油相中，使用高速勻漿機(jī)以4 000 r·min－1勻漿30 min，得到乳白色混懸液；最后使用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲處理，在超聲功率為200 W 條件下超聲一定時(shí)間，將樣品迅速用冰水浴冷卻，得到LPV-loaded-SLNs。將樣品儲(chǔ)存在4℃～8℃冰箱中。

2.2 粒徑分布測(cè)定

取少量2.1項(xiàng)下制備的LPV-loaded-SLNs，按照1∶100 的比例加入去離子水稀釋，通過(guò)Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測(cè)定粒徑分布，光源為He-Ne激光器，波長(zhǎng)為635 nm，入射角為90°，環(huán)境溫度為25℃。每組樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.3 包封率測(cè)定

使用超濾技術(shù)測(cè)定LPV-loaded-SLNs 的包封率［7］。取LPV-loaded-SLNs 4 mL，置于超濾離心管（截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000 Da）中，以3 000 r·min－1持續(xù)離心30 min，取出超濾液1 m L，加入流動(dòng)相稀釋至10 m L，作為游離藥物樣品（W游離）；另取同一批次LPV-loaded-SLNs 1 m L，置于50 m L量瓶中，加入乙腈5 m L，水浴超聲10 min，溶液呈澄清透明狀，再加入流動(dòng)相稀釋至刻度，作為總藥物樣品（W總）；上述2種樣品溶液經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾，并通過(guò)高效液相色譜（HPLC）法［8］測(cè)定，計(jì)算藥物包封率：包封率＝（W總－W游離）÷W總×100%。

2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察脂藥比（X1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）和超聲時(shí)間（X3）3種變量因素對(duì)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布（Y1）和包封率（Y2）的影響［9］，從而獲得制備LPV-loaded-SLNs的最佳處方工藝。變量水平見表1，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)化生成15組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中變量及水平Tab.1 The variables and levels in Box-Behnken experimental design

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 The results of experimental design

通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性（Linear）、雙因子（2FI）和多元二次（Quadratic）模型擬合，并根據(jù)軟件給出的矯正R2、預(yù)測(cè)R2和P值確定最佳擬合模型［10］。擬合模型選擇結(jié)果見表3。Y1選擇Quadratic模型，其矯正R2和預(yù)測(cè)R2分別為0.946、0.921 6，P值為0.005 2，最為適合，Y2選擇Quadratic 模型，其矯正R2和預(yù)測(cè)R2分別為0.958 4、0.943 6，P值為0.000 2，也最為適合；方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，脂藥比（X1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）和超聲時(shí)間（X3）3個(gè)變量因素對(duì)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布（Y1）和包封率（Y2）的影響，并使用響應(yīng)曲面圖闡明了X1、X2和X33個(gè)變量因素與Y1和Y2之間的關(guān)系。

表3 擬合模型選擇結(jié)果Tab.3 The results of regression model selection

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 The results of ANOVA

脂藥比（X1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）和超聲時(shí)間（X3）對(duì)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布（Y1）影響見圖1。

由圖1可知，在超聲時(shí)間（X3）恒定時(shí)，粒徑分布（Y1）隨著脂藥比（X1）的增加而表現(xiàn)出先減小后增大趨勢(shì)，隨著表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）的增加表現(xiàn)出先增大后減小趨勢(shì)；在表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）恒定時(shí)，粒徑分布（Y1）隨著脂藥比（X1）的增加和超聲時(shí)間（X3）的延長(zhǎng)出現(xiàn)減小趨勢(shì)。

圖1 脂藥比（X 1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X 2）和超聲時(shí)間（X 3）對(duì)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布（Y 1）影響的響應(yīng)曲面圖Fig.1 The response surface graph of the effect of lipid-drug ratio（X 1），surfactant concentration（X 2）and ultrasonic time（X 3）on the particle size distribution（Y 1）of LPV-loaded-SLNs

脂藥比（X1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）和超聲時(shí)間（X3）對(duì)LPV-loaded-SLNs的包封率（Y2）影響見圖2。

由圖2可知，在超聲時(shí)間（X3）恒定時(shí)，包封率（Y2）隨著脂藥比（X1）和表面活性劑質(zhì)量濃度（X2）的增加而增大。

圖2 脂藥比（X 1）、表面活性劑質(zhì)量濃度（X 2）和超聲時(shí)間（X 3）對(duì)LPV-loaded-SLNs的包封率（Y 2）影響的響應(yīng)曲面圖Fig.2 The response surface graph of the effect of lipid-drug ratio（X 1），surfactant concentration（X 2）and ultrasonic time（X 3）on the encapsulation efficiency（Y 2）of LPV-loaded-SLNs

以制備的LPV-loaded-SLNs粒徑分布最小化、包封率最大化為目標(biāo)［11］，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到最佳處方工藝為：脂藥比為4∶1，表面活性劑質(zhì)量濃度為30 mg·m L－1，超聲時(shí)間為10 min，預(yù)測(cè)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布為346.4 nm，包封率為90.1%。為了確認(rèn)模型預(yù)測(cè)的可靠性，根據(jù)最佳處方工藝制備了3批LPV-loaded-SLNs，測(cè)得粒徑分布為（351.5±5.8）nm，包封率為89.5%±1.4%，與預(yù)測(cè)值吻合度極高，證實(shí)了模型的預(yù)測(cè)可靠性。

2.5 微觀形貌觀察（TEM）

取LPV-loaded-SLNs 100μL，按照1∶100 的比例加入去離子水稀釋，取上述樣品滴加到碳涂層的銅網(wǎng)上，并均勻鋪展，再滴加20 mg·m L－1磷鎢酸鈉溶液對(duì)樣品進(jìn)行染色，室溫?fù)]干水分，用透射電子顯微鏡觀察LPV-loaded-SLNs的微觀形貌。見圖3。

由圖3可知，LPV-loaded-SLNs呈球形分布，表面光滑，大部分粒子的粒徑在200～400 nm 間分布，與動(dòng)態(tài)光散射方法測(cè)定的粒徑大小相似，文獻(xiàn)報(bào)道表明該粒徑大小有利于胃腸道吸收［12］。

圖3 LPV-loaded-SLNs的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 Transmission electron micrograph of LPV-loaded-SLNs

2.6 差示掃描量熱法（DSC）

使用DSC 法對(duì)LPV 原料藥、LPV 原料藥與空白SLNs的物理混合物以及LPV-loaded-SLNs進(jìn)行熱分析，以初步判斷LPV-loaded-SLNs中藥物的存在形式［13］。分別稱取上述4種樣品各4～6 mg，置于鋁盤中，密封，并以密封空鋁盤作為對(duì)照。設(shè)置氮?dú)饬魉贋?0 m L·min－1，升溫速率為5℃·min－1，升溫范圍為25℃～200℃，結(jié)果見圖4。

圖4 LPV原料藥（a）、物理混合物（b）和LPV-loaded-SLNs（c）的DSC圖Fig.4 DSC thermograms of lopinavir API（a），physical mixture（b）and LPV-loaded-SLNs（c）

由圖4 可知，LPV 原料藥（a）和物理混合物中LPV 原料藥（b）分別在126.5℃、127.2℃出現(xiàn)吸熱峰，為L(zhǎng)PV 結(jié)晶態(tài)的熔 點(diǎn)［14］；物理混合物中空白SLNs（b）和LPV-loaded-SLNs（c）分別在56.5℃、56.7℃出現(xiàn)吸熱峰，該值與單雙硬脂酸甘油酯的熔點(diǎn)（54℃～66℃）基本一致；LPV-loaded-SLNs（c）中藥物在126.5℃附近的吸熱峰消失，表明被包裹在SLNs中的LPV 以非晶態(tài)形式呈現(xiàn)［15］。

2.7 稀釋穩(wěn)定性

為了評(píng)價(jià)LPV-loaded-SLNs在不同p H 溶液中的抗稀釋能力，取LPV-loaded-SLNs分別用p H1.2、p H4.5、p H6.8緩沖液稀釋至100倍，在稀釋后的0、2、4、6 h時(shí)間點(diǎn)觀察外觀［16］，取樣檢測(cè)LPV-loaded-SLNs的粒徑分布，評(píng)估其物理穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。

表5 LPV-loaded-SLNs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n＝3）Tab.5 Dilution stability results of LPV-loaded-SLNs（±s，n＝3）

表5 LPV-loaded-SLNs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（±s，n＝3）Tab.5 Dilution stability results of LPV-loaded-SLNs（±s，n＝3）

介質(zhì)溶液粒徑分布／nm 0 h 2 h 4 h 6 h p H1.2 349.6±4.7 351.6±6.3 348.6±3.7 350.5±3.9 p H4.5 349.6±4.7 348.9±3.7 350.4±4.1 348.5±5.3 p H6.8 349.6±4.7 350.4±4.7 349.9±4.2 353.5±4.7

稀釋穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPV-loaded-SLNs經(jīng)p H1.2、4.5、6.8緩沖液稀釋后6 h內(nèi)，樣品均未出現(xiàn)絮凝分層，也無(wú)藥物沉淀析出，粒徑基本無(wú)變化，表明LPV-loaded-SLNs在不同p H 溶液中具有良好的抗稀釋能力，可以推測(cè)LPV-loaded-SLNs經(jīng)口服給藥進(jìn)入胃腸道內(nèi)可以保持完整性。

2.8 體外釋放研究

采用體外釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定了LPV-loaded-SLNs在p H1.2、4.5、6.8釋放介質(zhì)中的釋放速率，用于模擬LPV-loaded-SLNs在胃腸道環(huán)境中的藥物釋放情況［17］。取LPV-loaded-SLNs 2 m L 置 于 透 析 袋（纖維素膜，截留相對(duì)分子質(zhì)量為12 000 Da）中，密封后分別浸入到裝有200 m L上述釋放介質(zhì)的燒杯中，外水浴溫度為37 ℃±1 ℃，磁力攪拌速度為100 r·min－1，分別在實(shí)驗(yàn)開始后的1、2、3、4、6、8、10、12、24 h從燒杯中取出釋放介質(zhì)5 m L，并加入等量的空白釋放介質(zhì)，釋放介質(zhì)經(jīng)0.22μm 濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行適當(dāng)稀釋，進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量［8］，藥物釋放度結(jié)果見表6。

表6 LPV-loaded-SLNs在不同p H 介質(zhì)中的體外藥物釋放度（±s，n＝6）Tab.6 In vitro drug dissolution of LPV-loaded-SLNs in different p H media（±s，n＝6）

表6 LPV-loaded-SLNs在不同p H 介質(zhì)中的體外藥物釋放度（±s，n＝6）Tab.6 In vitro drug dissolution of LPV-loaded-SLNs in different p H media（±s，n＝6）

時(shí)間／h累積釋放度p H1.2 p H4.5 p H6.8 1 21.4%±4.6% 24.1%±3.3% 19.6%±2.8%2 33.9%±3.3% 37.4%±3.4% 32.1%±2.7%3 41.2%±3.7% 43.5%±2.6% 37.5%±2.3%4 44.9%±2.8% 47.4%±3.6% 42.7%±3.2%6 52.3%±3.6% 51.6%±3.8% 48.2%±3.9%8 56.6%±2.4% 57.6%±2.7% 53.2%±3.8%10 61.0%±3.7% 62.7%±2.1% 59.8%±2.5%12 64.7%±2.3% 66.3%±2.1% 64.6%±2.6%24 88.2%±3.5% 91.3%±2.3% 88.5%±2.0%

體外藥物釋放度結(jié)果顯示，LPV-loaded-SLNs在p H1.2、4.5、6.8釋放介質(zhì)中藥物釋放速率基本一致，說(shuō)明不同p H 環(huán)境不會(huì)影響藥物的釋放速率。LPV-loaded-SLNs在3種釋放介質(zhì)中均表現(xiàn)為雙相釋放模式，大約35%的藥物在2 h內(nèi)從SLNs中釋放出來(lái)，接下來(lái)藥物呈現(xiàn)緩慢持續(xù)釋放模式，直到24 h藥物釋放度達(dá)到90%左右。

3 討論

在處方初步篩選時(shí)，本文選擇單硬脂酸甘油酯和單雙硬脂酸甘油酯作為脂質(zhì)載體制備LPV-loaded-SLNs，其中采用單硬脂酸甘油酯制備的LPV-loaded-SLNs，其藥物包封率較低，約為60%，這是由于單硬脂酸甘油酯分子為有序排列，會(huì)形成剛性結(jié)構(gòu)［18］，固體脂質(zhì)中容納藥物分子空間有限，不利于包裹藥物；而以單雙硬脂酸甘油酯制備的LPV-loaded-SLNs，其包封率明顯提高，這是由于單雙硬脂酸甘油酯是由單、雙、三硬脂酸和棕櫚酸構(gòu)成的混合三酰甘油（單甘油酯約占40.0～55.0%，雙甘油酯約占30.0%～45.0%，三酰甘油約占5.0%～15.0%）。與單硬脂酸甘油酯相比，單雙硬脂酸甘油酯中的3種三酰甘油是以不規(guī)則、無(wú)序狀態(tài)排列，因此有充足的空間包載藥物分子［19］。

本文采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)LPV-loaded-SLNs的處方工藝進(jìn)行系統(tǒng)地研究，并通過(guò)測(cè)定粒徑及透射電鏡、DSC 和體外釋放度等初步評(píng)估了LPV-loaded-SLNs的藥劑學(xué)特性，后續(xù)需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其能夠改善LPV 的口服生物利用度。