和厚樸酚對糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響及其機(jī)制

焦紅軍，彭旭陽，彭秀麗

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）伴發(fā)多種并發(fā)癥，例如糖尿病心肌病、糖尿病腎病和糖尿病足等，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量［1］。和厚樸酚（honokiol，HKL）是傳統(tǒng)中藥厚樸的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗腫瘤等多種藥理作用［2-4］。研究顯示，HKL可改善胰島β細(xì)胞功能障礙、促進(jìn)胰島素分泌、增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性，從而降低DM 大鼠的血糖水平。此外，HKL 可改善2型DM 小鼠胰島素抵抗、肝臟脂肪變性以及炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防DM 的效果［5-6］。過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在多種基因的表達(dá)中發(fā)揮調(diào)控作用，研究表明，miR-27a靶向作用于PPARγ可改善胰島素抵抗、降低血糖［7］。本研究建立DM大鼠模型，灌胃給予HKL，探討HKL對DM 大鼠的影響以及對PPARγ的調(diào)控作用。

1 儀器和材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試藥

HKL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，南京景竹生物科技有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）、PPARγ抑制劑GW9662均購自美國Sigma公司；血糖儀和血糖試紙（瑞士羅氏公司）；空腹血清胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PPARγPCR 特異性引物（廣州銳博生物有限公司）；兔抗大鼠腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、PPARγ抗體均購自美國Abcam 公司。

1.3 動(dòng)物

健康清潔級SD 雄性大鼠70只，8周齡，體質(zhì)量為200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2018-0001。

2 方法

2.1 分組與給藥

70只SD 大鼠用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，其中55只換用高脂高糖飼料喂養(yǎng)作為DM 組，其余15只用普通飼料喂養(yǎng)作為正常組。6周后，DM 組大鼠禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ 溶液35 mg·kg－1（STZ粉末溶于0.1 mol·L－1檸檬酸鈉緩沖液，p H4.5，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光使用），2 h后恢復(fù)高脂高糖飲食；正常組15只大鼠腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，2 h后用普通飼料喂養(yǎng)。7 d后，DM 組大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈采血，用血糖儀測定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平，F(xiàn)BG≥11.1 mmol·L－1視為DM 模型構(gòu)建成功。其中53只大鼠建模成功，隨機(jī)選取5只正常大鼠和5只DM 大鼠檢測脂肪組織中PPARγm RNA 的相對表達(dá)量。

將剩余的48只DM 大鼠隨機(jī)分為模型組、和厚樸酚組、抑制劑組、和厚樸酚＋抑制劑組，每組12只。和厚樸酚組大鼠用HKL 50 mg·kg－1灌胃，抑制劑組大鼠用GW9662 1 mg·kg－1灌胃，和厚樸酚＋抑制劑組大鼠用HKL 50 mg·kg－1灌胃，2 h 后用GW9662 1 mg·kg－1灌胃，每日1次，連續(xù)處理3周，模型組大鼠用等量生理鹽水灌胃，末次給藥結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，尾靜脈采血，用血糖儀測定FBG，并稱質(zhì)量。

2.2 ELISA 檢測血清FINS

稱質(zhì)量后，用戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h 后，以3 000 r·min－1離 心10 min，離心半徑為8 cm，收集上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進(jìn)行對照品稀釋，酶標(biāo)板設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)孔中加入稀釋后的對照品50μL，待測樣品孔加入樣品稀釋液40μL，再加入待測樣品10μL，37℃孵育30 min，洗滌5次，加入鏈霉親和素（除空白孔）50μL，再加入四甲基聯(lián)苯胺50μL，37℃反應(yīng)10 min 后，置于酶標(biāo)儀中，測定450 nm處的A 值，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）和胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMAIR）。ISI＝Ln［1／（FBG×FINS）］。HOMA-IR＝［（FBG×FINS）］／22.5。

2.3 檢測PPARγ mRNA 的相對表達(dá)量

打開腹腔，取腹膜后脂肪組織，置于液氮中研磨，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以c DNA 為模板，以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃15 s、60℃40 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。采用2－CT表示PPARγmRNA 的相對表達(dá)量，所有操作均獨(dú)立重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

2.4 檢測PPARγ和p-AMPK 蛋白的相對表達(dá)量

打開腹腔，取腹膜后脂肪組織，置于液氮中研磨。加入RIPA 裂解液冰上靜置30 min，以12 000 r·min－1離心10 min，離心半徑為10 cm，收集上清液，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min使蛋白變性。SDS凝膠電泳，每孔加入蛋白樣品20μL，120 V 恒壓電泳2 h，0.3 A 恒流濕轉(zhuǎn)2 h，根據(jù)相對分子質(zhì)量裁取目的蛋白條帶，用TBST 洗膜3次，每次5 min，室溫封閉1 h，PPARγ、p-AMPK、GAPDH 一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，用TBST 洗膜3次，每次5 min，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，每次5 min，用ECL 法顯色。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值與GAPDH 蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 q RT-PCR 檢測結(jié)果

正常組大鼠脂肪組織中PPARγm RNA 的相對表達(dá)量（6.43±0.52）高于DM 組大鼠（2.17±0.48）（P＜0.05）。

3.2 PPARγ m RNA 的相對表達(dá)量

PPARγmRNA 相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意 義（P＜0.05）。與 正 常 組 比 較，模 型 組PPARγmRNA 的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，和厚樸酚組PPARγm RNA 的相對表達(dá)量升高，抑制劑組PPARγmRNA 的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與和厚樸酚組比較，和厚樸酚＋抑制劑組PPARγmRNA 的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，和厚樸酚＋抑制劑組PPARγm RNA的相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 大鼠脂肪組織中PPARγmRNA相對表達(dá)量的比較（±s）Tab.2 Comparison of relative expression levels of PPARγ m RNA in adipose tissue of rats in each group（±s）

表2 大鼠脂肪組織中PPARγmRNA相對表達(dá)量的比較（±s）Tab.2 Comparison of relative expression levels of PPARγ m RNA in adipose tissue of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與和厚樸酚組比較，c P＜0.05；與抑制劑組比較，d P＜0.05。

項(xiàng)目 n PPAR γ正常組10 8.26±0.35模型組 12 3.40±0.33a和厚樸酚組 12 5.74±0.38ab抑制劑組 12 2.04±0.22abc和厚樸酚＋抑制劑組 12 4.52±0.29abcd F 607.808 P＜0.001

3.3 FBG 和體質(zhì)量測定結(jié)果

FBG、體質(zhì)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組FBG 升高、體質(zhì)量減輕（P＜0.05）；與模型組比較，和厚樸酚組FBG 降低、體質(zhì)量增加，抑制劑組FBG 升高、體質(zhì)量減輕（P＜0.05）；與和厚樸酚組比較，和厚樸酚＋抑制劑FBG 升高、體質(zhì)量減輕（P＜0.05）；與抑制劑組比較，和厚樸酚＋抑制劑組FBG 降低、體質(zhì)量增加（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 大鼠FBG、體質(zhì)量比較（±s）Tab.3 Comparison of FBG and body weight of rats in each group（±s）

表3 大鼠FBG、體質(zhì)量比較（±s）Tab.3 Comparison of FBG and body weight of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與和厚樸酚組比較，c P＜0.05；與抑制劑組比較，d P＜0.05。

項(xiàng)目 n FBG／（mmol·L－1） 體質(zhì)量／g正常組10 6.14±0.53 325.80±11.42模型組 12 18.76±0.82a 201.73±8.24a和厚樸酚組 12 14.25±0.55ab 262.05±8.88ab抑制劑組 12 22.73±0.78abc 185.29±10.53abc和厚樸酚＋抑制劑組12 16.44±0.78abcd 247.90±10.62abcd F 818.869 337.073 P＜0.001 ＜0.001

3.4 FINS、ISI和HOMA-IR 檢測結(jié)果

FINS、ISI和HOMA-IR 組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組ISI降低，F(xiàn)INS和HOMA-IR 升高（P＜0.05）；與模型組比較，和厚樸酚組ISI升高，F(xiàn)INS和HOMA-IR 降低，抑制劑組ISI降低，F(xiàn)INS和HOMA-IR 升高（P＜0.05）；與和厚樸酚組比較，和厚樸酚＋抑制劑ISI降低，F(xiàn)INS和HOMA-IR 升高（P＜0.05）；與抑制劑組比較，和厚樸酚＋抑制劑組ISI升高，F(xiàn)INS和HOMAIR 降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 大鼠FINS、ISI和HOMA-IR 比較（±s）Tab.4 Comparison of FINS，ISI and HOMA-IR of rats in each group（±s）

表4 大鼠FINS、ISI和HOMA-IR 比較（±s）Tab.4 Comparison of FINS，ISI and HOMA-IR of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與和厚樸酚組比較，c P＜0.05；與抑制劑組比較，d P＜0.05。

項(xiàng)目 n FINS／（m U·L－1）ISI HOMA-IR正常組10 8.53±0.64 7.92±0.25 7.57±0.82模型組 12 19.42±0.76a 5.30±0.22a 18.44±0.79a和厚樸酚組 12 13.05±0.73ab 6.43±0.20ab 12.07±0.84ab抑制劑組 12 21.73±0.68abc 4.24±0.17abc 23.94±1.25abc和厚樸酚＋抑制劑組 12 15.90±0.51abcd 5.78±0.32abcd 15.82±1.06abcd F 664.946 363.209 454.527 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.5 脂肪組織中各蛋白的相對表達(dá)量

PPARγ和p-AMPK 蛋白相對表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組PPARγ和p-AMPK 蛋白的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與模型組比較，和厚樸酚組PPARγ和p-AMPK 蛋白的相對表達(dá)量升高，抑制劑組PPARγ和p-AMPK 蛋白的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與和厚樸酚組比較，和厚樸酚＋抑制劑PPARγ和p-AMPK蛋白的相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，和厚樸酚＋抑制劑組PPARγ和p-AMPK 蛋白的相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。結(jié)果見表5、圖1。

表5 大鼠脂肪組織中PPARγ、p-AMPK 蛋白相對表達(dá)量比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression levels of PPARγand p-AMPK protein in adipose tissue of rats in each group（±s）

表5 大鼠脂肪組織中PPARγ、p-AMPK 蛋白相對表達(dá)量比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression levels of PPARγand p-AMPK protein in adipose tissue of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05；與和厚樸酚組比較，c P＜0.05；與抑制劑組比較，d P＜0.05。

項(xiàng)目 n PPARγ p -AMPK AMPK正常組10 0.95±0.06 0.85±0.05 0.82±0.04模型組 12 0.42±0.05a 0.53±0.06a 0.83±0.05和厚樸酚組 12 0.87±0.06ab 0.77±0.05ab 0.79±0.06抑制劑組 12 0.32±0.05abc 0.32±0.06abc 0.82±0.06和厚樸酚＋抑制劑組 12 0.56±0.06abcd 0.69±0.06abcd 0.80±0.05 F 273.523 159.646 1.144 P＜0.001 ＜0.001 0.346

圖1 Western blot 檢 測 脂 肪 組 織 中PPARγ、p-AMPK 和AMPK 蛋白的表達(dá)Fig.1 Expressions of PPARγ，p-AMPK and AMPK proteins by Western blot

4 討論

HKL是一種天然酚類化合物，具有低毒、高效的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，HKL對多種疾病具有治療作用，例如保護(hù)腎臟免受缺血再灌注損傷、改善由血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓和內(nèi)皮功能障礙及逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲［8-10］。另有研究發(fā)現(xiàn)，HKL 在DM 中同樣發(fā)揮重要作用，它可以通過改善線粒體脂肪酸代謝，對DM 小鼠線粒體功能障礙發(fā)揮抑制作用，還可以改善2型DM 小鼠糖脂代謝［11-12］。PPARs是一類依賴于配體活化的核轉(zhuǎn)錄 因 子，該家族 成 員 包 括PPARγ、PPARα和PPARβ。PPARγ在人體多種組織器官中均有表達(dá)，PPARγ不僅可以調(diào)節(jié)脂肪酸氧化，還可以促進(jìn)骨骼肌表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4的表達(dá)，從而改善DM 患者糖脂代謝紊亂。最近一項(xiàng)研究表明，從DM 小鼠分離出的脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)水平降低，而且胰島素敏感性降低［13］，黃芪多糖激活脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)，減輕由TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗［14］，山柰素和葫蘆巴堿激活PPARγ改善DM 大鼠糖脂代謝異常，同時(shí)減輕胰島素抵抗［15-16］。本研究通過高脂高糖加小劑量STZ誘導(dǎo)建立2型DM 大鼠模型，灌胃給予HKL 和PPARγ抑制劑，探討HKL 對DM 大鼠血糖以及胰島素抵抗的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM大鼠FBG 升 高、體質(zhì)量 減 輕，ISI 顯 著 降低，而HOMA-IR 明 顯 升 高，DM 大 鼠 用HKL 灌 胃 后FBG、HOMA-IR 降低、體質(zhì)量增加、ISI升高；而用PPARγ抑制劑灌胃后FBG 和HOMA-IR 進(jìn)一步升高，體質(zhì)量和ISI進(jìn)一步降低；DM 大鼠同時(shí)用HKL和PPARγ抑制劑灌胃與僅用PPARγ抑制劑灌胃比較，F(xiàn)BG 降低、體質(zhì)量增加、ISI升高以及HOMA-IR降低。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HKL 可降低DM 大鼠血糖水平，增強(qiáng)其對胰島素的敏感性。

AMPK 是維持機(jī)體能量平衡的重要調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控多條代謝通路，例如脂肪酸氧化、糖酵解以及糖異生［17］，此外，水飛薊賓通過激活A(yù)MPK 可抑制由自由脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞炎癥因子的分泌［18］。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激活可使AMPK 發(fā)生磷酸化，通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用從而改善強(qiáng)直性脊柱炎患者的臨床癥狀［19］。脂混合物誘導(dǎo)的人源肝細(xì)胞LO2中PPARγ和AMPK 活性降低，而厄貝沙坦通過激活PPARγ可降低脂質(zhì)沉積以及三酰甘油和總膽固醇含量，對減輕肥胖糖尿病小鼠肝損傷具有重要意義［20］。本實(shí)驗(yàn)通過灌胃給予DM 大鼠PPARγ抑制劑和HKL，探討HKL降低DM 大鼠血糖、增強(qiáng)胰島素敏感性是否通過激活PPARγ和AMPK 發(fā)揮調(diào)控作用。用蛋白印跡法檢測PPARγ和p-AMPK 的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，DM 大鼠PPARγ和p-AMPK 蛋白的表達(dá)水平降低，HKL 上調(diào)PPARγ和p-AMPK蛋白的表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，HKL 激活PPARγ／AMPK 信號通路。

綜上所述，HKL 降低DM 大鼠血糖水平、減輕胰島素抵抗，其可能是通過激活PPARγ／AMPK 信號通路發(fā)揮作用，為臨床治療DM 提供理論依據(jù)。