HPLC-QAMS法同時(shí)測(cè)定紫花燒傷軟膏中10種有效成分的含量

張小折，葉曉婭，田廣林

1.平頂山市食品藥品檢驗(yàn)所，平頂山 467000；2.遂成藥業(yè)股份有限公司，鄭州 451100

紫花燒傷軟膏由紫草、地黃、熟地黃、花椒、黃連、當(dāng)歸、甘草和冰片8味中藥材加工而成，具有清熱涼血、化瘀解毒、止痛生肌的功效，主要用于Ⅰ、Ⅱ度以下燒傷、燙傷的治療，還可用于壓瘡［1-2］的治療，為《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版一部［3］收載品種，是臨床上的常用藥物，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅用氣相色譜法對(duì)佐藥冰片中龍腦的含量進(jìn)行檢測(cè)，未檢索到與該制劑質(zhì)量控制相關(guān)的文獻(xiàn)，難以全面評(píng)價(jià)紫花燒傷軟膏的整體質(zhì)量。中藥復(fù)方制劑由多味中藥材配伍組方，同時(shí)每味中藥材又含有多種藥效成分，具有多靶點(diǎn)、共同奏效等特點(diǎn)，建立多指標(biāo)成分定量控制模式對(duì)提升紫花燒傷軟膏的整體質(zhì)量具有重要意義。高效液相色譜-一測(cè)多評(píng)（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLCQAMS）法［4］利用中藥藥效組分間的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)1種質(zhì)量穩(wěn)定、易得、價(jià)廉的成分進(jìn)行定量測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分的同步檢測(cè)，現(xiàn)在已越來(lái)越多地應(yīng)用于中藥［5-6］及其制劑［7-8］的研究中。本實(shí)驗(yàn)以乙酰紫草素為內(nèi)參物，用HPLC-QAMS法對(duì)紫花燒傷軟膏中10種成分的含量進(jìn)行同步檢測(cè)，首次建立了紫花燒傷軟膏多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)該制劑的整體質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Infinity型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Acclaim 120 C18液相色譜柱（賽默飛世爾科技公司）；Phenomenex Luna C18液相色譜柱（廣州同譜實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Waters XBridge C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)Waters公司）；DL-720D 型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；ME204型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品：毛蕊花糖苷（批號(hào)111530-201914，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%）和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧（批號(hào)111689-201805，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；焦地黃苯乙醇苷B1（批號(hào)PRF7041822，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%，成都普瑞法科技開(kāi) 發(fā) 有 限 公 司）；羥 基-α-山 椒 素（批 號(hào) RFSQ11402007006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.2%），羥基-β-山椒素（批號(hào)RFS-Q11502007016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%），羥基-γ-山椒素（批號(hào)RFS-Q11602011013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%），乙酰紫草素（批號(hào)RFS-Y18811804026，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%），β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧（批號(hào)RFS-Y1510210028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%），異丁酰紫草素（批號(hào)RFS-Y18902102022，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%），異戊酰紫草素（批號(hào)RFS-Y19002102026，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%），均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

紫花燒傷軟膏（規(guī)格：20 g·支－1；批號(hào)：20200302、20200501、20200607）購(gòu)自山東潤(rùn)澤紫花藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選 用 Acclaim 120 C18色 譜 柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）。流動(dòng)相：乙腈-1 m L·L－1磷酸。梯度洗脫：0～11 min，18.0%乙腈；11～20 min，18.0%→32.0%乙腈；20～32 min，32.0%→58.0%乙腈；32～57 min，58.0%→70.0%乙腈；57～70 min，70.0%→18.0%乙腈）。流速：0.9 m L·min－1。檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm（0～20 min檢測(cè)毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1）［9-12］和275 nm（20～70 min羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素）［13-20］。柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素對(duì)照品適量，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇制成 質(zhì) 量 濃 度 依 次 為0.714、0.298、0.576、0.252、0.136、0.982、0.510、0.478、0.634 和1.530 g·L－1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1.0 m L，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇稀釋20倍得混合對(duì)照品溶液（10 種 成 分 的 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為35.7、14.9、28.8、12.6、6.8、49.1、25.5、23.9、31.7、76.5 mg·L－1）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定紫花燒傷軟膏2.0 g，精密加入體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇25 m L，稱質(zhì)量，超聲10 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。取按照紫花燒傷軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［3］分別制備缺紫草、缺花椒、缺地黃和熟地黃的3個(gè)陰性供試品各適量，再按上述方法制得3個(gè)陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性考察

按照2.1項(xiàng)下色譜條件，取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖1。紫花燒傷軟膏供試品溶液中毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，理論板數(shù)按所測(cè)成分色譜峰計(jì)均不低于5 000。陰性供試品對(duì)紫花燒傷軟膏中10種成分的同時(shí)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 m L，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇分別定容至20 m L，得到編號(hào)分別為Ⅰ～Ⅵ的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，并記錄色譜峰的峰面積，以10種成分的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)10 種成分的線性關(guān)系良好。

表1 10種成分線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of linear-regression analysis of the 10 constituents

2.4.2 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份紫花燒傷軟膏供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄色譜峰的峰面積。計(jì)算得10 種成分峰面積的RSD 值依次為1.06%、1.20%、1.13%、1.27%、1.38%、0.69%、1.08%、1.14%、0.99%、0.52%，表明在上述色譜條件下儀器的精密度良好。

取同一批紫花燒傷軟膏，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，各精密吸取10μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，用外標(biāo)法計(jì)算含量。計(jì)算得10種成分含量的RSD 值分別為1.57%、1.71%、1.63%、1.86%、1.92%、1.05%、1.60%、1.58%、1.43%、0.88%，表明建立的方法具有良好的重復(fù)性。

分別于0、2、5、9、16、24 h各精密吸取同一份紫花燒傷軟膏供試品溶液10μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜峰的峰面積。計(jì)算得10種成分峰面積的RSD 值依次為1.02%、1.15%、1.19%、1.30%、1.42%、0.66%、1.05%、1.18%、1.02%、0.57%，表明紫花燒傷軟膏供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.3 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知10種成分含量的同一批紫花燒傷軟膏，每份精密稱定1.0 g，稱取9份并隨機(jī)均分成3 組，精密加入混合對(duì)照品溶液（毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為0.607 g·L－1、焦地黃苯乙醇苷B1質(zhì)量濃度為0.243 g·L－1、羥基-α-山椒素質(zhì)量濃度為0.452 g·L－1、羥基-β-山椒素質(zhì)量濃度 為0.169 g·L－1、羥 基-γ-山 椒 素 質(zhì) 量 濃 度 為0.096 g·L－1、乙酰紫草素質(zhì)量濃度為0.817 g·L－1、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧質(zhì)量濃度為0.379 g·L－1、異丁酰紫草素質(zhì)量濃度為0.341 g·L－1、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧質(zhì)量濃度為0.524 g·L－1、異戊酰紫草 素 質(zhì) 量 濃 度 為1.197 g·L－1）0.8、1.0 和1.2 m L各1組，再按照2.2.2 項(xiàng)下方法制成加樣供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)并記錄色譜峰的峰面積。計(jì)算得10 種成分的平均加樣回收率（RSD 值）分 別 為99.46% （0.73%）、98.27%（1.16%）、97.84% （1.01%）、96.95% （1.45%）、97.18% （1.51%）、100.12% （0.66%）、99.27%（0.92%）、98.56% （1.08%）、99.15% （0.85%）、100.04%（0.78%）。

2.5 相對(duì)校正因子的測(cè)定及其耐用性考察

2.5.1 相對(duì)校正因子的測(cè)定 以乙酰紫草素為內(nèi)參物，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)2.4.1項(xiàng)下編號(hào)為Ⅰ～Ⅵ的混合對(duì)照品溶液，記錄色譜峰峰面積，計(jì)算其他9種成分的相對(duì)校正因子（relative correlation factor，RCF）。RCFk／s＝（Ak／Wk）／（As／Ws）＝（Ak×Ws）／（As×Wk），其中W和A分別表示質(zhì)量濃度和峰面積，k和s分別表示內(nèi)參物和其他待測(cè)成分。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 紫花燒傷軟膏中各成分的RCFTab.2 RCFs of various components in Zihua Burn Ointment

2.5.2 RCF耐用性考察

2.5.2.1 儀器與色譜柱 選用不同品牌高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity型、Waters 2695型）和不同品牌液相色譜柱（Acclaim 120 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Waters XBridge C18柱），考察該條件對(duì)各成分RCF 值的影響，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算各成分的RCF 值，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，各成分RCF 的RSD 值在0.83%～1.91%范圍內(nèi)，表明儀器及色譜柱對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

表3 不同儀器及色譜柱條件下的RCFTab.3 RCFs detected with different instruments and under different chromatographic column conditions

2.5.2.2 流 速 在 流 速0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 m L·min－1條件下，精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)并記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算各成分的RCF 值，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，各成分RCF 的RSD 值在1.01%～1.91%范圍內(nèi)，表明流速對(duì)RCF無(wú)顯著影響。

表4 不同流速條件下的RCFTab.4 RCFs detected under different flow rates

2.5.2.3 柱溫 在柱溫20、22、25、28、30℃條件下，精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)并記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算各成分的RCF值，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，各成分RCF的RSD值在0.97%～1.94%范圍內(nèi)，表明柱溫對(duì)RCF 無(wú)顯著影響。

表5 不同柱溫條件下的RCFTab.5 RCFs detected at different column temperatures

2.5.3 色譜峰定位 分別選用不同品牌的高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity型、Waters 2695型）和不同品牌的液相色譜柱（Acclaim 120 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Waters XBridge C18柱），按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)2.1.1項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，記錄保留時(shí)間，采用相對(duì)保留時(shí)間（relative retention time，RRT）值法對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧、異戊酰紫草素和乙酰紫草素RRT 的RSD 值在0.78%～1.78%范圍內(nèi)，表明采用RRT 值法可以對(duì)目標(biāo)化合物色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。

表6 儀器及色譜柱對(duì)RRT的影響Tab.6 Effects of instruments and chromatographic columns on RRT

2.6 含量測(cè)定

為驗(yàn)證建立的HPLC-QAMS 法的準(zhǔn)確性及可行性，取紫花燒傷軟膏，依法制備供試品溶液并進(jìn)樣檢測(cè)，分別以HPLC-QAMS法和外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，對(duì)比2 種方法檢測(cè)結(jié)果的差異。結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，ESM 和HPLC-QAMS法測(cè)得的結(jié)果無(wú)顯著差異，表明HPLC-QAMS法可以用于檢測(cè)紫花燒傷軟膏中10種成分的含量。

表7 紫花燒傷軟膏中10種成分含量的測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.7 Determination results of 10 components in Zihua Burn Ointment（n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇

紫花燒傷軟膏由紫草、黃連、地黃、熟地黃、當(dāng)歸、花椒、冰片和甘草加工而成，處方中紫草具有涼血活血、生肌止痛的功效，黃連具有清熱燥濕的功效，二者合為君藥；生地能夠清熱涼血、瀉火滋陰，熟地能夠填精補(bǔ)髓，與養(yǎng)血活血的當(dāng)歸共為臣藥；佐藥包括能夠生肌止痛、瀉火的冰片與能夠溫通經(jīng)絡(luò)、止痛止癢的花椒；使藥甘草調(diào)和諸藥、緩急止痛。諸藥合用，清熱涼血、化瘀生肌。為客觀評(píng)價(jià)紫花燒傷軟膏的內(nèi)在整體質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以君藥紫草的主要活性成分乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素，臣藥生地、熟地的主要代表性成分毛蕊花糖苷和焦地黃苯乙醇苷B1，以及佐藥花椒的主要成分羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素為分析指標(biāo)，采用HPLCQAMS法測(cè)定其含量。

3.2 供試品溶液制備方法的確定

本實(shí)驗(yàn)在確定供試品溶液制備方法時(shí)，考察了以體積分?jǐn)?shù)25%甲醇［10-11］、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇［9］、甲醇［12-14］、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇［16］、石油醚［17-18］為提取溶劑，以超聲和加熱回流方法時(shí)10種成分的提取率，結(jié)果顯示，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇超聲提取時(shí)，10種待測(cè)成分的響應(yīng)值較大。繼而以體積分?jǐn)?shù)50%甲醇為溶劑，考察了提取時(shí)間5、10、15、20、40 min對(duì)10種成分的含量及雜質(zhì)含量的影響，結(jié)果顯示，提取10 min時(shí)，已基本提取完全，故選取體積分?jǐn)?shù)50%甲醇提取10 min為供試品溶液的制備方法。

3.3 流動(dòng)相的優(yōu)化篩選

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化篩選流動(dòng)相時(shí)，分別以乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液［9］、乙腈-2 m L·L－1磷酸溶液［12］、乙腈-水［10-11］、甲 醇-水［13］、乙 腈-1 m L·L－1甲 酸 溶液［20］為流動(dòng)相，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)供試品溶液，對(duì)不同流動(dòng)相條件下的HPLC 圖進(jìn)行分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)將乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，基線平穩(wěn)，峰形較好，各成分響應(yīng)值大，進(jìn)而又摸索了有機(jī)相與水相的比例，最終確定以2.1項(xiàng)下的色譜條件檢測(cè)紫花燒傷軟膏中10種成分的含量。

本實(shí)驗(yàn)以乙酰紫草素作為內(nèi)參物，用HPLCQAMS法對(duì)紫花燒傷軟膏中毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡寧和異戊酰紫草素含量進(jìn)行了檢測(cè)分析，考察了RCF 的耐用性，將ESM法與HPLC-QAMS法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示在該色譜條件下RCF具有較好的耐用性，用ESM法與HPLC-QAMS法獲得的結(jié)果間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)全面評(píng)價(jià)紫花燒傷軟膏的質(zhì)量具有重要意義。