響應(yīng)面法優(yōu)選青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取工藝

劉旭陽，張 慧，王仕寶，魏曉琴，向 儀

1.漢中市南鄭區(qū)食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，漢中 723000；2.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，漢中 723000

青牛膽［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］來源于防己科青牛膽屬植物，分布于湖北西部和西南部、陜西南部、四川東部至西南部等地區(qū)［1］。青牛膽以塊根入藥，中藥名金果欖，收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》），具有清熱解毒、利咽止痛的功效［2］。青牛膽屬植物的化學(xué)成分主要有生物堿類、甾酮類、萜類、苯丙素等化合物［3-5］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，青牛膽屬植物具有多種藥理活性，心葉青牛膽具有抗氧化、抗菌、抗毒、抗應(yīng)激、降血脂、降血糖、抗癌等作用［3］，海南青牛膽具有抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗菌、止痛、肌肉松弛和促進(jìn)血液循環(huán)的作用［6］，波葉青牛膽在安全劑量范圍內(nèi)，可降低糖尿病腎病小鼠的血糖及總膽固醇，并改善其腎功能狀態(tài)［7］，寬筋藤具有抗炎［8］及抗輻射的作用［9］。臨床常用于咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹疼痛等癥的治療［10］；并且其在毒蛇咬傷［11］、糖尿病和卵巢癌治療等方面也表現(xiàn)出一定的療效［4］。藥根堿和巴馬汀為小檗堿類生物堿，是青牛膽塊根中的重要成分。小檗堿類生物堿生物活性多樣，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗炎以及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的作用，在抗菌消炎、止瀉止痢方面有獨(dú)特的作用［12］。本文基于高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），用響應(yīng)面法優(yōu)選青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取工藝，可為青牛膽中小檗堿類生物堿的檢測及開發(fā)、利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260B型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；UV-1900PC型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XFB-200型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）；DS-8510DTH 型超聲清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）；ESJ50-5型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品：藥根堿（編號(hào)Z05D10X104878，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%），鹽酸巴馬汀（編號(hào)Z16J10X79792，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%），均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

青牛膽塊根于2020年4月15日采于陜西省漢中市寧強(qiáng)縣，經(jīng)王仕寶副教授鑒定為防己科青牛膽［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］的塊根；在采集到的青牛膽塊根樣品中，選取大小適中者，常溫干燥后保存；實(shí)驗(yàn)前粉碎，過3號(hào)篩，密封備用。

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A、3 m L·L－1的磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：225 nm；流速：1.0 m L·min－1；柱溫：25℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Mobile phase gradient program

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取鹽酸巴馬汀、藥根堿對(duì)照品適量，置于量瓶中，用甲醇定容，配制成鹽酸巴馬汀、藥根堿的終質(zhì)量濃度分別為165.6、115.6μg·m L－1的混合對(duì)照品溶液，置于4℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取青牛膽塊根粉末約1.0 g，精密稱定質(zhì)量，置于錐形瓶中，精密量取20 m L 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇加入錐形瓶中，精密稱定質(zhì)量，回流提取40 min，冷卻，放冷后用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液過0.22μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

依次精密量取混合對(duì)照品溶液0.4、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10 m L 量瓶中，加甲醇定容，用0.22μm 微孔濾膜過濾，依次進(jìn)樣10μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，見圖1。以藥根堿峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線，回 歸 方 程 為y1＝43.803x1＋26.66，R2＝0.999 6。結(jié)果表明，藥根堿質(zhì)量濃度在4.624～92.48μg·m L－1范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以鹽酸巴馬汀峰面積為縱坐標(biāo)（y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y2＝39.914x2－25.557，R2＝0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度在6.624～132.48μg·m L－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

按照2.1項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測得藥根堿和鹽酸巴馬汀峰面積的RSD 值分別為0.78%、0.72%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，于2、4、8、10、12、24 h分別測定藥根堿和鹽酸巴馬汀的峰面積，計(jì)算得峰面積的RSD 值分別為1.18%、0.74%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一樣品5份，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定藥根堿和鹽酸巴馬汀的峰面積。計(jì)算得峰面積的RSD 分別為1.9%、1.8%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取青牛膽樣品粉末0.5 g，共6份，精密稱定，精密加入藥根堿和鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測定，分別計(jì)算藥根堿和鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率和RSD 值。結(jié)果見表2。由表2 可知，藥根堿和鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率分別為101.6%、102.6%，RSD 值分別為1.51%、1.11%。

表2 藥根堿、鹽酸巴馬汀加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride

2.9 單因素實(shí)驗(yàn)

考察了浸漬法、回流提取、超聲提取對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響。結(jié)果顯示，回流提取的效果較好，故本實(shí)驗(yàn)選擇回流提取進(jìn)行操作。以藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量之和為考察指標(biāo)，采用單因素法分別對(duì)提取溶劑、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察。

2.9.1 提取溶劑 在參照文獻(xiàn)中方法的基礎(chǔ)上，分別以不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇為提取溶劑，固定液料比20∶1，加熱回流提取40 min，制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行藥根堿和鹽酸巴馬汀含量的測定。結(jié)果表明，將體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇作為提取溶劑時(shí)提取量較高，考慮到乙醇較為安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保，故選擇將體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取溶劑。見表3。

表3 提取溶劑對(duì)藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響（n＝3）Tab.3 Effect of extraction solvent on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride（n＝3）

2.9.2 液料比

以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，加熱回流提取30min，考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1對(duì)青牛膽藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，提取量達(dá)到最大值。

2.9.3 提取時(shí)間 以體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取溶劑，料液比為20∶1，加熱回流提取20、40、60、90、120 min，考察不同提取時(shí)間對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響。結(jié)果表明，提取時(shí)間為40 min時(shí)，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達(dá)到最大值。

2.10 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)

2.10.1 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用響應(yīng)面軟件Design Expert 11.0設(shè)計(jì)方法，以影響青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取工藝的4個(gè)顯著因素（溶劑體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和次數(shù)）為自變量、青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量之和（y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析［13-15］。因素與水平設(shè)計(jì)見表4，結(jié)果見表5。

表4 因素與水平Tab.4 Factors and levels

表5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Tab.5 Response surface analysis scheme and results

將表5中的數(shù)據(jù)輸入Design Expert 11軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量與各因素變量的關(guān)系方程：y＝1.4－0.233 3A＋0.022 0B＋0.014 0C＋0.020 2D－0.008 7AB＋0.021 0AC－0.036 2AD－0.025 2BC＋0.040 5BD－0.013 3CD－0.227 3A2－0.047 3B2－0.057 8C2－0.157 3D2。方差分析結(jié)果見表6。

在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，一次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)的絕對(duì)值A(chǔ)明顯大于B、C、D，說明提取溶劑對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量影響最大。

由表6可知，該模型（F＝79.29，P＜0.000 1）極為顯著，表明響應(yīng)回歸模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型中失擬項(xiàng)（F＝2.60，P＝0.184 8＞0.05）不顯著，表明差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該模型設(shè)計(jì)合理。該模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.987 5，表明該回歸模型擬合性好、回歸方程代表性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值一致性良好。模型校正系數(shù)＝0.975 1，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量97.51%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分布在響應(yīng)面方程中，僅有2.49%實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能解釋其響應(yīng)值的變化。復(fù)相關(guān)系數(shù)和校正系數(shù)R2值均接近1，表明該模型能夠有效預(yù)測響應(yīng)面值；y的變異系數(shù)為2.65%，變異系數(shù)較小，表明該模型方法的精確度和可靠性相對(duì)較高。方差分析結(jié)果表明，方程中的A、B、D、AD、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故可用此模型對(duì)提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.6 Results of analysis of variance of regression model

2.10.2 因素間的交互影響 結(jié)果顯示，交互項(xiàng)AD、BD有較高的顯著性，表明提取溶劑、液料比和提取次數(shù)的交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量有較顯著影響。經(jīng)Design Expert 11.0軟件處理，得到了提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）和提取次數(shù)（D）交互作用的響應(yīng)面三維圖和等高線圖，見圖2～圖7。其中AD、BD在等高線圖中呈橢圓形，說明2個(gè)因素間交互作用較強(qiáng)，對(duì)提取量的影響顯著。

由圖2～圖7可知，溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)、液料比與提取次數(shù)的交互作用均顯著，溶劑體積分?jǐn)?shù)與液料比、溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、液料比與提取時(shí)間、提取時(shí)間與提取次數(shù)的交互作用均不顯著。由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度相對(duì)較為陡峭，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量對(duì)溶劑體積分?jǐn)?shù)和提取次數(shù)的改變較為敏感。提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，提取次數(shù)為2次，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達(dá)到最大值。由圖4可知，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的變化對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響，相比提取次數(shù)變化對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響大。由圖6可知，響應(yīng)曲面的坡度相對(duì)較為陡峭，表明青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量對(duì)液料比和提取次數(shù)的改變較為敏感。

圖2 溶劑體積分?jǐn)?shù)與液料比交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.2 Effect of interaction between solvent concentration and liquid-material ratio on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖4 溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取次數(shù)交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.4 Effect of interaction between solvent concentration and extraction times on the extraction jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖7 提取時(shí)間與提取次數(shù)交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.7 Effect of interaction between extraction time and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

結(jié)果顯示，液料比為16∶1，提取次數(shù)為2次，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量達(dá)到最大值。由圖6可知，提取次數(shù)的變化對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響，相比于液料比變化對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響大。

圖6 液料比與提取次數(shù)交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.6 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖3 溶劑體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.3 Effect of interaction between solvent concentration and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

圖5 液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀提取量的影響Fig.5 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

2.10.3 最佳工藝驗(yàn)證 用Design Expert 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇為提取溶劑、液料比為16∶1、提取時(shí)間為40 min、連續(xù)提取2 次為青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取條件。在此條件下進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取量分別為1.439、1.448、1.443 mg·g－1，與預(yù)測值（1.464 mg·g－1）幾乎一致，表明用響應(yīng)面分析法優(yōu)化青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取工藝是可行的。

3 討論

生物堿類成分是許多藥用植物的重要有效成分，具有一定的生物活性。青牛膽塊根富含生物堿、二萜類和黃酮類化合物［4］，其中小檗堿類生物堿巴馬汀和藥根堿是主要的成分，藥理活性較好，具有抗幽門螺桿菌、抗癌、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［16-18］，故選擇藥根堿和巴馬汀的提取量作為考察指標(biāo)。將藥根堿和鹽酸巴馬汀的對(duì)照品溶液分別在190～400 nm 紫外波長下掃描，結(jié)果顯示，在225、265、345 nm 處均有吸收峰，但在345 nm 波長處的基線較225、265 nm 處平穩(wěn)，這可能是由于部分官能團(tuán)和共軛結(jié)構(gòu)在225、265 nm附近有吸收，而在345 nm 附近無吸收［19］，故考慮將225、265 nm 作為檢測波長。根據(jù)實(shí)際液相檢測效果，發(fā)現(xiàn)以225 nm 作為檢測波長，既可對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析，又可將相關(guān)物質(zhì)有效檢出，從而較為全面地反映樣品的信息，故將225 nm 作為檢測波長較為適宜。此外，本研究通過對(duì)流動(dòng)相的考察，分別以水-甲醇、水-乙腈、3 m L·L－1磷酸溶液-甲醇、3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)以3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰分離較好，拖尾現(xiàn)象較少，故以3 mL·L－1磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相。在選擇色譜柱時(shí)，發(fā)現(xiàn)Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的分析效果較InertSustaun C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）好，故選用Agilent Extend-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。

由于產(chǎn)區(qū)、采收季節(jié)、提取和檢測方法不同，生物堿成分的類別和含量存在一定差異。陳旭冰等［20］研究發(fā)現(xiàn)，不同生長年限青牛膽塊根中巴馬汀和藥根堿的含量有明顯變化，在第一年時(shí)含量均較高，隨著生長年限的增加，含量逐漸降低，生長到第四年時(shí)（塊根長到3.0 g以上）含量達(dá)到最大值（巴馬汀0.14%，藥根堿0.10%），之后含量略有下降。也有文獻(xiàn)報(bào)道［21］，用HPLC-ESI-MS／MS 同時(shí) 測定金果 欖 中5種成分含量，通過對(duì)產(chǎn)自廣西的3 批金果欖進(jìn)行測定，其中鹽酸巴馬?。ㄕ迫~防己堿）、藥根堿的含量分別在40.89～45.14、3.56～4.21 mg·g－1范圍內(nèi)，而本課題研究中鹽酸巴馬汀、藥根堿的含量檢測最大值分別為1.049、0.413 mg·g－1。本研究在初步考察青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的提取工藝時(shí)，比較了浸漬法、回流提取、超聲提取對(duì)青牛膽中小檗堿類生物堿提取量的影響，結(jié)果顯示，回流提取生物堿量相對(duì)較多，故本實(shí)驗(yàn)選擇回流提取法進(jìn)行操作。除此之外，提取溶劑、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)均會(huì)影響提取效果。基于響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，以藥根堿和巴馬汀的提取量之和作為考察指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，探究青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的最佳提取工藝，即提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇、液料比為16∶1、提取時(shí)間為40 min、提取次數(shù)為2次。按照最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，青牛膽塊根中藥根堿和鹽酸巴馬汀的實(shí)際測定值與預(yù)測值基本一致。