基于生物活性導(dǎo)向分離及灰色關(guān)聯(lián)分析的新疆紫草抑菌物質(zhì)基礎(chǔ)研究

毛 艷，王新堂，賀金華

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004

新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle）Johnstn］又名軟紫草，為紫草科多年生草本植物，現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版一部［1］，具有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑的功效。中國藥用紫草中的70%產(chǎn)自新疆。新疆紫草主要分布于新疆的天山南北坡和西藏的西部等地，是新疆維吾爾族和哈薩克族民間常用藥材。據(jù)文獻(xiàn)報道，紫草中的萘醌類化合物具有很強(qiáng)的抑菌活性，但對其抑菌藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)研究僅局限于評價紫草提取物或某幾種紫草色素（如β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、紫草素等［2-5］）的抑菌藥效機(jī)制，對其關(guān)鍵藥效組分、雖不是藥效組分但起到協(xié)同作用的成分和無效成分的研究未見報道。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上［6-8］，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）建立新疆紫草不同極性溶劑提取物的指紋圖譜，用灰色關(guān)聯(lián)度分析［9-13］對新疆紫草的特征性指紋峰和抑菌作用進(jìn)行關(guān)聯(lián)，探討其譜-效關(guān)系，從而推測發(fā)揮抑菌作用的主要藥效物質(zhì)。借鑒已報道方法［14-15］，對抑菌譜-效關(guān)系中關(guān)聯(lián)度較高的成分進(jìn)行驗證，從新疆紫草提取物中分離得到抑菌目標(biāo)成分并獲得不含目標(biāo)成分的陰性樣品，將所有樣品的抑菌藥效進(jìn)行等效性對比，以有效辨識新疆紫草的抑菌活性藥效物質(zhì)。研究過程強(qiáng)調(diào)把脂溶性成分作為一個整體，其目標(biāo)成分的譜-效關(guān)系始終與脂溶性成分整體進(jìn)行比較，以體現(xiàn)中醫(yī)藥整體觀、系統(tǒng)觀的特點和優(yōu)勢［16-17］，為進(jìn)一步探討新疆紫草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗依據(jù)，為開發(fā)新的廣譜抑菌活性藥物奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器、四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、4～40℃恒溫箱）購自美國Thermo Scientific Technologies公司；Waters 2545制備型液相色譜儀（美國Waters公司）；CPA225D 型電子天平（德國Sartorius公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（上海比朗儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

對照品：紫草素（批號110769-200405），乙酰紫草素（批號1601105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%），異丁酰紫草素（批號170223，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.91%），均購自深圳健竹生物科技有限公司；β-乙酰氧基異戊酰紫草素（批號Must-18071610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.44%），β，β′-二甲基丙烯酰紫草素（批號Must-1701201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.60%），均購自成都曼思特生物科技有限公司。Mueller-Hinton水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物制品有限公司）。

新疆紫草（產(chǎn)地為新疆八音布魯克，野生，采收日期為2016年8月），由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員鑒定為紫草科植物新疆紫草［Arnebia euchroma（Royle）Johnst.］的干燥根。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品各適量，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成紫草素、乙酰紫草素、異丁酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素質(zhì)量濃度分別為0.022 2、0.175 5、0.080 6、0.037 7、0.140 8 mg·m L－1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 分別稱取新疆紫草各50 g，粉碎，分別加入500 m L 石油醚（60～90℃）及體積分?jǐn)?shù)為95%、75%、50%、30%的乙醇溶液和水，加熱回流提取2次（60℃），每次1.5 h，過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至50 m L，備用，得6種不同極性溶劑提取物，樣品編號為S1～S6。精密量取各新疆紫草不同極性溶劑提取物0.4 m L，置于10 m L 量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液超聲使溶解，定容，搖勻，即得各新疆紫草供試品溶液。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，以建立指紋圖譜。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-1 m L·L－1甲酸溶液（B）；梯度洗脫：0～15 min，55%～65%A；15～20 min，65%～70%A；20～25 min，70%A；25～25.5 min，70%～60%A；25.5～35 min，60%A；流速：1 m L·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：275 nm；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果見圖1。

圖1 新疆紫草S3樣品和混合對照品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Arnebia euchroma S3 sample and mixed reference substances

2.2.2 方法學(xué)考察 分別取2.1.2 項下供試品溶液，參照2.2.1 項下條件進(jìn)行指紋圖譜方法學(xué)的考察。

精密度實驗：16個共有峰相對保留時間RSD（n＝6）＜0.08%，相對峰面積的RSD（n＝6）＜2.99%，符合指紋圖譜技術(shù)要求中精密度實驗的有關(guān)規(guī)定（RSD＜3%），表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

重復(fù)性實驗：16個共有峰相對保留時間的RSD（n＝6）＜0.08%，相對峰面 積 的RSD （n＝6）＜4.85%，表明方法的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜研究技術(shù)的要求。

穩(wěn)定性實驗：結(jié)果表明，在0、4、8、12、24 h內(nèi)16個共有峰相對保留時間的RSD（n＝6）＜0.17%，相對峰面積的RSD（n＝6）＜3.33%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定，表明該方法符合分析的要求。

2.2.3 共有峰的標(biāo)定和特征峰的標(biāo)定 建立新疆紫草6個不同極性溶劑提取物的HPLC 指紋圖譜，結(jié)合前期研究結(jié)果［6-8］，通過對照品比對指認(rèn)5個共有峰，分別為紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰紫草素、異丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素。用相對保留時間標(biāo)定共有峰16個，其中9號色譜峰（乙酰紫草素）的分離度和重復(fù)性均好、保留時間合適、特征性較強(qiáng)，因此將其作為指紋圖譜的參照峰。結(jié)果見圖2。

圖2 新疆紫草不同極性溶劑提取物的指紋圖譜Fig.2 Fingerprints of different polar solvent extracts of Arnebia euchroma

2.2.4 指紋圖譜的生成及相似度評價 將經(jīng)過積分處理的樣品色譜圖“AIA 文件”導(dǎo)入“國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件中，以樣品S4的圖譜作為參照圖譜，設(shè)定時間窗為0.3 min，采用中位數(shù)法，按Mark峰進(jìn)行自動匹配，生成對照指紋圖譜，并進(jìn)行相似度分析［9-11］。相似度評價結(jié)果見表1。

表1 新疆紫草不同極性溶劑提取物指紋圖譜相似度的評價結(jié)果Tab.1 Similarity evaluation results of fingerprints of different polar solvent extracts in Arnebia euchroma

結(jié)果顯示，6個樣品的相似度較低，說明各新疆紫草不同極性溶劑提取物成分的差異較大，可以為新疆紫草抑菌譜-效關(guān)系的研究提供數(shù)據(jù)支持。

2.3 新疆紫草不同極性溶劑提取物體外抑菌活性有效部位的篩選

2.3.1 菌液的制備 Mueller-Hinton水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基是用于對生長較快的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感實驗的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。測試菌要求：選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)菌，用生理鹽水校正濃度至0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬?08cfu·m L－1備用。藥敏紙片的制備：選擇優(yōu)質(zhì)新華1號濾紙，用打孔器制成直徑為6 mm 的圓形濾紙片。每200張1管，經(jīng)120℃、2 h滅菌后備用。

2.3.2 抑菌測定方法 用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁內(nèi)將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后在瓊脂表面均勻涂布接種3次，再次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周。平板在室溫下干燥3～5 min，將藥敏紙片貼在瓊脂平板表面，紙片間的距離不小于24 mm，藥敏紙片與平板內(nèi)緣的距離大于15 mm。貼好紙片后，需在15 min內(nèi)置于35℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，孵育24 h后閱讀結(jié)果。培養(yǎng)后取出平板，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑。根據(jù)抑菌圈的大小判斷細(xì)菌對各組分的敏感性，抑菌圈越大表明抑菌活性越強(qiáng)。結(jié)果見表2。

表2 新疆紫草不同極性溶劑提取物抑菌活性的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.2 Antibacterial test results of different polar solvent extracts in Arnebia euchroma（±s，n＝3）

表2 新疆紫草不同極性溶劑提取物抑菌活性的測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.2 Antibacterial test results of different polar solvent extracts in Arnebia euchroma（±s，n＝3）

編號 抑菌圈直徑／mm金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 銅綠假單胞菌S1 12.47±0.46 0.90±2.32 0 S2 16.40±0.61 0.79±2.52 0 S3 13.27±0.44 0 0 S4 17.00±0.59 0 0 S5 17.80±0.56 0.80±2.17 0 S6 16.17±1.56 0 0

由表2可見，S1～S6號樣品對金黃色葡萄球菌均有抑菌、殺菌作用，效果較好。S1、S2、S5號樣品對大腸桿菌有抑菌、殺菌作用，但效果較差。S1～S6號樣品對銅綠假單胞菌均無抑菌、殺菌作用。

2.4 新疆紫草不同極性溶劑提取物指紋圖譜特征與抑菌作用的灰色關(guān)聯(lián)度分析

用灰色關(guān)聯(lián)分析法［12-16］，對新疆紫草不同極性溶劑提取物的指紋特征峰與體外抑菌活性的相關(guān)性進(jìn)行分析，計算16個共有特征峰與體外金黃色葡萄球菌抑菌效力和大腸桿菌抑菌效力的關(guān)聯(lián)度，并對結(jié)果進(jìn)行排序，得關(guān)聯(lián)序，確定各成分對體外抑菌活性貢獻(xiàn)大小的排序。結(jié)果見表3。

表3 共有峰與體外抑菌活性關(guān)聯(lián)度的結(jié)果Tab.3 Correlation between common peaks and antibacterial activity in vitro

由以上結(jié)果可知，16個共有峰代表的化學(xué)成分中有15個與體外抑菌活性的關(guān)聯(lián)度均大于0.55，說明新疆紫草的藥效是多成分共同起效的結(jié)果。綜合考慮16個共有峰峰面積的大小及體外抑菌活性的關(guān)聯(lián)序，9、3、5號峰對應(yīng)的化合物可能在新疆紫草發(fā)揮抑制金黃色葡萄球菌藥效中發(fā)揮重要作用，9、13、12號峰對應(yīng)的化合物可能在新疆紫草發(fā)揮抑制大腸桿菌藥效中發(fā)揮重要作用，其他色譜峰對應(yīng)的化合物可能也對新疆紫草提取物的抑菌藥效有一定的貢獻(xiàn)，今后將進(jìn)行深入研究。其中9號峰（乙酰紫草素）、5號峰（紫草素）的抑菌作用較好，且易于敲除制備，可用于后續(xù)對藥效物質(zhì)的驗證。

2.5 基于目標(biāo)成分敲除的新疆紫草抑菌藥效物質(zhì)的辨識

2.5.1 樣品的制備 根據(jù)2.4項下抑菌作用的灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果，用制備高效液相色譜（preparative high performance liquid chromatography，prep-HPLC）分別在線敲除乙酰紫草素和紫草素，并收集相應(yīng)陰性物質(zhì)。Peek管的一端連接檢測器，另一端用于收集洗脫液，當(dāng)洗脫程序開始后，洗脫液經(jīng)Peek管尾端流出并收集在棕色瓶A 中，當(dāng)目標(biāo)組分峰出現(xiàn)時，迅速轉(zhuǎn)移至棕色瓶B 中，直至其洗脫完畢，再繼續(xù)收集剩余洗脫成分至棕色瓶C 中，直至程序結(jié)束，合并棕色瓶A 和C中的物質(zhì)，即為相應(yīng)陰性物質(zhì)，重復(fù)該步驟可將任意目標(biāo)峰徹底敲除，并收集敲除后的剩余成分洗脫液［18-23］。最后將收集到的洗脫液合并，減壓濃縮（－0.09 MPa，－50℃），冷凍干燥，得到固體粉末，用于后續(xù)體外抑菌活性的評價。

2.5.2 新疆紫草中乙酰紫草素和紫草素的含量 參見前期工作基礎(chǔ)［6］，新疆紫草中乙酰紫草素和紫草素的含量分別為10.690、0.526 mg·g－1。

2.5.3 在線敲除新疆紫草中乙酰紫草素及其陰性物質(zhì)

2.5.3.1 prep-HPLC 色譜條件 色譜柱：YMCPack R＆D ODS-A（250 mm×20 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）-水（B）；梯度洗脫：0～16 min，80%A；16～16.01 min，80～95%A；16.01～24 min，95%A；24～24.01 min，95%～80%A；24.01～26 min，80%A；流速：17 m L·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 m L；檢測波長：275 nm。

2.5.3.2 樣品收集 4～15、19～28 min時的洗脫液為乙酰紫草素陰性物質(zhì)，將兩者合并，即為樣品Y2。15.4～18.4 min時的洗脫液為目標(biāo)峰乙酰紫草素，即為樣品Y3。進(jìn)行HPLC驗證，結(jié)果見圖3。分別收集約1 g新疆紫草提取液中的目標(biāo)成分乙酰紫草素和陰性物質(zhì)洗脫液，減壓濃縮（－0.09 MPa，50℃），冷凍干燥，得到固體粉末，冷凍備用。

圖3 乙酰紫草素目標(biāo)峰及其陰性樣品色譜圖Fig.3 Chromatograms of acetyl shikonin’s target peak and its negative sample

2.5.4 在線敲除新疆紫草中的紫草素及其陰性物質(zhì)

2.5.4.1 prep-HPLC 色譜條件 流動相：甲醇（A）-水（B）；梯度洗脫：0～11 min，80%A；11～11.01 min，80～95%A；11.01～19 min，95%A；19～19.01 min，95%～80%A；19.01～20 min，80%A；流速：18 m L·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 m L；檢測波長：275 nm。

2.5.4.2 樣品收集 3.5～7.8、9.7～18.0 min 的洗脫液為紫草素陰性物質(zhì)，將兩者合并，即為樣品Y4。8.0～9.5 min時的洗脫液為目標(biāo)峰紫草素，即樣品Y5。進(jìn)行HPLC 驗證，結(jié)果見圖4。分別收集約1 g新疆紫草提取液中的目標(biāo)成分紫草素和陰性物質(zhì)洗脫液，減壓濃縮（－0.09 MPa，50℃），冷凍干燥，得到固體粉末，備用。

圖4 紫草素目標(biāo)峰及其陰性樣品色譜圖Fig.4 Chromatograms of shikonin's target peak and its negative sample

2.5.5 新疆紫草抑菌目標(biāo)成分及其陰性物質(zhì)體外抑菌活性測定

2.5.5.1 樣品制備 新疆紫草提取物（Y1）：根據(jù)2.1.2項下方法，將新疆紫草體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取液濃縮為質(zhì)量濃度為1 g·m L－1的溶液。

乙酰紫草素目標(biāo)成分（Y3）及其陰性物質(zhì)（Y2）：分別將2.5.3.2項下固體粉末用0.4 m L 甲醇完全溶解，用純化水定容至1 m L，混勻，即得。

紫草素（Y5）及其紫草素陰性物質(zhì)（Y4）：分別將2.5.4.2項下固體粉末用0.4 m L 甲醇完全溶解，用純化水定容至1 m L，混勻，即得。

空白對照（Y0）：取0.4 m L 甲醇，用純化水定容至1 m L，混勻，即得。

乙酰紫草素對照品（Y6）和紫草素對照品（Y7）：分別精密稱取乙酰紫草素對照品和紫草素對照品適量，用0.4 m L甲醇完全溶解，用純化水定容至1 m L，分別制成質(zhì)量濃度為10.69、0.526 mg·m L－1的對照品溶液。

2.5.5.2 抑菌活性測定方法 按照2.3.2項下方法進(jìn)行測定。結(jié)果見表4。

表4 抑菌活性測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.4 Antibacterial test results（±s，n＝3）

表4 抑菌活性測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab.4 Antibacterial test results（±s，n＝3）

編號 抑菌圈直徑／mm金黃色葡萄球菌 大腸桿菌 銅綠假單胞菌Y1 9.47±1.15 0.89±0.02 0 Y2 0 0 0 Y3 4.13±0.31 0 0 Y4 8.63±0.96 0 0 Y5 7.60±0.10 0 8.97±0.24 Y6 4.07±0.15 0 0 Y7 0 0 7.39±0.12

Y1、Y4、Y5于孵育4 h后閱片時發(fā)現(xiàn)，有明顯的銅綠假單胞菌抑菌圈，但是孵育24 h后，僅有Y5有銅綠假單胞菌抑菌圈，表明Y1和Y4具有殺菌藥效，但沒有抑菌藥效。

3 討論

本文首先對新疆紫草的抑菌藥效進(jìn)行研究，結(jié)合化學(xué)指紋圖譜，完成了譜-效關(guān)系分析，推測可能的藥效物質(zhì)。為進(jìn)一步實現(xiàn)新疆紫草關(guān)鍵藥效物質(zhì)的辨識，隨后采用基于中藥成分“敲除／敲入”模式策略，對敲除目標(biāo)成分的活性進(jìn)行驗證，初步篩選并確定新疆紫草的主要活性成分，為后期體內(nèi)藥效考察提供理論依據(jù)與實驗支持。此研究模式的建立對快速辨識復(fù)雜中藥中關(guān)鍵藥效物質(zhì)具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究首次采用基于目標(biāo)成分“敲除”模式，以紫草素與乙酰紫草素為目標(biāo)成分，通過體外抑菌實驗，研究新疆紫草的主要抑菌物質(zhì)，該模式能較好地體現(xiàn)中醫(yī)藥的整體觀、系統(tǒng)觀以及多成分協(xié)同或拮抗作用的特點。根據(jù)前述評判依據(jù)，結(jié)合表4 中的數(shù)據(jù)可知：①乙酰紫草素目標(biāo)峰對金黃色葡萄球菌有抑制作用，但是較新疆紫草提取物抑菌能力稍弱，而乙酰紫草素陰性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌無抑制作用，因此，推測乙酰紫草素為新疆紫草提取物抑制金黃色葡萄球菌的主要藥效成分之一，紫草素與新疆紫草對金黃色葡萄球菌的抑制作用沒有直接關(guān)系；②紫草素及其陰性物質(zhì)都有類似新疆紫草提取物的抑制金黃色葡萄球菌的作用，推測紫草素與新疆紫草抗金黃色葡萄球菌的藥效并無直接關(guān)系。紫草素目標(biāo)峰對銅綠假單胞菌有抑制作用，而紫草素陰性物質(zhì)對銅綠假單胞菌無抑制作用，推測紫草素為新疆紫草提取物中抗銅綠假單胞菌的主要藥效成分之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)乙酰紫草素與紫草素均為新疆紫草中主要的抑菌藥效物質(zhì)，但是新疆紫草中的萘醌類物質(zhì)哪些發(fā)揮主要作用、哪些發(fā)揮協(xié)同作用還不清楚。因此，明確新疆紫草的化學(xué)成分、相互作用的方式等，能夠為進(jìn)一步研究新疆紫草抑菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。