不同宿根年限甘蔗品種內(nèi)源激素及酶活性分析

程 琴 譚秦亮 李佳慧 朱鵬錦 周全光 歐克緯 盧業(yè)飛 呂 平 龐新華

（廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，530001，廣西南寧）

科學種蔗主要是選育生產(chǎn)量和含糖量高的品種進行栽培應用，新植是生產(chǎn)過程中成本投入最高的環(huán)節(jié)，制糖成本降低的關(guān)鍵是降低原料蔗的生產(chǎn)成本[1]。而宿根性的好壞直接影響到生產(chǎn)成本和收益[2]，宿根性強的品種可有效延長宿根年限，不僅節(jié)省種莖和翻種勞動力等生產(chǎn)成本，增加收入[3]，還促進甘蔗早生快發(fā)，且生長周期長有利于提前熟期、增產(chǎn)增糖[4-5]。

甘蔗宿根性是維持甘蔗品種常年穩(wěn)定高產(chǎn)的關(guān)鍵，目前對甘蔗宿根性的分析主要依賴于田間性狀表現(xiàn)[6]，而田間觀察及數(shù)據(jù)收集所需時間長，使用土地面積和工作量大[7]。因此，通過生理指標找到影響品種宿根性的關(guān)鍵性狀來作為早期宿根品種篩選的評價指標，對遺傳育種具有較大的指導作用。

甘蔗宿根性影響因子可分為內(nèi)因和外因，內(nèi)因主要包括蔗芽的質(zhì)量、萌發(fā)速度及成莖率等，由甘蔗的遺傳因素決定；外因包括溫度、濕度、營養(yǎng)和病蟲害等[4]。因此，在提供有利外因的情況下，品種種性是決定甘蔗宿根性的關(guān)鍵[8]。宿根蔗季的有效莖數(shù)、發(fā)芽株率、分蘗率、有效莖數(shù)、活性根構(gòu)成和高生物量等是常用于評價甘蔗品種宿根性強弱的指標[9]，覃偉等[10]從生理特性探究發(fā)現(xiàn)宿根蔗蔸形態(tài)特征與宿根性存在密切關(guān)系；強宿根蔗較弱宿根蔗新植蔗芽萌發(fā)快，萌發(fā)數(shù)多，分蘗率高，有效莖數(shù)多；強宿根蔗宿根發(fā)株數(shù)多，且有效株數(shù)多于新植蔗，產(chǎn)量較新植蔗高[11]；在宿根萌發(fā)期，宿根性越強，脫落酸（ABA）含量越高，生長素/脫落酸（IAA/ABA）和赤霉素/脫落酸（GA3/ABA）比值越小，進行甘蔗宿根性評價應著重參考ABA含量[7]。

在前人研究基礎(chǔ)上，對宿根萌發(fā)期可溶性糖、可溶性蛋白、內(nèi)源激素含量及相關(guān)酶活性進行了深入研究，結(jié)合產(chǎn)量和糖分對影響宿根性的因素進行綜合性評價，探究與甘蔗宿根性強弱有關(guān)的生理特性及其規(guī)律，為強宿根甘蔗品種的培育和早期篩選評價提供依據(jù)，對今后強宿根甘蔗新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所自主選育的強宿根甘蔗品種桂熱2號（GR2）為試驗材料，以新臺糖22號（ROC22）為對照，種植在廣西上思縣國有農(nóng)墾昌菱農(nóng)場甘蔗基地（107°50′E，22°07′N），分別命名為 GT（GR2，2 年宿根蔗）、RT（ROC22，2年宿根蔗）、GF（GR2，5年宿根蔗）和RF（ROC22，5年宿根蔗）。

1.2 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組田間設(shè)計，5行區(qū)，行長7m，行距1.2m，每個品種種植3個小區(qū)。新植蔗采用雙芽種莖以雙行品字形排列種植，下種密度為12.8芽/m2。于2013年3月種植，成熟后于2014年2月底收獲新植蔗并保留宿根，宿根蔗次年1月收獲，田間管理與當?shù)馗收岣弋a(chǎn)栽培管理相同。

1.3 測定項目與方法

在宿根蔗萌發(fā)初期2片葉子時取樣，挖取蔗蔸，摘取嫩根、基部蔗莖和葉進行內(nèi)源激素、酶活性、可溶性糖和可溶性蛋白的測定，每個樣品取2g，重復3次，取樣時先用清水洗干凈根部，再用錫箔紙包好，寫上標簽，裝在預先打孔的試管里，迅速放入液氮冷卻備用。

樣品采集后分別對ABA、IAA和GA3含量進行測定，同時測定過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、蛋白酶（Protease）、植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）和植物蔗糖合成酶（SS）活性。采用酶聯(lián)免疫吸附分析法用ELISA試劑盒測定激素含量和酶活性，采用雙抗體夾心法測定標本中植物激素和酶活性的水平，用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中植物激素含量和酶活性。采用蒽酮法測定可溶性糖含量，采用考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白含量，每個樣品重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用IBM SPSS 22.0軟件進行方差分析，并采用改進的極點排序法[12-15]進行宿根性強弱的評價。

將參與評價的指標相對數(shù)據(jù)劃分為5級。對每個品種所測指標相對值進行分級，使每個指標都得到相應級別值。公式為D=(Hmax-Hmin)/5，E=[(HHmin)/D]+1。式中，Hmax為各指標相對數(shù)據(jù)最大值，Hmin為各指標相對數(shù)據(jù)最小值，H為各指標相對數(shù)據(jù)任意值，D為得分級差（每得1分之差），E為各材料每個指標的級別值。通過計算可以得到鑒評矩陣。

權(quán)重系數(shù)為每個指標在綜合評價中的權(quán)重，計算公式：任意指標權(quán)重系數(shù)（B）=任意指標變異系數(shù)/各指標變異系數(shù)之和；綜合評價值計算公式：Vi=ΣEij×Bj（i=1，2，3，4，5，6，7，8；j=1，2，3，4），式中，Vi為每份材料綜合評價值，Eij為各相對數(shù)據(jù)的級別值，Bj為對應指標權(quán)重系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同宿根年限甘蔗的農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀分析

從表1可知，GT、RT和GF、RF的株高、莖徑、單莖重、田間錘度和蔗糖分指標沒有差異，小區(qū)有效莖數(shù)中GF比CK具有明顯優(yōu)勢，有效莖數(shù)中GT比CK高16.1%，GF高出31.1%。而在產(chǎn)量方面，GT和GF產(chǎn)量分別達到121 020和122 325kg/hm2，與對照存在極顯著差異，分別比RT和RF增產(chǎn)45.3%和38.4%。GR2宿根產(chǎn)量沒因種植年限久而減產(chǎn)，說明此品種宿根性強。GR2蔗糖分含量略低于CK，但含糖量比ROC22高出36%左右，說明GR2的整體優(yōu)勢明顯，增產(chǎn)增糖效果好。

表1 2年和5年宿根蔗的農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀Table 1 Agronomic and yield traits of sugarcane ratoon for two and five years

2.2 不同宿根年限甘蔗的可溶性糖和可溶性蛋白含量分析

從圖1可知，可溶性糖含量主要集中部位是莖和葉，其中GF莖的可溶性糖含量最高，達到21.85mg/g，比RF高42.8%，GT也比RT高，可溶性糖在根部和葉片的積累水平均衡。可溶性蛋白主要集中在葉片，莖中含量也高，GT、RT和GF、RF葉片中可溶性蛋白含量相當，2年宿根蔗莖部可溶性蛋白含量多于5年宿根蔗。隨著宿根年限增加，可溶性糖含量呈增長趨勢，可溶性蛋白在莖中的積累呈下降趨勢。

圖1 可溶性糖和可溶性蛋白含量Fig.1 Soluble sugar and protein contents

2.3 不同宿根年限甘蔗內(nèi)源激素含量分析

圖2表明，GT根、莖、葉中的ABA和IAA含量最高，其中GT根中ABA含量為352.86μg/L，IAA含量為430.54ng/L（表2），與RT呈極顯著性差異。GF根中ABA含量比GT根中降低了67.91%，IAA含量降低了25.72%；而RF根中ABA含量比RT增加35.31%，IAA含量增加15.31%。GR2中ABA和IAA含量都隨著種植年限的增加而減少，而ROC22中ABA和IAA含量都隨著種植年限的增加而增加，其中變化最明顯的是GR2中ABA含量，說明它與宿根性強弱關(guān)系最緊密。

表2 根部內(nèi)源激素方差分析Table 2 Variance analysis of endogenous hormones for roots

圖2 萌發(fā)期根、莖和葉內(nèi)源激素含量的比較Fig.2 Endogenous hormone contents of root,stem and leaf at sprouting stage

GA3的峰值出現(xiàn)在RT根中，達到448.01pg/mL，比RF根中高出25.71%，說明GA3與宿根性的強弱成負相關(guān)，與ABA和IAA的變化趨勢相反；而GF和GT根中GA3含量差異不大，推測與GR2宿根性強有密切關(guān)系。2年宿根和5年宿根的ABA、IAA和GA3，GR2和ROC22差異水平達到顯著或極顯著水平。說明宿根性的強弱不是單純與某種激素相關(guān)，而是幾種激素共同作用的結(jié)果。

2.4 不同宿根年限甘蔗酶活性的比較

圖3表明，CAT在GF的根和莖中活性最高，根中為9.31U/mL，GF與其他品種間存在顯著或極顯著性差異，CAT活性與宿根性強弱成正相關(guān)；在GR2和ROC22 2年宿根蔗的PAL活性大小差異不明顯，但在5年宿根蔗中，ROC22中PAL活性明顯低于GR2，比ROC22高出43.2%，二者間存在顯著或極顯著差異，PAL活性與宿根性成正相關(guān)；Protease活性在GF中最高，ROC22隨著種植年限的增加，Protease活性下降，GR2隨著種植年限的增加，Protease活性反而增加，這也是GR2宿根5年不減產(chǎn)的原因之一；SOD活性在各年限品種中差異不明顯，5年宿根蔗中稍微有所增加，四者間沒有極顯著差異；SS在GT中最高，達到18.17U/mL（表3），在5年宿根蔗中略有降低，ROC22中SS活性在2年和5年宿根蔗差異不大，SS與宿根性成負相關(guān)。

圖3 萌發(fā)期根、莖、葉的酶活性Fig.3 The enzyme activities of root,stem and leaf at sprouting stage

表3 根部酶活性的方差分析Table 3 The variance analysis of enzyme activity for roots

2.5 甘蔗宿根性強弱的綜合評價

甘蔗宿根性是一種復雜的遺傳特性，受多種環(huán)境因素的影響，為更全面評估各品系的宿根性，采用改進的極點排序法進行評分，結(jié)果如表4和表5所示，ABA、IAA、GA3、CAT、PAL、Protease、SOD和SS的權(quán)重系數(shù)分別為0.186、0.136、0.107、0.074、0.115、0.165、0.056和0.159。各品種各指標的對應得分如表4所示，該得分與各指標權(quán)重系數(shù)的乘積見表5。綜合得分越高，說明該品種的宿根性越好。由表5綜合評價值排名可知，宿根萌發(fā)期各品系宿根性強弱排序為GF＞GT＞RT＞RF，說明GR2的宿根性強于ROC22，這與前期大田試驗數(shù)據(jù)相吻合，進一步驗證了GR2是強宿根性品種。

表4 宿根萌發(fā)期2個品種在不同測定指標中根的得分（鑒評矩陣）Table 4 Scores of root of two varieties in different measurement indexes during perennial root germination stage(evaluation matrix)

表5 宿根萌發(fā)期宿根性綜合評價結(jié)果Table 5 Comprehensive evaluation of perennial roots at germination stage

3 討論

強宿根甘蔗品種的選育在生產(chǎn)中有重要意義，為蔗糖生產(chǎn)國所重視[16-18]。甘蔗宿根性是指新植或上年甘蔗收獲后，宿根發(fā)株的快慢強弱、數(shù)量、最終成莖率、有效莖數(shù)和產(chǎn)蔗量高低[19]。甘蔗宿根性的強弱與宿根蔗的產(chǎn)量有直接聯(lián)系，一般宿根多年甘蔗產(chǎn)量不衰的種質(zhì)表明其宿根性強，反之則弱[20]。韋開軍等[3]通過一新兩宿品比試驗，綜合分析各參試品種相關(guān)農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀，評價各品種宿根性的優(yōu)劣。馬麗等[6]對5年宿根蔗64份種質(zhì)材料的產(chǎn)量、糖分進行評價，從而篩選出宿根性強、高產(chǎn)、高糖種質(zhì)11個，宿根性強、高產(chǎn)種質(zhì)11個。蘇俊波等[21]探討機械化收獲后甘蔗的宿根性能，從農(nóng)藝性狀（株高、莖徑、單莖重）和產(chǎn)量性狀（有效莖數(shù)、產(chǎn)量、產(chǎn)糖量）篩選適宜機械化收獲的品種。本研究中GF的可溶性糖含量最高，這是GR2品種強宿根的指標之一，可溶性蛋白含量隨著宿根年限的增加而減少。

甘蔗宿根性與宿根蔗芽的萌發(fā)密切相關(guān)，這一過程受甘蔗體內(nèi)多種激素的共同作用與調(diào)節(jié)[7]。宋奇琦等[22]發(fā)現(xiàn)，甘蔗與黑穗病菌長期互作過程中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶活性及IAA和CTK含量總體上呈下降趨勢，而CAT活性呈上升趨勢；王川等[23]研究小麥可溶性糖含量、SOD和POD活性與抗旱性的關(guān)系，表明可溶性糖含量和保護性酶活性與抗旱指數(shù)存在極顯著正相關(guān)。楊貴先[24]研究了南瓜花發(fā)育過程的內(nèi)源激素和酶活性的變化，表明IAA、GA3和ABA的升降規(guī)律，在雌雄花中，高SOD、POD和CAT活性有助于雄花發(fā)育。周慧文等[25]研究了不同施氮水平下甘蔗內(nèi)源激素、產(chǎn)量和糖分的變化特征，表明不同施肥水平下GA、CTK、BR和ABA的含量變化。何靜丹[26]研究了低溫脅迫及溫度回升對甘蔗生理生化指標的影響，測定了苗期、宿根苗期、伸長期和工藝成熟期甘蔗葉片的丙二醛含量、POD活性、脯氨酸和可溶性蛋白含量等生理指標。而本研究GR2中ABA和IAA含量均隨著宿根年限的增加而減少，GA3與宿根性的強弱成負相關(guān)；CAT和PAL活性與宿根性強弱成正相關(guān)，SS活性與宿根性強弱成負相關(guān)。Protease在GF中活性最高。

目前報道的文獻中，一般是根據(jù)田間測產(chǎn)數(shù)據(jù)來判斷宿根性的強弱，從生理生化角度進行評價和判定的較少，本研究利用改進的極點排序法，對宿根性相關(guān)的多個生理指標進行權(quán)重分配，通過矩陣復合運算，獲得不同宿根年限品種間宿根性綜合評價結(jié)果，此法已在甘蔗的抗寒性[12]和抗旱性[27]評價上應用。本研究在甘蔗的宿根性鑒定中，采用極點排序法得出各品種宿根性強弱的綜合鑒定結(jié)果，得出ABA與宿根性強弱相關(guān)性最大，此結(jié)論與覃偉等[7]的研究結(jié)果一致，另外SS活性與宿根性強弱成負相關(guān)。Protease在GF中活性最高，說明植物蛋白酶在宿根性評價中是一個非常關(guān)鍵的因子。此方法可為甘蔗的宿根性提供客觀、可靠的評價。另外，本研究結(jié)合大田表現(xiàn)的宿根農(nóng)藝性狀，進一步說明了GR2強宿根性的特征。

甘蔗品種的潛在宿根能力是保證宿根蔗產(chǎn)量的首要因素，評價品種宿根性的強弱除了測定種植多年的實測產(chǎn)量和糖分外，還可以通過早期的可溶性糖、ABA含量、蛋白酶及SS活性等因素進行判斷，為宿根能力的篩選提供理論參考。

4 結(jié)論

GF的植物蛋白酶含量最高，ABA含量降幅最大，說明二者與宿根性強弱相關(guān)性最大。極點排序法計算得到ABA含量、Protease和SS活性的權(quán)重系數(shù)較大，得到宿根性強弱排序為GF＞GT＞RT＞RF，說明GR2的宿根性強于ROC22。

通過對內(nèi)源激素和酶活性的綜合評價，得出2個品種宿根能力強弱排序，進一步證實了GR2的強宿根性與大田測產(chǎn)數(shù)據(jù)相吻合，是值得廣泛推廣的高產(chǎn)、高糖且宿根性強的優(yōu)良品種。