不同夜間溫度處理對馬鈴薯試管薯及塊莖形成相關(guān)基因表達的影響

劉 菊 李廣存 段紹光 胡 軍 簡銀巧 劉建剛 金黎平 徐建飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部薯類作物生物學(xué)和遺傳育種重點實驗室，100081，北京）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是繼水稻和小麥之后的世界第三大糧食作物[1]，對于保障世界糧食安全和推進中國從脫貧攻堅向鄉(xiāng)村振興平穩(wěn)過渡具有不可替代的作用。溫度是影響馬鈴薯植株生長和塊莖產(chǎn)量的最重要環(huán)境因素之一，馬鈴薯喜冷涼，高溫條件不僅會對植株營養(yǎng)生長造成明顯的傷害，還會影響塊莖形成進程[2]。通常情況下，馬鈴薯塊莖形成的最佳日間溫度為14℃～22℃[3]，日間環(huán)境溫度的持續(xù)升高將降低或完全抑制塊莖形成。研究[4]表明，日間高溫頻率和強度的不斷增加會對作物產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響，而夜間高溫會對全球作物生產(chǎn)產(chǎn)生更嚴重的威脅。相比于日間溫度，馬鈴薯塊莖形成受夜間溫度影響更大[5-6]，尤其是夜間低溫促進塊莖發(fā)生，塊莖形成的最適夜間溫度是17℃[7]，夜間溫度高于20℃會降低植株結(jié)薯數(shù)，而夜間溫度一旦超過25℃，塊莖產(chǎn)量就會急劇下降[8]。研究[9]顯示，塊莖初始形成期，與日間高溫相比，夜間高溫通過影響植株的同化產(chǎn)物分配，顯著降低了大薯（＞100g）比例和早期收獲指數(shù)，造成產(chǎn)量的嚴重損失。

有研究[10]表明，馬鈴薯塊莖形成是一個非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及光周期、溫度、糖類物質(zhì)、糖轉(zhuǎn)運體和植物激素等相關(guān)基因和通路的協(xié)同作用。應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CO/FT（CONSTANS/FLOWERING LOCUS T）介導(dǎo)的光周期調(diào)控塊莖形成通路中，一些重要信號因子如StCO1、StGI（GIGANTEA）、StLHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）、StCDF1（CYCLING DOF FACTOR 1）和StSP5G（SELF-PRUNING 5G）也同時響應(yīng)溫度變化。作為塊莖形成的直接誘導(dǎo)者，F(xiàn)T類基因StSP6A同時參與光周期和溫度調(diào)控塊莖形成過程[11-12]。前人研究[12-14]已鑒定出，晝夜節(jié)律時鐘StTOC1（TIMING OF CAB EXPRESSION 1）、藍光受體蛋白StFKF1（FLAVIN-BINDING KELCH-REPEAT F-BOX 1）和microRNA SES等信號分子在高溫條件下，通過下調(diào)StSP6A的表達抑制結(jié)薯。然而，關(guān)于參與夜間溫度調(diào)控結(jié)薯相關(guān)的基因和分子調(diào)控機制尚不明確。

為進一步探究夜間溫度對馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育的影響，本試驗以馬鈴薯試管薯為研究對象，通過比較不同夜間溫度處理下7個馬鈴薯品種或材料試管薯的形成情況和結(jié)薯時間受夜間溫度影響顯著材料的塊莖形成相關(guān)基因表達量的變化，探究最適試管薯形成的夜間溫度條件，并為篩選塊莖形成調(diào)控通路中響應(yīng)夜間溫度變化的基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯課題組種質(zhì)資源庫所保存的馬鈴薯‘DM（DM1-3 516 R44）’、‘RH（RH89-039-16）’、‘中薯3號’、‘中薯5號’、‘中薯18號’、‘中薯21號’和‘費烏瑞它（Favorita）’脫毒試管苗。試管苗繁殖所用培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基（30g/L蔗糖和7g/L瓊脂粉，pH 5.8），無菌條件下，剪取試管苗單個莖段接種于含50mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（容積350mL，高白料玻璃）中，每瓶接種12株，置于21℃±1℃培養(yǎng)箱中，光照強度2000lx，光周期16h/d條件下培養(yǎng)21d，獲得基礎(chǔ)苗。

1.2 試管薯誘導(dǎo)和處理條件

無菌條件下，以上述基礎(chǔ)苗為母苗，選取長勢一致且生長良好植株的第2～3節(jié)（從頂芽往下數(shù)）單個莖段，接種于結(jié)薯培養(yǎng)基（普通MS固體培養(yǎng)基添加蔗糖60g/L和瓊脂粉7g/L，pH 5.8），每節(jié)段含1個腋芽，每個基因型材料接種30瓶，每瓶接種6個莖節(jié)。將接種后的培養(yǎng)瓶分別置于日間/夜間溫度23℃/13℃、23℃/18℃和23℃/23℃的人工氣候箱（寧波江南儀器廠，型號GXZ-500D）進行試管薯誘導(dǎo)培養(yǎng)，每個基因型單個溫度處理下放置10瓶，共60株（20株/重復(fù)，重復(fù)3次），光照強度均為2000lx，光周期均為8h/d。

1.3 試管薯表型數(shù)據(jù)記錄

培養(yǎng)初期每隔3d觀察1次植株生長和試管薯形成情況，生長20d后每天觀察記錄表型變化和試管薯初始結(jié)薯時間，誘導(dǎo)培養(yǎng)60d時統(tǒng)計試管薯結(jié)薯率和結(jié)薯方式，具體統(tǒng)計方法如下：

試管薯初始結(jié)薯時間（d）：從接種之日到第1個試管薯初始形成（直徑約2mm）的天數(shù)[15]；試管薯結(jié)薯率（%）＝（結(jié)薯植株數(shù)/總植株數(shù)）×100；試管薯結(jié)薯方式包括3種類型，經(jīng)由匍匐莖頂端膨大形成的有柄薯（apical microtuber）；未經(jīng)匍匐莖發(fā)生，直接在腋芽基部膨大形成的無柄薯（basal microtuber）；在植株側(cè)枝腋芽處著生的無柄薯（medial microtuber），分類方法參照周俊[16]和Panteli?等[17]（圖 1）。

圖1 ‘RH’試管薯結(jié)薯方式示意圖Fig.1 Schematic diagram of types of in vitro tuberization in‘RH’

1.4 RT-qPCR取樣和相關(guān)基因表達分析

在23℃/23℃處理條件下，取‘RH’試管薯初始形成植株的葉片以及同時期23℃/23℃、23℃/18℃和23℃/13℃尚未有試管薯形成植株葉片，液氮處理后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?株葉片混樣為1個重復(fù)，每個處理重復(fù)3次。

按照多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（GeneBetter）說明書提取RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，BioDrop uLite超微量蛋白核酸分析儀檢測RNA純度和濃度。獲得的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Script III RT Kit With gDNA Eraser（GeneBetter）進行cDNA的合成，按照Hieff?qPCR SYBR? Green Master Mix（No Rox）（YEASEN）試劑盒說明進行RT-qPCR。在Light Cycler?480實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上完成反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40個循環(huán)。用Primer 3.0（https://primer3.ut.ee/）設(shè)計引物，由北京六合華大基因科技有限公司合成，內(nèi)參基因EF1α及各基因引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物信息Table 1 RT-qPCR primer information

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用Microsoft Excel 2019軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，利用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（ANOVA），選用 Duncan’s檢驗法對顯著性差異（P＜0.05）進行多重比較，采用 2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同夜間溫度處理對試管薯初始結(jié)薯時間的影響

供試材料試管薯初始結(jié)薯時間均受夜間溫度調(diào)控。3種溫度處理下，‘中薯5號’、‘中薯18號’和‘中薯21號’試管薯在23℃/18℃下結(jié)薯最早，而‘RH’、‘DM’、‘費烏瑞它’和‘中薯3號’在23℃/23℃下試管薯初始結(jié)薯時間最短。除‘費烏瑞它’和‘中薯5號’外，其余基因型試管薯在23℃/23℃和23℃/18℃下的初始結(jié)薯時間均顯著早于23℃/13℃處理（圖2）。對于‘RH’和‘DM’基因型，不同夜間溫度處理下的試管薯初始結(jié)薯時間差異顯著。以上結(jié)果表明，塊莖初始結(jié)薯時間受夜間溫度影響，過低的夜間溫度不利于塊莖形成。

圖2 不同夜間溫度處理對試管薯初始結(jié)薯時間的影響Fig.2 Effects on initiation of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.2 不同夜間溫度處理對試管薯結(jié)薯率的影響

不同夜間溫度處理下，供試材料試管薯的結(jié)薯能力不同（圖3）。隨夜間溫度升高，‘費烏瑞它’、‘中薯5號’、‘中薯18號’和‘中薯21號’試管薯結(jié)薯率呈先上升后下降的趨勢，在23℃/18℃條件下結(jié)薯率最高?！甊H’和‘中薯3號’試管薯結(jié)薯率變化趨勢基本一致，即23℃/18℃和23℃/13℃條件下的試管薯結(jié)薯率顯著高于23℃/23℃處理，本試驗中，‘DM’基因型在3種夜間溫度處理下的試管薯結(jié)薯率無顯著差異。以上結(jié)果表明，夜間高溫處理會降低試管薯結(jié)薯率。

圖3 不同夜間溫度處理對試管薯結(jié)薯率的影響Fig.3 Effects on percentage of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.3 不同夜間溫度處理對試管薯結(jié)薯方式的影響

在3種夜間溫度處理下，大多數(shù)供試材料試管薯的結(jié)薯方式固定，試管薯多以有柄薯的形式存在，而‘RH’和‘中薯18號’試管薯結(jié)薯方式受夜間溫度影響而發(fā)生變化（圖4），隨著夜間溫度的升高，無柄薯的比例逐漸增加，其中‘中薯18號’在23℃/23℃處理下，存在較高比例基生無柄薯，這表明‘RH’和‘中薯18號’植株在夜間溫度升高環(huán)境下更傾向于不經(jīng)由匍匐莖伸長而直接在莖節(jié)腋芽處膨大形成試管薯。

圖4 不同夜間溫度處理對試管薯結(jié)薯方式的影響Fig.4 Effects on type of in vitro tuberization under different night temperature treatments

2.4 不同夜間溫度處理下塊莖形成相關(guān)基因的表達分析

選取參與馬鈴薯塊莖形成的光受體基因（StFKF1）、生物鐘相關(guān)基因（StELF4和StTOC1）、CO/FT光周期調(diào)控通路關(guān)鍵基因（StCO1和StSP6A）以及糖代謝和糖轉(zhuǎn)運體調(diào)控相關(guān)基因（StSWEET1和StSEX4）進行不同夜間溫度條件下結(jié)薯植株和非結(jié)薯植株的表達分析（圖5）。

圖5 不同夜間溫度處理下塊莖形成相關(guān)基因表達量的分析Fig.5 Expression analysis of tuberization related genes under different day/night temperature treatments

以結(jié)薯最早的23℃/23℃處理下結(jié)薯植株葉片中基因表達水平為對照，結(jié)果表明，3種溫度處理下的非結(jié)薯植株與對照相比，StFKF1在23℃/18℃和23℃/13℃處理下的表達量顯著上升，而StSEX4在23℃/18℃和23℃/13℃處理下的表達量顯著下降。StTOC1和StCO1僅在23℃/13℃處理下的表達量顯著升高，其他處理與對照無顯著差異。StELF4在3種溫度條件下均顯著下調(diào)表達，與之相反，StSP6A和StSWEET1的表達均顯著上調(diào)。

通過對3種夜間溫度處理下的非結(jié)薯植株葉片基因表達變化分析發(fā)現(xiàn)，隨著夜間溫度降低，StFKF1表達量顯著增加，23℃/13℃條件下最高；StELF4表達量在23℃/18℃和23℃/13℃之間差異顯著；StCO1表達量在23℃/23℃和23℃/13℃條件下差異顯著；StSEX4表達量在23℃/23℃和23℃/18℃條件下差異顯著；StTOC1和StSP6A表達量的顯著性變化趨勢相同，23℃/23℃和23℃/18℃處理間無顯著差異，但均顯著低于23℃/13℃處理；StSWEET1在23℃/23℃條件下表達量顯著低于其他2種溫度處理。

3 討論

3.1 不同夜間溫度處理對試管薯初始結(jié)薯時間和結(jié)薯率的影響

溫度是影響馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育的重要環(huán)境因子，與日間溫度相比，夜間溫度對馬鈴薯的生長和產(chǎn)量建成有更重要的影響[2]。夜間溫度尤其是夜間高溫對水稻和小麥植株農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量等均有不利影響[18-19]。馬鈴薯試管薯研究表明，環(huán)境溫度過高或過低都不利于塊莖形成，15℃～18℃最適宜試管薯的誘導(dǎo)培養(yǎng)[20]，適度低溫（17±1）℃培養(yǎng)的試管薯始薯期變短，結(jié)薯數(shù)增多[21]。本試驗中，23℃/18℃處理下絕大多數(shù)供試基因型試管薯初始結(jié)薯時間顯著早于23℃/13℃處理，且23℃/18℃下的試管薯結(jié)薯率較高，該結(jié)果與張武等[22]和邱甜等[23]研究結(jié)果一致。前人研究[24]發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)結(jié)薯時不同馬鈴薯品種對溫度的適應(yīng)性不同，炸片加工品種‘大西洋’和彩色薯肉品種‘轉(zhuǎn)心烏’試管薯的最佳誘導(dǎo)溫度分別為20℃和25℃。本試驗中，‘RH’和‘DM’等材料試管薯在23℃/23℃下結(jié)薯最早，而‘中薯5號’和‘中薯18號’等在23℃/18℃下結(jié)薯最早，表明不同基因型馬鈴薯試管薯形成對夜間溫度的敏感性不同。由此可見，夜間溫度對馬鈴薯試管薯形成存在顯著影響，適宜的夜間溫度可以縮短塊莖初始形成時間和提高結(jié)薯率，過高或過低的夜間溫度都不利于試管薯形成。

3.2 不同夜間溫度處理對塊莖形成相關(guān)基因表達的影響

溫度會對晝夜節(jié)律時鐘基因的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響。擬南芥中，環(huán)境溫度影響生物鐘基因TOC1、GI、CCA1和LHY等的表達[25]。對馬鈴薯的研究表明，與22℃相比，30℃條件下葉片中StTOC1表達升高[26]，StTOC1是塊莖形成的負調(diào)節(jié)因子，下調(diào)StTOC1的表達可以減輕高溫對馬鈴薯產(chǎn)量的不利影響[13]。本試驗中，夜間23℃和18℃處理下，結(jié)薯與非結(jié)薯植株間葉片StTOC1表達量無顯著差異，但夜間13℃時，非結(jié)薯植株葉片StTOC1表達水平顯著升高，表明該溫度下，StTOC1顯著抑制塊莖形成，這與夜間13℃下試管薯初始結(jié)薯時間最晚的表型結(jié)果相符。高氣溫環(huán)境下，馬鈴薯葉片生物鐘基因StELF4表達量降低[14]。本試驗結(jié)果表明，在非結(jié)薯植株中，夜間低溫能夠降低StELF4的表達量。

溫度會影響糖代謝相關(guān)基因的表達。研究[14]發(fā)現(xiàn)，與22℃/20℃處理相比，29℃/27℃處理下的塊莖中蔗糖外排載體蛋白StSWEET1和塊莖中淀粉降解相關(guān)基因StSEX4的表達量均顯著降低，阻止了蔗糖向質(zhì)外體泄漏，減少了高溫下塊莖中的淀粉含量損失。馬鈴薯葉片生成的光合產(chǎn)物主要以蔗糖形式經(jīng)韌皮部運輸至塊莖[27-28]。本試驗中，低溫條件下，非結(jié)薯植株葉片中StSEX4表達下調(diào)，而StSWEET1表達量顯著上升，有助于葉片中的淀粉積累和同化產(chǎn)物向塊莖轉(zhuǎn)運。

CO/FT介導(dǎo)的光周期調(diào)控通路在馬鈴薯塊莖形成過程中發(fā)揮著重要作用。擬南芥中，AtCO（Arabidopsis CONSTANS）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是光周期調(diào)控決定花期的重要因素[29]，同樣CO類轉(zhuǎn)錄因子StCO影響馬鈴薯塊莖結(jié)薯時間，長日照（或者短日照加暗間斷）下StCO沉默株系結(jié)薯提早[30]。StCO在塊莖形成過程中同樣響應(yīng)溫度變化，在馬鈴薯熱敏感品種Kufri Chandramukhi和耐熱品種Kufri Surya的塊莖形成期進行晝/夜24℃/20℃和24℃/24℃處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理14d后，2個品種在高溫條件下葉片StCO表達量均顯著高于適溫處理[31]。本試驗中，23℃/13℃處理下的非結(jié)薯植株葉片StCO表達量顯著高于其他處理，這也印證了StCO在溫度調(diào)控結(jié)薯時間上起抑制作用[26]。

馬鈴薯FT家族基因StSP6A在塊莖形成過程中發(fā)揮重要作用。短日照條件下，葉片產(chǎn)生的StSP6A轉(zhuǎn)運蛋白通過韌皮部運輸?shù)劫橘肭o頂端誘導(dǎo)塊莖形成[11]。Lehretz等[12]研究揭示了高溫條件下，miRNA（SES）通過下調(diào)StSP6A表達抑制結(jié)薯。StSP6A轉(zhuǎn)錄水平受溫度調(diào)控已在許多研究[32]中得到證明。馬鈴薯葉片中StFKF1表達量受土壤高溫影響較大，高溫環(huán)境可通過下調(diào)StFKF1的表達，從而降低StSP6A含量而使結(jié)薯受阻[14]。本試驗結(jié)果表明，StFKF1和StSP6A表達量受夜間溫度調(diào)控，夜間13℃下，StFKF1和StSP6A表達量均顯著高于其他處理，推測這可能是因為對于非結(jié)薯植株來說，由于處于即將形成試管薯的準備過程，夜間低溫刺激了葉片StSP6A的表達，從而導(dǎo)致23℃/23℃處理下的已結(jié)薯植株葉片StSFKF1和StSP6A的表達量相對較低，關(guān)于StSP6A在不同夜間溫度下調(diào)控試管薯形成的機制還有待深入研究。

4 結(jié)論

夜間低溫（13℃）會延緩馬鈴薯試管薯初始結(jié)薯時間，夜間高溫（23℃）降低試管薯結(jié)薯率，而夜間適溫（18℃）可促進試管薯形成。生物鐘基因StTOC1和StELF4、糖代謝相關(guān)基因StSWEET1和StSEX4及光周期通路基因StFKF1、StCO和StSP6A均表現(xiàn)出顯著的溫度響應(yīng)變化，表明夜間溫度可通過影響多種代謝途徑基因的表達調(diào)控塊莖形成過程。