基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合GEO數(shù)據(jù)探討木白散治療消化性潰瘍的作用機制*

白童瑜，吳宿慧

河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046

消化性潰瘍是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍以及復(fù)合性潰瘍[1]。消化性潰瘍與胃酸分泌過多、飲食因素以及壓力有關(guān)，會造成胃、十二指腸的酸性消化而導(dǎo)致黏膜糜爛，目前往往以幽門螺桿菌(helicobacterpylori，Hp)感染發(fā)病率增高、非甾體抗炎藥的廣泛使用以及酗酒和吸煙為主要誘發(fā)因素[2]。此外在治療不及時的情況下容易并發(fā)潰瘍穿孔、出血和幽門梗阻，甚至引起潰瘍癌變，嚴重威脅患者健康[3]。西醫(yī)對于Hp感染消化性潰瘍患者以四聯(lián)藥物治療為主，雖可在一定程度上減輕相關(guān)癥狀，但卻伴隨Hp耐藥性增高而療效逐漸降低[4-5]。

消化性潰瘍屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“反酸”“嘈雜”“痞滿”等范疇，以規(guī)律性的上腹疼痛、燒心、反酸、惡心、嘔吐、腹脹、黑便等癥狀為主?！鹅`樞·邪氣臟腑病形》云：“胃病者，胃脘當心而痛，上支兩脅……取之足三里[6]?！薄鹅`樞·脹論》云：“脾脹者善噦；胃脹者，腹?jié)M胃脘痛。寒氣逆上，真邪相攻，兩氣相搏，乃合為脹也[6]?！笔状翁岢鑫鸽涮弁础⒚洕M與脾胃之經(jīng)氣寒凝壅塞不通相關(guān)。《素問·太陰陽明論》[7]云：“太陰陽明為表里，生病而異者……是以犯賊風虛邪者陽受之；食飲不節(jié)起居不時，陰受之?！标柮魑笧樗戎＃槲钢?，胃為脾之市，故外犯虛邪賊風，內(nèi)傷于飲食勞倦，兩虛相得脾胃乃傷?！秱摗け嫣柌∶}證并治》曰：“但滿而不痛者，此為痞……腹?jié)M而吐……自利不渴者屬太陰，以其臟有寒故也，當溫之，宜服四逆輩?！敝赋銎⑽柑摵?，中陽不足則導(dǎo)致脾胃升降不衡，則發(fā)為痞滿，治以四逆輩溫補中焦，如理中湯溫陽散寒并舉，標本兼治[8]。

木白散為王國斌教授辨治消化性潰瘍的自擬經(jīng)驗方，方中蓽茇、白術(shù)健運脾氣而祛寒，木香、草豆蔻、檳榔、甘松、砂仁醒脾開胃而行氣止痛，以復(fù)脾胃升降之機能。以中焦虛寒為本、濁瘀阻滯為標辨證，臨床取得良好效果，但其作用機制未明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計算機模擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索的基礎(chǔ)上，融合了系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等學(xué)科，具有系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合的優(yōu)勢，可以解析藥物與疾病之間的分子關(guān)聯(lián)，進行藥物作用機制的研究并且能夠發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物[9]。而高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中具有真實臨床樣本基因芯片數(shù)據(jù)，能夠通過篩選差異表達基因準確、可靠、高效地反映疾病本質(zhì)特征和規(guī)律[10]。因此本文擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和GEO數(shù)據(jù)庫研究木白散治療消化性潰瘍的作用機制，為日后進行實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 篩選木白散中藥活性成分以及靶點信息利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選木香、白術(shù)、蓽茇、檳榔、草果、甘松、砂仁、半夏、草豆蔻、白芍、瓦楞子、甘草的活性成分，根據(jù)口服生物利用度OB≥30%，類藥性DL≥0.18為條件篩選有效活性成分，并篩選靶基因信息，其中草豆蔻、瓦楞子的有效活性成分和靶基因運用ETCM中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫(http：//tcmip.cn/ETCM/index.php)結(jié)合文獻研究進行檢索，然后利用Unipront數(shù)據(jù)庫將靶基因進行標準化。

1.2 搜索消化性潰瘍疾病靶基因，獲取藥物-疾病互作基因利用GeneGards 疾病數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM 疾病數(shù)據(jù)庫(https：//www.omim.org/)以“Peptic ulcer”為關(guān)鍵詞篩選消化性潰瘍的疾病靶基因，去除重復(fù)靶基因。利用Venny2.1數(shù)據(jù)庫(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html 2.1) 將藥物靶基因與消化性潰瘍靶基因取交集，繪制韋恩圖，得到藥物-疾病共同基因。

1.3 制作木白散中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖利用篩選好的中藥活性成分、靶基因以及藥物-疾病互作基因，在Cytoscape3.7.2軟件上繪制中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 繪制蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，獲取關(guān)鍵基因利用String平臺，對藥物-疾病共同基因進行蛋白互作分析，選擇蛋白質(zhì)屬種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence”為0.4，其他參數(shù)選擇默認參數(shù)。輸出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，利用Cytoscape3.7.2軟件中CytoNCA進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，根據(jù)度中心性DC、介度中心性BC、接近中心性CC、特征向量中心性EC、局部邊連通性LAC等數(shù)值，其中選DC為2倍中位值，其他選中位值，篩選核心基因。

1.5 進行基因本體(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析利用R3.5.2軟件對藥物-疾病共同基因進行GO和KEGG富集分析，分析結(jié)果篩選q值≤0.05的數(shù)據(jù)進行可視化，GO數(shù)據(jù)選擇前20組，KEGG選擇前20組，繪制柱狀圖和氣泡圖，并繪制相關(guān)通路的通路圖。

1.6 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析基因芯片獲取消化性潰瘍差異基因基于Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)計算機檢索，以“Peptic ulcer”為檢索式，選擇“Homo scapiens”人類樣本。通過閱讀摘要，以如下標準選擇：①樣本量20例以上；②正常人作為對照組；③臨床樣本為血清。使用GEO2R工具，對GSE60427芯片中mRNA測序數(shù)據(jù)進行差異表達分析，采用logFC和adj.P.Val作為篩選條件，并繪制火山圖。

1.7 繪制熱圖和小提琴圖驗證部分核心基因的差異表達提取部分核心基因表達矩陣的基因表達數(shù)據(jù)，利用R軟件的“pheatmap”和“ggpubr”包繪制核心基因的差異表達熱圖和小提琴圖。在基因表達數(shù)據(jù)中如果輸入文件的數(shù)值很大，需要對數(shù)據(jù)取log2。其中熱圖中以“green”和“red”分別代表基因呈低表達和高表達。

2 結(jié)果

2.1 木白散活性成分結(jié)果通過TCMSP網(wǎng)站篩選出活性成分152個，相關(guān)靶基因335個，其中木香6個、白術(shù)4個、蓽茇10個、檳榔7個、草果5個、甘松4個、砂仁8個、半夏12個、草豆蔻11個、白芍8個、瓦楞子2個、甘草88個?？芍景咨⒛軌蛲ㄟ^多成分、多靶點發(fā)揮作用，部分成分信息如表1所示。

表1 木白散部分活性成分信息表

2.2 藥物-疾病互作基因經(jīng)過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選并去除重復(fù)基因，得到消化性潰瘍靶基因1 015個。將藥物基因與疾病基因在Venny2.1網(wǎng)站上獲取藥物潛在基因位點92個，見圖1。

圖1 木白散-消化性潰瘍互作基因韋恩圖

2.3 中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖通過Cytoscape3.7.2繪制中藥-成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖2所示。其中木香、砂仁、半夏共有豆甾醇(Stigmasterol)、白芍、半夏、砂仁共有β谷甾醇(beta-sitosterol)、白芍、甘草共有山柰酚(kaempferol)、草果、甘草共有槲皮素(quercetin)、半夏含有黃芩素(baicalein)。

圖2 中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，藥物-疾病核心基因靶點通過CytoHubba插件得到藥物-疾病核心基因PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)信息，篩選出35個基因為核心基因，根據(jù)GEO基因表達矩陣分析發(fā)現(xiàn)，核心基因中前列腺素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、白細胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-10、C-C基序趨化因子2(C-C motif chemokine ligand 2，CCL2)、胞間黏附分子1(cell adhesion molecule1，ICAM1)、血管細胞黏附蛋白1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)8個基因為核心基因在消化性潰瘍患者中差異表達，如圖3所示。

圖3 Cytohub篩選核心基因結(jié)果示意圖

2.5 GO基因功能注釋結(jié)果在R4.0.2軟件上進行GO功能注釋得到共同基因聚集在生物過程(Biological Process)對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、對細菌源性分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to chemical stress)；細胞組成(Cell Composition)囊腔(vesicle lumen)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、血小板α顆粒腔(platelet alpha granule lumen)；分子功能(Molecular Function)核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)抗氧化活性(antioxidant activity)如圖4所示。

圖4 藥物-疾病共同基因GO功能注釋結(jié)果圖

2.6 KEGG富集通路分析結(jié)果木白散-消化性潰瘍疾病基因在R4.0.2軟件上進行KEGG通路富集分析，結(jié)果得出互作基因主要富集在MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)，如圖5所示。其中 NF-κB 信號通路的通路圖信息見圖6。

圖5 藥物-疾病共同基因KEGG富集分析結(jié)果圖

圖6 NF-κB信號通路示意圖

2.7 消化性潰瘍GEO數(shù)據(jù)差異基因結(jié)果通過GEO2R工具，對GSE60427芯片中mRNA測序數(shù)據(jù)進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者中差異基因為1 822個。上調(diào)的為1 391個，下調(diào)的為431個，如圖7火山圖所示。

圖7 GSE60427芯片消化性潰瘍患者差異基因火山圖

2.8 部分核心基因差異表達的熱圖和小提琴圖利用R軟件對提取部分核心基因表達矩陣的基因表達數(shù)據(jù)，繪制熱圖和小提琴圖，發(fā)現(xiàn)消化性潰瘍患者PTGS2、IL-6、IL-10等部分核心基因顯著高表達，且P<0.001，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。如圖8、圖9所示。

圖8 部分核心基因熱圖

圖9 部分核心基因小提琴圖

3 討論

目前認為消化性潰瘍的發(fā)病機制為藥物損傷、Hp感染等致病因素造成的胃酸、胃蛋白酶對胃黏膜的侵襲作用與黏膜屏障的防御能力失衡所致[11]。而Hp等侵襲因子引起的IL-1β、TNF-α、IL-17以及IFN-γ等黏膜促炎細胞因子的增加則會導(dǎo)致潰瘍的惡化[12]。隨著質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護劑以及抗Hp耐藥的出現(xiàn)，新的研究發(fā)現(xiàn)配合中藥治療不但能夠提高Hp的根除率、促進潰瘍的愈合而且能夠降低西藥的耐藥性[13]。

王國斌教授辨治消化性潰瘍多以中焦虛寒為本，濁瘀阻滯為標，根據(jù)臨床經(jīng)驗在理中湯的基礎(chǔ)上自擬經(jīng)驗方木白散，方中蓽茇、白術(shù)健運脾氣而祛寒；木香、草豆蔻、檳榔、甘松、砂仁醒脾開胃而行氣止痛以復(fù)脾胃升降之機能；瓦楞子制酸止痛以化瘀；檳榔消積導(dǎo)滯止痛，以溫中補虛、行氣化濁、理氣止痛、消積除脹，還能夠改善胃脘痛并促進潰瘍創(chuàng)傷面的修復(fù)[14]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)服檳榔煎劑則可以通過殺滅Hp，從而切斷Hp的感染途徑，清除Hp對胃腸黏膜的損傷，使胃黏膜糜爛灶和十二指腸潰瘍灶得以自行修復(fù)[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)木白散加減聯(lián)合三聯(lián)方案治療消化性潰瘍，可以通過改善炎癥細胞浸潤、黏膜厚度及腺體形態(tài)，以促進胃黏膜組織修復(fù)，并提高臨床癥狀改善程度和Hp根除率[16]。

通過中藥-化合物-靶基因-疾病網(wǎng)絡(luò)分析得到，木白散可以通過槲皮素、豆甾醇、β谷甾醇、山柰酚、黃芩素等成分治療消化性潰瘍。研究發(fā)現(xiàn)吲哚美辛可以引起大鼠胃黏膜表面損傷，造成黏膜充血、糜爛以及炎性細胞浸潤，而槲皮素相對于法莫替丁能夠阻止吲哚美辛引起的胃潰瘍胃黏膜損傷[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)納米槲皮素能夠通過下調(diào)基質(zhì) MMP-9和NOS-2的表達以阻斷乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍的氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠通過抑制中性粒細胞積累和髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，調(diào)節(jié)促炎細胞因子(TNF-α和IL-1β)水平，并改善NO的產(chǎn)生以降低潰瘍指數(shù)，保護胃黏膜免受損傷[19]。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過降低還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)和MPO活性，抑制乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍形成、減少炎癥過程、刺激細胞抗氧化機制和增加黏液量[20]。由此可知，木白散可以通過多種成分抑制乙醇等誘導(dǎo)的消化性潰瘍中的炎癥反應(yīng)，從而保護胃黏膜免受損傷。

通過PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析篩選，GEO基因表達矩陣分析發(fā)現(xiàn)，木白散治療消化性潰瘍的靶點可能為PTGS2、IL-6、IFN-γ、MMP-9、CCL2、ICAM1、VCAM1等蛋白。非甾體抗炎藥通過阻斷前列腺素合酶1和合酶2同工酶環(huán)氧合酶的活性抑制前列腺素的合成，最終誘導(dǎo)胃黏膜損傷而導(dǎo)致胃潰瘍的發(fā)生，而研究表明PTGS2選擇性抑制劑NS-398能夠?qū)е聺冇系娘@著延遲[21-22]。另有研究表明益氣活血方能夠通過增加消化性潰瘍黏膜組織中的環(huán)氧合酶的活性和前列腺素2的分泌以促進消化性潰瘍的愈合[23]。IL-6是一種多功能因子，可以通過中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞釋放各種有害產(chǎn)物、活性氧自由基以及溶酶體等炎癥因子，以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，使胃潰瘍中的胃黏膜損傷向愈。研究發(fā)現(xiàn)在遺傳誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中IL-6表達水平升高，而氧白藜蘆醇可以抑制IL-6的表達，從而治療消化性潰瘍[24]。Hp能夠在小鼠胃潰瘍的胃黏膜中觸發(fā)CD+T細胞反應(yīng)，釋放IFN-γ和其他促炎因子，并且IFN-γ在Hp誘導(dǎo)的胃炎中發(fā)揮重要作用[25]。MMPs能夠選擇性降解胃組織的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)而調(diào)節(jié)ECM重塑參與胃潰瘍的形成，而活性氧和氮物質(zhì)則能夠通過破壞MMP活化和失活的平衡，參與胃潰瘍在內(nèi)的多種疾病發(fā)病機制[26]。另外在乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍模型中發(fā)現(xiàn)MMP-9的活性增強與小鼠胃黏膜損傷的程度呈正相關(guān)，而作為一種抗炎劑，褪黑素可以通過降低MMP-9的活性發(fā)揮抗?jié)兊淖饔肹27]。通過對核心靶基因進行繪制熱圖和小提琴圖發(fā)現(xiàn)，上述核心基因在消化性潰瘍患者中表達增高，由此可知木白散可以通過調(diào)節(jié)上述核心基因以抑制炎癥反應(yīng)干預(yù)胃潰瘍的胃黏膜損傷。

通過GO生物功能注釋和KEGG通路富集分析得知，木白散治療消化性潰瘍可能與脂多糖的反應(yīng)、對細菌源性分子的反應(yīng)、抗氧化活性等生物學(xué)過程，以及MAPK、NF-κB、IL-17、HIF-1、腫瘤壞死因子等信號通路有關(guān)?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)能夠?qū)е戮€粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)而損傷胃黏膜細胞，在胃潰瘍的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。而氧化應(yīng)激能夠通過激活NF-κB、IFN-γ 以及IL-1β等炎癥通路以增強炎癥反應(yīng)損傷細胞，在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍研究中發(fā)現(xiàn)，N-乙酰半胱氨酸能夠通過抑制IFN-γ以及 IL-1β 的表達，發(fā)揮抗氧化作用治療消化性潰瘍[28]。非甾體抗炎藥能夠誘導(dǎo)胃黏膜大鼠胃腺細胞壞死、胃黏膜彌漫性出血，以及TNF-α、IL-6等炎性因子的增高[29]。IL-17作為一種炎癥因子，能夠募集中性粒細胞向炎癥部位聚集，在許多慢性炎癥性疾病的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。有研究證明Hp感染后小鼠胃黏膜中IL-17水平升高，而IL-17基因敲除后的小鼠可以免受Hp誘導(dǎo)的胃黏膜損傷[30]。由此可知，預(yù)測木白散治療消化性潰瘍的生物過程和富集分析通路，涉及通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激防止胃黏膜損傷。

綜上所述，木白散能夠通過山柰酚、槲皮素、黃芩素等成分作用于PTGS-2、IL-6、MMP-9等基因，調(diào)控MAPK、NF-κB、IL-17等信號通路，抑制炎癥反應(yīng)，抑制內(nèi)皮細胞增生，治療消化性潰瘍，其具體調(diào)控機制尚待實驗的進一步驗證。