基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究五苓散治療前列腺增生的作用機(jī)制*

張凱波，李桓，王鎖剛

1.蘭考縣中醫(yī)院，河南 蘭考 475300；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)是由于前列腺移行區(qū)和尿道周圍區(qū)域的上皮和纖維肌組織增生，導(dǎo)致前列腺良性增大[1]。本病常見于老年男性，隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，BPH已成為嚴(yán)重影響老年男性生活質(zhì)量的疾病之一[2]。BPH主要表現(xiàn)為前列腺體積增大、膀胱出口梗阻，出現(xiàn)以下尿路癥狀為主的臨床癥狀[3-4]。目前治療BPH多采用手術(shù)及藥物治療，如α受體阻滯劑、5α還原酶抑制劑等[5]，雖然能緩解癥狀，但性欲障礙、失眠等藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重。

BPH屬于中醫(yī)學(xué)“癃閉”的范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于本病的論述，如《素問·宣明五氣》就有“膀胱不利為癃”的相關(guān)記載。該病主要因膀胱氣化不利，病位在腎和膀胱[5]。五苓散出自《傷寒雜病論》，是治療太陽(yáng)蓄水證的經(jīng)典名方，由茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝和澤瀉5味藥組成，具有利水滲濕、溫陽(yáng)化氣之功效[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)五苓散能縮小增大的前列腺，明顯改善BPH患者排尿功能[7-11]，但其具體作用機(jī)制不詳，嚴(yán)重阻礙了該方的臨床使用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以整合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的資源，通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，進(jìn)而闡釋藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)關(guān)系，揭示中藥有效成分的生物學(xué)作用，從微觀層面到宏觀層面揭示藥物治療疾病的機(jī)制，與中醫(yī)學(xué)所闡述的整體理念一致[12-13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究五苓散治療BPH的作用機(jī)制，為五苓散治療BPH的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 收集五苓散有效成分及其作用靶點(diǎn)在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//tcmsp-e.com/)分別檢索茯苓、豬苓、白術(shù)、桂枝和澤瀉的化學(xué)成分信息。再通過生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug likeness，DL)≥0.18篩選出五苓散中所有藥物的有效成分及有效成分作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 BPH疾病靶點(diǎn)獲取以“benign prostatic hyperplasia”為關(guān)鍵詞，使用DrugBank(https：//www.drugbank.ca/)、GeneCards(http：//www.genecareds.org/)、OMIM(http：//www.omim.org/)以及TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)等與疾病相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取BPH的靶點(diǎn)，去重后即為疾病的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 五苓散治療BPH的靶點(diǎn)獲取將五苓散有效成分的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩(Veen)分析，取交集后獲得共有基因，即為五苓散可能作用于BPH的相關(guān)靶點(diǎn)，并繪制中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 五苓散治療BPH的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將1.3項(xiàng)下獲得的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.string-db.org/)，設(shè)置種屬為“Homo sapiens”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步分析和優(yōu)化。

1.5 基因功能(gene ontology，GO)及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集運(yùn)用R軟件進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，并通過氣泡圖將結(jié)果可視化，氣泡越大，代表富集的基因數(shù)量越多；顏色越深，代表富集的顯著性更強(qiáng)。

1.6 分子對(duì)接通過PDB(http：//www.rcsb.org/)、Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站和ChembioOffice、PyMOL、Autodocktools、Vina軟件，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白與化學(xué)有效成分的結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 五苓散有效成分收集、篩選及相關(guān)靶點(diǎn)獲取結(jié)果通過1.1項(xiàng)下的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，經(jīng)檢索及條件篩選，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，獲得五苓散組方中的化學(xué)有效成分共計(jì)64個(gè)(桂枝7個(gè)，白術(shù)7個(gè)，豬苓11個(gè)，茯苓15個(gè)，澤瀉10個(gè))。再次利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能，經(jīng)過數(shù)據(jù)篩選找到其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，刪除重復(fù)和無(wú)效值，得到64個(gè)五苓散藥物作用靶點(diǎn)。將五苓散藥物、藥物有效成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入至Cytoscape 3.8.2中，構(gòu)建五苓散化學(xué)有效成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。

圖1 中藥—化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 疾病作用靶點(diǎn)獲取結(jié)果通過1.2項(xiàng)下的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合各數(shù)據(jù)庫(kù)所獲靶點(diǎn)后去重，最終獲取BPH的相關(guān)靶點(diǎn)3 951個(gè)。與五苓散的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，構(gòu)建“藥物-疾病”靶點(diǎn)韋恩圖，得到共有靶點(diǎn)46個(gè)，如圖2所示。并構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

圖2 藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

圖3 中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果運(yùn)用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)，輸入五苓散與BPH交集基因，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，將獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，將PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化(見圖4)。該圖由46個(gè)節(jié)點(diǎn)和200條邊構(gòu)成，其中節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺、連線疏密，代表靶點(diǎn)地位的重要性，分析得到度值前10位的核心基因：AR、ESR1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、RELA、CAT、NR3C1。

圖4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 五苓散治療BPH關(guān)鍵靶點(diǎn)GO生物學(xué)過程富集分析結(jié)果為獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的生物作用，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)功能富集分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)在2 899個(gè)條目上富集，包括2 436個(gè)生物過程(biological process，BP)、174條細(xì)胞組分(cellular component，CC)和289條分子功能(molecular function，MF)。BP結(jié)果顯示可能與類固醇激素反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程和應(yīng)對(duì)雌二醇等生物學(xué)過程相關(guān)；CC的結(jié)果表現(xiàn)可能與膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)等密切相關(guān)；而MF結(jié)果表明可能與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體的活動(dòng)和核受體的活動(dòng)等有關(guān)。圖5展示了BP、CC和MF各前10位GO分析的結(jié)果。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析

2.5 五苓散治療BPH關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析結(jié)果為獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)所富集的通路，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示五苓散治療BPH的關(guān)鍵靶點(diǎn)在211條通路上富集，其中包括雌激素信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、膽堿能突觸、化學(xué)致癌-受體激活、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、鈣信號(hào)通路等通路，圖6為KEGG富集分析結(jié)果前20位的氣泡圖。其中，在PPI網(wǎng)絡(luò)中位于核心基因的AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等涉及前20位的多條通路(圖7)，表明AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3可能為五苓散治療BPH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖6 KEGG 通路富集分析氣泡圖

圖7 KEGG和弦圖

2.6 活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果通過分子對(duì)接技術(shù)探討五苓散的主要活性成分是否通過關(guān)鍵靶點(diǎn)AR、ESR1、RELA、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3、HSP90AA1、CAT和NR3C1發(fā)揮治療BPH作用。從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，并下載PDB Formant格式文件，運(yùn)用AutoDock4.2.6軟件將化合物及靶點(diǎn)蛋白逐一進(jìn)行分子對(duì)接(見表1)。由表2可知，五苓散所含的小分子化合物與關(guān)鍵靶蛋白對(duì)接能都小于-5.0 kcal·mol-1，說明結(jié)合較好。借助Pymol2.5.0軟件對(duì)β-谷甾醇(MOL000358)與AR、ESR1進(jìn)行分子對(duì)接可視化(圖8)。

圖8 分子對(duì)接模式圖

3 討論

BPH屬于中醫(yī)“癃閉”范疇，癃閉之名最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！鹅`樞·五味》曾記載：“酸走筋，多食之，令人癃。”《素問·五常政大論》曰：“其病癃閉，邪傷腎也?！敝赋鲴]的病位在膀胱，認(rèn)為其病機(jī)主要是膀胱和三焦的氣化不利。《傷寒雜病論》提出用通陽(yáng)化氣方五苓散治療癃閉?！秱摗泛汀督饏T要略》指出該方原為治療蓄水證，注重化氣行水，氣助水行，陽(yáng)氣宣通，正如葉天士曰：“通陽(yáng)不在溫，而在利小便[14]?！彪S著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，五苓散在中醫(yī)臨床辨證施治的理論指導(dǎo)下，臨床應(yīng)用更加廣泛，不僅局限于腫脹利水等方面，在消化、血栓、關(guān)節(jié)炎、腎病及皮膚疾病等的治療中亦有重要意義[15-19]，但其藥方的開發(fā)與研究進(jìn)展較慢，作用機(jī)制尚不明確。中醫(yī)理論通過生物信息學(xué)工具，可以從多成分、多靶點(diǎn)角度揭示中藥作用機(jī)制，對(duì)中醫(yī)藥未來(lái)的發(fā)展產(chǎn)生新的改變[12]。本研究在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，基于五苓散成分靶點(diǎn)和BPH靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、Hub節(jié)點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、五苓散作用于BPH的核心靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG富集分析相結(jié)合的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，借助相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，從化合物分子角度進(jìn)一步預(yù)測(cè)和闡明了五苓散治療BPH的作用機(jī)制。

通過在TCMSP平臺(tái)收集五苓散的5味中藥，得到hederagenin、Cerevisterol、ergosta-7，22E-dien-3beta-ol、ent-Epicatechin、beta-sitosterol、(+)-catechin、taxifolin、sitosterol、Alisol B monoacetate、1-Monolinolein、ergosta-7，22-diene-3β-ol、ergosta-5，7，22-trien-3-ol等46個(gè)主要成分[6]，其中17個(gè)主要成分對(duì)應(yīng)46個(gè)疾病靶點(diǎn)，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得五苓散治療BPH的10個(gè)核心靶點(diǎn)，包括ESR1、RELA、AR、CAT、NR3C1、CASP3、JUN、PTGS2、NOS3等，為了更加明確五苓散治療BPH的生物學(xué)過程、細(xì)胞功能和分子組成，對(duì)10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，這些靶點(diǎn)主要涉及類固醇激素反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程和應(yīng)對(duì)雌二醇等生物學(xué)過程、膜筏、膜微區(qū)及膜區(qū)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體的活動(dòng)和核受體的活動(dòng)等生物過程。細(xì)胞組分方面，主要集中在G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、乙酰膽堿受體和核受體的活動(dòng)等生物過程中。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的相關(guān)通路包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、膽堿能突觸、化學(xué)致癌-受體激活、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、鈣信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、凋亡-多種物種、弓形體病、含血清素的神經(jīng)突觸、甲狀腺激素信號(hào)通路、神經(jīng)退行性變的途徑-多種疾病、結(jié)腸直腸癌、細(xì)胞凋亡、麻疹、刺激神經(jīng)組織的交互、EB病毒感染等信號(hào)通路。為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的推測(cè)，本研究選取五苓散的關(guān)鍵藥效物質(zhì)進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果顯示，所有對(duì)接結(jié)合能均小于-5.0 k·mol-1。表明雄激素受體(androgen receptor，AR)、雌激素受體(estrogen receptor，ESR1)均與beta-sitosterol(β-谷甾醇)對(duì)接較好，由此可見五苓散的關(guān)鍵藥效物質(zhì)與BPH核心靶點(diǎn)蛋白能夠穩(wěn)定結(jié)合，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)于五苓散作用機(jī)制的預(yù)測(cè)。

BPH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于激素誘導(dǎo)、老年發(fā)病、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化理論以及炎癥/生長(zhǎng)因子發(fā)病等理論較多[20]。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇對(duì)增生的前列腺組織在病理形態(tài)上具有一定的改善作用，并且對(duì)丙酸睪酮所致的BPH模型小鼠具有一定的治療作用[21-23]。ESR1、AR與BPH密切相關(guān)[24-26]。睪酮是男性體內(nèi)重要的雄激素，可與AR結(jié)合從而具有生物活性，可以調(diào)節(jié)前列腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化[27]。Asiedu等[28]通過收集健康對(duì)照組和BPH患者血液樣本，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)BPH患者的血液樣本中雄甾烷二醇、雄烯二酮以及游離睪酮的含量均較正常男性顯著降低，但雙氫睪酮的含量卻顯著增加。其機(jī)制可能是在5α-還原酶作用下，雄激素轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮，在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌二醇，導(dǎo)致前列腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞增殖、分裂，促進(jìn)BPH的發(fā)病[29]。研究發(fā)現(xiàn)，雌激素也參與調(diào)節(jié)男性的生殖系統(tǒng)，男性睪丸產(chǎn)生大約30%雌激素，雌激素在睪丸的間質(zhì)和上皮細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，可見雄激素/雌激素二者的平衡對(duì)男性BPH的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[30]。Chen等[31]也發(fā)現(xiàn)ESR1在BPH患者的前列腺組織中呈區(qū)域依賴性表達(dá)，雌激素能促進(jìn)前列腺的基質(zhì)細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五苓散中有效成分可能作用于BPH的關(guān)鍵靶點(diǎn)ESR1和AR，通過升高雌激素水平，降低前列腺和血清中睪酮和雙氫睪酮濃度，調(diào)節(jié)雌激素/雄激素的平衡，抑制前列腺中上皮和基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，從而治療BPH[23，32-33]。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)自身的局限性，未來(lái)將采取基礎(chǔ)研究的方法進(jìn)一步探討五苓散治療BPH的作用機(jī)制，為五苓散治療BPH提供更客觀的證據(jù)。