基于網絡藥理學和分子對接技術探索丹參治療習慣性流產潛在作用機制*

康寧，段晨晨，張清燕，3，岳靜宇，3，劉銀姣，李強，3

1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.洛陽市中醫(yī)院，河南 洛陽 471000；3.河南省病毒性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，河南 鄭州 450000

習慣性流產(habitual abortion)是指生育期婦女連續(xù)3次或3次以上的自然流產，其發(fā)病率約占妊娠婦女的1%[1]。近年來，國際上也采用復發(fā)性自然流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)進行病情評估，其定義為連續(xù)兩次或兩次以上自然流產，發(fā)病率約為5%[2]。發(fā)病原因主要以內分泌紊亂、自身免疫因素、先天性染色體異常以及子宮畸形等?，F(xiàn)階段臨床研究表明，該病常為多因素互相影響致病，故西醫(yī)治療未取得突破性進展。中醫(yī)學認為習慣性流產屬于“滑胎”“數墮胎”等范疇，其病因病機與肝郁氣滯、腎虛血瘀、氣血不足、脾腎兩虛等有關，中醫(yī)從整體觀念出發(fā)，辨證施治，臨床療效可靠、安全性強[3]。研究顯示，腎虛血瘀型習慣性流產的發(fā)病率占不明原因習慣性流產患者的82.3%[4]，因此探索該證型的臨床治療及機制研究具有重要的現(xiàn)實意義。

胚胎的形成和發(fā)育主要與腎、沖脈、任脈密切相關，頻繁墮胎導致精血耗傷，進而引起腎陰虧虛和沖任二脈的損傷，而反復墮胎導致瘀血滯留胞中，再孕后又因精血聚于下以養(yǎng)胎，而聚于胞宮之精血會使血液運行的阻力增加，從而加劇瘀血的形成，瘀血不去則新血難生，不能養(yǎng)胎，致胎元難固而流產，最終形成腎虛血瘀病理機制[5-7]。另外，王永富等[8]認為“凡出血，必有瘀血”“血以流為貴，以滯為患”“瘀血不去，新血不得歸經”“安胎必和血，血和胎自安”等，從而確定了活血、化瘀、補腎、安胎為主的治療原則。丹參作為治療腎虛血瘀型習慣性流產的代表用藥，已被廣泛應用于臨床并取得較好療效。丹參，苦，微寒，歸心、心包、肝經，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神之功效[9]。丹參治療習慣性流產的機制仍需進一步系統(tǒng)深入研究，因此利用網絡藥理學系統(tǒng)闡明丹參治療腎虛血瘀型習慣性流產的作用機制，為丹參治療習慣性流產的深入研究提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 數據庫及應用軟件中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)數據庫(http：//tcmspw.com)；Swiss Target Prediction 數據庫 (http：//www.swisstargetprediction.ch/)；UniProt 數據(http：//www.Uniprot.org/)；人類基因(GeneCards)數據庫(https：//www.genecards.org/)；人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM)數據庫 (https：//omim.org/)；STRING數據庫(https：//string-db.org/cgi/input.pl)；DAVID 6.8數據庫(https：//david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape 3.6.0軟件；Open Babel軟件；R studio軟件。

1.2 化學成分收集通過TCMSP數據庫及文獻檢索獲得丹參的化學成分[10]。TCMSP數據庫獲得的化學成分以其吸收、分布、代謝、排泄(ADME)參數中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%或類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.18為限制條件進行篩選。文獻查閱獲得的主要活性成分，通過TCMSP數據庫獲得ADME參數及Mol2格式的分子結構。

1.3 靶點獲取TCMSP數據庫查找活性成分作用靶點，檢索Uniprot數據庫將靶點名稱校正為官方基因名稱 (official gene symbol)。利用Open Babel軟件將分子格式轉換為sdf格式，導入Swiss Target Prediction預測靶點，剔除可能性為零的靶點。將TCMSP獲取靶點與Swiss Target Prediction預測靶點進行合并，剔除重復和非人類靶點，取兩者并集即為丹參活性成分作用靶點。

OMIM數據庫、Genecard數據庫檢索關鍵詞“recurrent spontaneous abortion”獲取疾病靶點，合并兩個數據庫獲得的疾病靶點，剔除重復，即獲得習慣性流產的疾病靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖的構建活性成分靶點與疾病靶點進行映射取交集，獲得丹參治療“recurrent spontaneous abortion”的潛在作用靶點。將以上活性成分及靶點信息導入Cytoscape 3.6.0構建“中藥-活性成分-靶點-疾病”關系網絡圖。

1.5 蛋白質相互作用(PPI)網絡圖的構建將活性成分對習慣性流產潛在作用靶點導入String數據庫，選定物種Homo sapiens，置信度為0.99，剔除無相互作用靶點，獲取蛋白質相互作用相關信息。利用Cytoscape 3.6.0中的Network Analyzer插件進行蛋白質互作網絡分析。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析活性成分的潛在習慣性流產蛋白靶點導入DAVID 6.8數據庫，選定物種為 Homo sapiens，對GO下的分子功能 (molecular function，MF)、生物過程 (biological process，BP) 和細胞組成 (cellular component，CC)，以及對KEGG Pathway進行分析。導出結果設定顯著性為P<0.05，按照Count值進行篩選，獲得富集顯著的功能注釋與疾病相關通路。

1.7 活性成分-作用靶點的分子對接選取PPI網絡中排名前5位的靶點作為丹參治療習慣性流產關鍵靶點，從PDB數據庫 (http：//www.rcsb.org/) 獲取關鍵靶點的3D結構 (PDB Format)，利用 Pymol 2.0軟件對靶點蛋白進行去水、加氫、加電荷等處理，應用Lepro功能確定靶蛋白的結合位點。運用Ledock軟件對丹參活性成分及其關鍵靶點進行分子對接，對接結果篩選閾值為-6 kcal·mol-1，其中數值越小代表分子與靶蛋白的結合力越好，即分子對于靶蛋白作用力越強。

2 結果

2.1 丹參活性成分的篩選結果通過TCMSP數據庫檢索共得到丹參中藥化學成分202個。將OB≥30%、DL≥0.18作為限制條件后，篩選出有效分子共65個。另通過文獻查閱，丹參主要成分有原兒茶醛、丹酚酸B、原兒茶酸、丹參素、咖啡酸、異阿魏酸、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C共10種化合物。其中，迷迭香酸與TCMSP獲得化合物重合，其余9種化合物作為丹參已經確認成分將其納入。因此，共得到丹參活性成分74種。

2.2 丹參治療習慣性流產潛在作用靶點預測結果檢索TCMSP及Swiss target prediction數據庫初步獲取活性成分作用靶點，校正基因名稱，剔除非人類靶點及重復靶點，最終預測獲得活性成分作用靶點774個(TCMSP來源活性成分作用靶點759個，文獻來源活性成分作用靶點15個)。Genecards及OMIM數據庫獲取習慣性流產靶點，去除重復后獲得1 956個習慣性流產相關靶點 (Genecards，1 941 個；OMIM，26個)。將習慣性流產靶點與活性成分靶點映射取交集獲得303個交集靶點，該交集靶點極有可能為丹參治療習慣性流產的潛在作用靶點(圖1)。

圖1 丹參活性成分靶點與疾病靶點韋恩圖

2.3 中藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖的構建與分析結果丹參、74個有關活性成分、303個交集靶點以及習慣性流產疾病導入Cytoscape3.6.0構建“中藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖”(圖2)。該圖包含中藥、活性成分、靶點、疾病4種不同屬性文件，綠色六邊形代表丹參，藍色圓形代表活性成分，粉色箭頭代表靶點，粉色三角代表習慣性流產。屬性文件中兩者間存在聯(lián)系則通過邊表示，同一活性成分發(fā)射的邊越多代表其作用靶點越多，可通過degree值直觀反映其作用靶點數量。degree值排名靠前的活性成分分別為木樨草素(90)、丹參新醌D(63)、紫丹參素C(58)、丹參素(56)，該數據反映單個活性成分可作用于多個靶點。degree值排名靠前的交集靶點為前列腺素內過氧化物酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2；58)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，ACHE；46)、碳酸酐酶2(Carbonic anhydrase 2，CA2；39)、雄激素受體(Androgen receptor，AR；39)，此數值預示同一個靶點是由多個活性成分共同作用。即丹參治療習慣性流產具有多成分、多靶點的特點。

圖2 丹參活性成分-靶點-疾病網絡圖

2.4 蛋白質相互作用分析結果丹參治療習慣性流產的303個交集靶點進行蛋白質相互作用網絡分析，其篩選條件為結合打分(combined_score)>0.99。PPI網絡圖共涉及128個節(jié)點和201條邊，節(jié)點大小直觀體現(xiàn)靶點degree值大小(圖3)。由圖可見細胞腫瘤抗原p53(Cellular tumor antigen p53，TP53；17)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cyclin-dependent kinase 1，CDK1；14)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1；13)、信號傳導及轉錄激活蛋白3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3；12)、周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1，CDKN1A；11)等在習慣性流產致病過程中與其他多種蛋白相互作用。高degree值蛋白在疾病致病過程中占據重要的地位，即這類蛋白在丹參治療習慣性流產時起關鍵作用。綜上，PPI網絡分析結果表明，該治療過程具有多靶點協(xié)同作用的特點。

圖3 丹參-習慣性流產交集蛋白質相互作用網絡圖

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結果基于DAVID數據庫進行潛在靶點的GO功能富集分析，篩選條件為P<0.05。該分析獲得1 204個條目(生物過程913條，分子功能191條，細胞組件100條)。首先，細胞組件反映細胞內基因產物(或基因產物組)位于何種細胞器(如質膜、胞漿、核等)，該參數可直接展示丹參治療習慣性流產過程中行使功能的基因在胞內的主要空間位置。排名靠前的細胞組分主要為質膜、細胞溶質、細胞外間隙、核質等。其次，分子功能主要體現(xiàn)單個基因產物的分子生物學活性(如催化活性、轉運活性、結合活性等)。分子功能分析結果為酶結合活性、蛋白質結合活性、ATP結合活性、蛋白激酶活性等。生物過程則是基因(基因組)功能的有序組合，反映了多層次、多步驟的生物學過程。排名靠前的生物過程包括細胞增殖的正調控、炎癥反應、蛋白質磷酸化等(圖4)。

圖4 丹參治療習慣性流產相關靶點GO功能富集分析

雖然GO富集分析全面體現(xiàn)細胞組件、分子功能及生物過程，但并不涵蓋丹參治療習慣性流產所涉及信號通路及通路中的作用蛋白。故KEGG信號通路富集是揭示丹參治療習慣性流產相關機制所必不可少的環(huán)節(jié)。信號通路富集分析得到共138條通路。篩選Count值排名前20條通路進行圖片展現(xiàn)。癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥的蛋白多糖通路、Rap1信號通路、乙型肝炎、癌癥中MiRNA、刺激神經組織的交互通路、黏著斑通路、HTLV-1感染信號通路、HIF-1信號通路等(圖5)。其中，癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白多糖通路、Rap1信號通路含有最多的靶點蛋白，分別含有76、51、42、37個靶點。綜上，丹參可通過多靶點、多通路治療習慣性流產。

圖5 丹參治療習慣性流產靶蛋白KEGG通路富集分析圖

2.6 分子對接及結合模式分析結果應用LeDock軟件將丹參活性成分與關鍵蛋白對進行分子對接驗證，對接結合自由能越低代表結合狀態(tài)越穩(wěn)定，本次篩選標準為自由能 ≤ -6 kcal·mol-1。其中，靶點TP53對接效果最好，STAT3次之。丹參中多個活性成分與TP53結合較為穩(wěn)定，排名靠前的為丹參酚酸C(MOL007137)，黃芩苷(MOL002776)、丹參酚酸 J(MOL007142)、丹參酚酸B(MOL007074)、丹參酚酸A(MOL007136)。而丹參酚酸B、丹參酚酸C、紫草酸(MOL008884)、丹參酚酸 J、丹參酚酸A與STAT3對接效果良好(見表1)。

表1 丹參活性成分與關鍵靶點的相關信息

分子對接結合模型將展現(xiàn)化學成分與關鍵靶點間的相互作用情況，直觀體現(xiàn)兩者結合部位及結合作用力類型(圖6)。本文將展現(xiàn)TP53及STAT3結合最穩(wěn)定的TP53-紫草酸結合模型及STAT3-丹參酚酸B結合模型。其中，TP53-紫草酸結合模型顯示，其結合區(qū)域為TP53的β-折疊區(qū)域形成的疏水口袋，且活性成分與Asp148、Ser220、Thr230形成氫鍵，與Val147、Leu145形成疏水作用。而丹參酚酸B-STAT3結合模型表明，丹參酚酸B主要以氫鍵的形式與STAT3的Gly617、Ser613、Ser611、Glu638相互作用，與Pro639、Ser614、Glu612、Ser636通過疏水作用形成穩(wěn)定構象。

圖6 丹參活性成分與習慣性流產關鍵靶點分子對接模式圖

3 討論

習慣性流產的中醫(yī)證型以腎虛血瘀為主[11]，治療原則為補腎化瘀安胎。補腎類中藥能夠直接作用于卵巢并保持卵巢功能的平衡，使女性內分泌趨于正常，緩解衰老，延長活力，而在補腎的基礎上加活血祛瘀中藥后，則使卵巢功能得到改善，促進成熟卵泡排卵及黃體發(fā)育?！渡褶r本草經》曰：“丹參，味苦微寒，主心腹邪氣，腸鳴幽幽如走水，寒熱積聚，破癥除瘕，止煩滿，益氣。一名郄蟬草。生川谷[12]?！爆F(xiàn)代藥理研究證實，丹參可有效防治心腦血管疾病、骨質疏松、婦科疾病、習慣性流產、抗纖維化等[13-14]。雖然臨床研究表明，丹參可有效治療習慣性流產，但相關機制仍需進一步探索。本研究利用網絡藥理學探尋丹參治療習慣性流產的活性成分、關鍵蛋白、基因本體論、相關信號通路，而后利用分子對接技術驗證活性成分與關鍵靶點結合情況。

丹參治療習慣性流產的主要活性成分為木樨草素、丹參新醌D、紫丹參素C、丹參素。既往研究表明，木樨草素能夠有效抑制炎性刺激下中性白細胞、淋巴細胞、成纖維細胞等細胞活化以及NO、白三烯、TNF等炎性物質的釋放[15]，抑制前列腺素E2及COX-2蛋白活性進而抑制急性、慢性炎癥反應。丹參新醌D可有效抑制人型結核分枝桿菌活性[16]。紫丹參素C作用于血小板活化通路靶點進而干預血栓形成[17]。丹參素作為早期丹參分離出的水溶性代表成分，其臨床療效有抗血栓形成、抗血小板聚集、抑制炎癥作用等[18-19]。雖然，丹參主要活性成分治療習慣性流產的直接研究缺失，但其抗炎作用、抗血栓形成的功能是治療血瘀型習慣性流產的關鍵所在。因此，丹參治療習慣性流產的關鍵活性成分的獲取及分析為今后其藥理學研究及實驗驗證提供了新思路。

丹參活性成分可通過303個蛋白靶點治療習慣性流產。其中，degree值排名靠前的靶點(PTGS2、ACHE、CA2、AR)可被丹參多種活性成分作用。近期研究表明，自身免疫型習慣性流產小鼠模型中PTGS2亞型(COX-2)的表達明顯低于正常妊娠模型[20]。而ACHE在先兆性流產患者體內該酶活性明顯低于同時期正常孕婦。故作為孕婦產檢指標之一，ACHE的活性檢測對預防先兆性流產具有重要意義。血小板CA2功能研究證實其有望成為降低心血管疾病的新靶點[21]。再者，習慣性流產患者體內長的AR基因CAG重復序列會增加復發(fā)性自然流產的發(fā)病風險[22]。PPI分析顯示丹參治療習慣性流產的關鍵蛋白為TP53、CDK1、AKT1、STAT3、CDKN1A。此類蛋白可與多種習慣性流產蛋白相互作用，故其在丹參治療習慣性流產的相關通路中占據重要地位。因此，將關鍵蛋白與KEGG信號通路結合討論。

GO富集分析顯示，丹參治療習慣性流產涉及細胞內多空間(質膜、細胞溶質、細胞外間隙等)、多分子生物學活性(酶結合活性、蛋白質結合活性、ATP結合活性等)、多生物過程(細胞增殖的正調控、炎癥反應、蛋白質磷酸化等)，即丹參治療習慣性流產是一個多層次復雜的過程。同時，KEGG分析顯示交集靶點富集于癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路等。丹參治療習慣性流產通過癌癥通路中關鍵蛋白TP53、IL-2、IL-4、IL-6、STAT3等行使功能。其中，習慣性流產患者體內絨毛組織中TP53蛋白表達明顯高于健康對照組，調控下游蛋白 CDKN1A、Bax和Bcl-2，介導滋養(yǎng)細胞凋亡，引起其侵襲功能減弱，導致流產[23-24]。IL-2、IL-4、IL-6為細胞因子家族，參與機體免疫反應，母胎界面免疫異常激活是習慣性流產的重要機制。同時，習慣性流產患者母胎界面的Th1/Th2細胞失衡，Th1細胞因子(IL-2、IFN-γ)水平高于健康對照組，Th2細胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)含量較低。IL-2抑制滋養(yǎng)層細胞增殖進而抑制胎盤發(fā)育，同時促進免疫排斥反應造成胚胎丟失。IL-4 及IL-6的減少導致滋養(yǎng)層細胞入侵功能減退，胎盤血管內皮細胞功能障礙，從而導致流產。同時，細胞因子結合細胞膜受體激活JAK蛋白磷酸化，活化STAT3，調控細胞增殖或凋亡。其中，子宮內膜細胞內STAT3活化降低導致子宮內膜容受性減弱，不易于胚胎著床[25]；ACA陽性流產小鼠母胎界面JAK/STAT3通路蛋白表達異常、滋養(yǎng)細胞遷移異常、子宮內膜細胞生成減少、母胎界面組織受損導致流產[26]。PI3K-Akt信號通路與滋養(yǎng)細胞的增殖、分化與侵襲功能緊密聯(lián)系?；颊咦訉m蛻膜中PI3K-Akt信號通路關鍵蛋白表達較正常人明顯下調[27]。小鼠實驗證實補腎安胎沖劑可通過 PI3K-Akt信號通路改善復發(fā)性流產小鼠母胎界面血管生成，穩(wěn)固妊娠，預防及治療習慣性流產[28]。Rap1信號通路中EGFR、AKT1、PI3K等為丹參治療習慣性流產的關鍵靶點。其中，絨毛及蛻膜組織中 EGFR 的低表達可直接導致流產[29]。綜上，丹參通過多靶點、多通路治療習慣性流產。

丹參活性成分與關鍵靶點的分子對接結果顯示，丹參中水溶性活性成分(丹參酚酸A、丹參酚酸B、丹參酚酸C等)及脂溶性活性成分(黃芩苷、紫草酸)與TP53及STAT3結合度較高。其中，分子對接結果表明，丹參酚酸C與TP53及STAT3的結合能力均較強，該結果驗證了丹參治療習慣性流產具有多靶點的特點。其結合模型3D空間構象結果顯示，活性成分通過氫鍵(與蛋白質的Ser、Thr、Asp等殘基形成)及疏水作用結合于TP53或STAT3的蛋白質疏水口袋內。綜上，丹參活性成分與關鍵蛋白的分子對接研究，既驗證了網絡藥理學預測丹參活性成分作用于靶點的可靠性，又反映活性成分與關鍵蛋白的結合情況。

綜上所述，丹參治療習慣性流產在臨床療效上具有系統(tǒng)性、整體性及協(xié)同性，網絡藥理學分析顯示，該過程在機制上具有多組分、多靶點、多通路協(xié)同作用的特點。丹參治療習慣性流產的主要成分為木樨草素、丹參新醌D、紫丹參素C、丹參素等，通過作用關鍵靶點TP53、CDK1、AKT1、STAT3、CDKN1A治療習慣性流產。其中，主要涉及癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路等。丹參通過多靶點多通路調控細胞因子的分泌及炎癥反應、滋養(yǎng)層細胞的增殖與入侵、子宮內膜容受性、母胎界面血管的生成等生物過程治療習慣性流產。其中，該研究中活性成分預測的部分靶點功能與已有文獻報道高度一致。依托該方法研究丹參治療習慣性流產的機制具有可靠性、可行性，故該研究結果為后期臨床研究及實驗驗證提供依據。網絡藥理學及分子對接技術為揭示中藥治療疾病的復雜機制提供切入點，但其深入機制仍需大量的臨床研究及基礎實驗進行科學驗證。