利用宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)揭示血液病患者的感染譜

龐如利，吳梅青，石澤延，林雨，粟燕云，周寶文，白子文，趙衛(wèi)華

感染是血液病患者常見的并發(fā)癥和死亡原因，研究發(fā)現(xiàn)引起血液病患者感染的原因一方面是由于患者接受化療等治療引起中性粒細(xì)胞減少，另一方面是由于多種侵入性操作和輸血等[1-3]。因此，早期檢測(cè)引起感染的病原微生物對(duì)改善血液病患者的預(yù)后尤為重要。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法，以培養(yǎng)法為代表，培養(yǎng)周期過(guò)長(zhǎng)、且容易受抗生素的影響，不利于臨床快速診斷和治療[4]。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，近年來(lái)出現(xiàn)的宏基因組高通量測(cè)序（mNGs）技術(shù)在臨床中得到越來(lái)越多的應(yīng)用。mNGs技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、所需樣本量小、檢測(cè)快、不易受污染、可檢測(cè)出培養(yǎng)法不能檢測(cè)的邊緣微生物的優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究回顧性分析2018年8月至2020年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科利用mNGs技術(shù)檢測(cè)有或疑似有感染癥狀患者的數(shù)據(jù)，明確患者的感染譜，以探討該技術(shù)在血液病患者感染的早期診斷及治療中的意義。

本研究主要發(fā)現(xiàn)：

（1）本研究利用宏基因組高通量測(cè)序（mNGs）技術(shù)揭示了血液學(xué)患者的感染譜，革蘭陽(yáng)性菌中最常見的為痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌，革蘭陰性菌中最常見的為約翰遜不動(dòng)桿菌、越南伯克霍爾德菌、烏汶克霍爾德菌，真菌中最常見的為限制性馬拉色菌；病毒中最常見的為巨細(xì)胞病毒、EB病毒、細(xì)環(huán)病毒。（2）mNGs技術(shù)與其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有高敏感性，可檢出更多病原體，且檢測(cè)時(shí)間快，對(duì)臨床盡早確定感染病因，調(diào)整用藥方案具有重要參考意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來(lái)源于2018年8月至2020年12月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科住院期間出現(xiàn)感染或疑似感染癥狀的53例血液病患者，對(duì)53例患者的58個(gè)樣本（全血、腦脊液、胸腔積液、組織、腹腔引流液、關(guān)節(jié)液、痰液、右下肢穿刺液）進(jìn)行mNGs技術(shù)檢測(cè)。樣本送檢前有50個(gè)樣本的患者（包括45例患者，其中5例患者在不同的時(shí)間段送檢2次）有不同程度的發(fā)熱，伴隨癥狀有頭暈、頭痛、嗜睡、咳嗽、咳痰、咽痛、胸悶、胸痛、氣促等，其中進(jìn)行影像學(xué)檢查的45個(gè)樣本中出現(xiàn)胸部、腹部或腦部影像學(xué)改變有34個(gè)（包括32例患者，其中2例患者在不同的時(shí)間段送檢2次）；8個(gè)樣本的患者（8例患者）無(wú)發(fā)熱，其中7個(gè)樣本的患者僅表現(xiàn)為胸悶、氣促、抽搐等疑似感染癥狀，1個(gè)樣本的患者無(wú)明顯癥狀，有7例患者出現(xiàn)胸部、腦部或關(guān)節(jié)影像學(xué)改變。此外，標(biāo)本送檢前54個(gè)樣本的患者采用經(jīng)驗(yàn)性抗菌、抗真菌或抗病毒藥物治療1～69 d，相關(guān)報(bào)道指出mNGs技術(shù)檢測(cè)結(jié)果受抗生素的影響較小[5]。

1.2 方法

1.2.1 mNGs技術(shù) 采用3種mNGs技術(shù)檢測(cè)方法，分別為PMseqTM、PDC-seqTM、IDseqTM 。3種方法基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本中微生物核酸序列進(jìn)行分析，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有微生物的核酸序列進(jìn)行比對(duì)鑒定微生物。檢測(cè)過(guò)程：不同標(biāo)本分別冷鏈送至華大基因公司（49個(gè)標(biāo)本）、杰毅基因公司（5個(gè)標(biāo)本）、微遠(yuǎn)基因公司（4個(gè)標(biāo)本）。對(duì)送檢的樣本進(jìn)行處理、提取核酸（DNA和/或RNA）。對(duì)于核酸含量符合要求的樣本分別進(jìn)行PMseqTM文庫(kù)構(gòu)建、PDC-seqTM文庫(kù)構(gòu)建、IDseqTM文庫(kù)構(gòu)建，然后進(jìn)行mNGs，去除測(cè)序的接頭及低質(zhì)量和低復(fù)雜區(qū)域的序列后，利用計(jì)算宿主減法濾過(guò)人類基因組數(shù)據(jù)[6]，將處理后的非人類測(cè)序讀數(shù)與所構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行匹配，最后取得可疑致病微生物的種類及相對(duì)豐度信息，從標(biāo)本送檢至結(jié)果報(bào)告僅需2～3個(gè)工作日。

1.2.2 其他方法 在進(jìn)行mNGs技術(shù)檢測(cè)的同時(shí)，52例患者（55個(gè)樣本）采用培養(yǎng)法檢測(cè)致病微生物、46例患者（50個(gè)樣本）采用G/GM試驗(yàn)檢測(cè)致病微生物、44例患者（48個(gè)樣本）采用PCR檢測(cè)致病微生物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用sPss 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者資料及送檢情況 53例患者中男36例，女17例；年齡4～67歲，中位年齡18歲；重型地中海貧血23例，白血病17例，淋巴瘤4例，多發(fā)性骨髓瘤3例，地中海貧血合并白血病1例，重型再生障礙性貧血1例，骨髓增生異常綜合征1例，白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)升高查因1例，全血細(xì)胞減少查因1例，發(fā)熱查因1例。53例患者中有5例患者送檢2次，其中在8個(gè)月內(nèi)、4個(gè)月內(nèi)、2個(gè)月內(nèi)送檢2次的各有1例，在1個(gè)月內(nèi)送檢2次的有2例。所送檢的58個(gè)樣本類型為全血（42個(gè)）、腦脊液（4個(gè)）、胸腔積液（4個(gè)）、組織（3個(gè)）、腹腔引流液（1個(gè)）、關(guān)節(jié)液（1個(gè)）、痰液（1個(gè)）、右下肢穿刺液（1個(gè)）。送檢前白細(xì)胞計(jì)數(shù)：33個(gè)樣本＜4×109/L，19個(gè)樣本為（4～10）×109/L，6個(gè)樣本＞10×109/L；送檢前中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：16個(gè)樣本＜0.5×109/L，10個(gè)樣本為（0.5～2.0）×109/L，32個(gè)樣本 ＞2.0×109/L。

2.2 mNGs技術(shù)檢測(cè)血液病患者的感染譜 對(duì)58個(gè)樣本進(jìn)行mNGs，57個(gè)樣本檢出可疑病原體（占98.3%），1個(gè)樣本無(wú)病原體檢出，且其他檢測(cè)方法亦為陰性，所檢測(cè)樣本的結(jié)果見圖1。

圖1 mNGs技術(shù)檢測(cè)的血液病患者的感染譜Figure 1 Bacterial and viral pathogen spectra of infections in patients with hematological diseases detected by use of mNGs technology

2.2.1 細(xì)菌感染譜 共檢測(cè)出革蘭陽(yáng)性菌153例次，含25種細(xì)菌，前3位分別為痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌（分別為42、33、32例次，平均序列分別為187、117、240），見表1。共檢測(cè)出革蘭陰性菌202例次，含47種細(xì)菌，常見的為約翰遜不動(dòng)桿菌、越南伯克霍爾德菌、烏汶克霍爾德菌（分別為26、20、19例次，平均序列分別為249、4 582、238），見表2。

表1 測(cè)序陽(yáng)性的革蘭陽(yáng)性菌分布情況〔n（%）〕Table 1 The distribution of Gram-positive bacteria detected by use of mNGs technology

表2 測(cè)序陽(yáng)性的革蘭陰性菌分布〔n（%）〕Table 2 The distribution of Gram-negative bacteria detected by use of mNGs technology

2.2.2 真菌感染譜 共檢出真菌40例次，含12種真菌，其中以限制性馬拉色菌最常見（28例次，平均序列為69），見表3。

表3 測(cè)序陽(yáng)性真菌分布 〔n（%）〕Table 3 The distribution of fungi species detected by use of mNGs technology

2.2.3 病毒感染譜 病毒檢測(cè)范圍僅限于常見DNA病毒，共檢出病毒97例次，含22種病毒，其中常見的為巨細(xì)胞病毒（CMV）、各型細(xì)環(huán)病毒、EB病毒（分別為26、19、13例次，平均序列分別為595、23、307），見表4。其他病原微生物感染譜：1例重型地中海貧血造血干細(xì)胞移植后患者血液及腦脊液樣本中均檢出剛地弓形蟲（序列分別為151、34 183）。

表4 測(cè)序陽(yáng)性病毒種類分布〔n（%）〕Table 4 The distribution of viral species detected by use of mNGs technology

2.3 mNGs技術(shù)與其他檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果比較及指導(dǎo)治療情況 選擇同時(shí)進(jìn)行mNGs技術(shù)檢測(cè)、培養(yǎng)法、G/GM試驗(yàn)、PCR檢測(cè)的38個(gè)樣本進(jìn)行分析。mNGs技術(shù)與培養(yǎng)法、G/GM試驗(yàn)、PCR檢測(cè)病原微生物陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=64.504，P＜0.001）；mNGs技術(shù)檢測(cè)病原微生物陽(yáng)性率高于培養(yǎng)法、G/GM試驗(yàn)、PCR檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=44.333、P＜0.001，χ2=37.255、P＜0.001，χ2=52.356、P＜0.001），見表5。mNGs技術(shù)與其他檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)出相同病原微生物的有14個(gè)樣本，樣本陽(yáng)性一致率為36.8%，檢出的相同病原微生物為CMV、EB病毒、嗜麥芽窄食單胞菌、限制性馬拉色菌、曲霉菌屬、白色念珠菌、阿薩西毛孢子菌。mNGs技術(shù)未檢出相關(guān)病原微生物但其他檢測(cè)方法檢出的樣本數(shù)為8個(gè)，概率為21.0%，相關(guān)病原微生物包括嗜麥芽窄食單胞菌、EB病毒、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌。此外，根據(jù)mNGs技術(shù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥的有6例患者，其中4例患者經(jīng)治療好轉(zhuǎn)，2例患者治療效果欠佳，治療效果欠佳患者系多重感染且免疫力低下，見表6。達(dá)70%[11]。以上研究說(shuō)明血液病患者極易發(fā)生感染，及時(shí)檢測(cè)出引發(fā)感染的病原微生物對(duì)于正確使用抗感染藥物、快速控制感染及降低血液病患者死亡率具有重要

表5 mNGs技術(shù)與其他檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果比較Table 5 Detection results by use of mNGs technology and other three test methods

表6 根據(jù)mNGs技術(shù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥情況Table 6 Medications adjusted for seven patients by the mNGs technology detection results

3 討論

惡性血液病患者由于受原發(fā)病的影響，免疫力低，傳統(tǒng)的化療藥物會(huì)導(dǎo)致其免疫力進(jìn)一步受到影響，感染風(fēng)險(xiǎn)增加[7]。雖然近年來(lái)免疫抑制劑和小分子靶向藥物的使用改變了血液病患者的治療前景，但其與患者潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系密切[8]。研究表明，感染是超過(guò)60%的血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的死亡原因，病原微生物感染所占比重從高到低依次為細(xì)菌感染、真菌感染、病毒感染[9]。有研究指出血液病患者和腫瘤患者血流感染的總死亡率為12.3%[10]。此外，也有研究表明血流感染是腫瘤患者30 d內(nèi)死亡的影響因素，其死亡率為22%，若不能得到及時(shí)有效的抗感染治療，死亡率可高意義。傳統(tǒng)的病原微生物檢測(cè)方法雖然技術(shù)成熟，但存在檢測(cè)的病原微生物譜窄、不可檢測(cè)特殊病原微生物、花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的局限，二代測(cè)序技術(shù)很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)，其向臨床報(bào)告結(jié)果僅需2～3個(gè)工作日。本研究利用mNGs技術(shù)揭示了血液病患者的感染譜，下面就該感染譜的部分病原微生物展開討論。

既往研究表明，惡性血液病患者院內(nèi)感染最常見的部位是呼吸道，最常見的病原菌是革蘭陰性菌[12-13]。本研究的細(xì)菌感染譜結(jié)果與上述結(jié)論一致，檢出的病原菌也以革蘭性陰性菌居多，但具體病原菌不盡相同，這主要?dú)w因于檢測(cè)方法的不同，mNGs技術(shù)的檢測(cè)敏感性高，可檢測(cè)更多的機(jī)會(huì)性致病菌。本研究檢出的革蘭陽(yáng)性菌中常見的葡萄球菌為表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，均為機(jī)會(huì)性致病菌，人體免疫力下降時(shí)機(jī)會(huì)性致病葡萄球菌可能會(huì)引起感染癥狀。此外，由于近年來(lái)抗生素的廣泛使用，葡萄球菌多重耐藥有上升趨勢(shì)，一項(xiàng)研究指出人葡萄球菌及表皮葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥率較高，分別為68.0%及90.9%[14]。故血液病患者出現(xiàn)感染癥狀并伴有葡萄球菌感染時(shí)，需根據(jù)臨床情況及時(shí)排查感染因素，謹(jǐn)慎處理。

本研究真菌感染譜中檢出率最高的為限制性馬拉色菌。限制性馬拉色菌是健康人皮膚的常駐優(yōu)勢(shì)真菌[15]，也是一種條件致病菌。此外，本研究共檢出霉菌和酵母菌6例次（占15%），一項(xiàng)關(guān)于血液病患者真菌感染的研究顯示，血液病患者感染霉菌和酵母菌后的死亡率分別為70%和39%[16]，提示早期檢測(cè)出感染菌種有利于治療效果及預(yù)后。

一項(xiàng)對(duì)血液病患者造血干細(xì)胞移植后感染譜的研究顯示，病毒感染譜中檢出率最高的依次為CMV、EB病毒、細(xì)環(huán)病毒[17]。本研究病毒感染譜與之基本一致。另有研究顯示血液病患者發(fā)生CMV、EB病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)高，且二者感染可降低患者免疫力，進(jìn)一步加重感染風(fēng)險(xiǎn)[18]。此外，有研究指出細(xì)環(huán)病毒是免疫力的潛在標(biāo)志物，可作為免疫力評(píng)估的補(bǔ)充[19-20]。

有研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是血液病患者造血干細(xì)胞移植后的主要并發(fā)癥，弓形蟲感染是其主要病因[19-20]。而本研究中利用mNGs技術(shù)檢測(cè)1例重型地中海貧血造血干細(xì)胞移植后患者血液及腦脊液樣本中均發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲感染，為其治療方案提供了不可或缺的證據(jù)。

此前有研究指出mNGs技術(shù)比傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性率更高，敏感性更高[21]，本研究結(jié)果與之一致。本研究利用mNGs技術(shù)對(duì)血液病患者樣本的檢測(cè)陽(yáng)性率為98.3%，遠(yuǎn)高于使用其他檢測(cè)方法（培養(yǎng)法、G/GM試驗(yàn)、PCR檢測(cè)）的陽(yáng)性率。mNGs技術(shù)的高敏感性對(duì)于血液病患者感染病因的尋找更加有利。但由于此法的高敏感性，樣本的污染菌也會(huì)被一并檢測(cè)出，故檢測(cè)結(jié)果會(huì)混淆臨床醫(yī)生對(duì)感染病因的準(zhǔn)確判斷。只有在各個(gè)流程盡量避免樣本污染方可避免。此外，mNGs技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、所需樣本量小、檢測(cè)快的優(yōu)點(diǎn)，可使臨床工作者在最短時(shí)間內(nèi)確定血液病患者感染病因，合理使用藥物控制感染，降低患者死亡率和改善患者預(yù)后，這與本研究根據(jù)mNGs技術(shù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥的患者大多可控制感染的情況一致。本研究結(jié)果顯示，在同時(shí)進(jìn)行4種檢測(cè)方法的38樣本中，mNGs技術(shù)未檢出相關(guān)病原菌但其他檢測(cè)方法檢出的樣本數(shù)為8個(gè)，說(shuō)明mNGs技術(shù)有一定的假陰性率，故在進(jìn)行mNGs技術(shù)檢測(cè)的同時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法、G/GM試驗(yàn)、PCR檢測(cè)以增加查找感染病因的準(zhǔn)確度。本研究檢出的結(jié)果與全國(guó)多中心細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果不一致，主要?dú)w因于本研究所用檢測(cè)方法的不同且患者數(shù)量有限。

綜上所述，mNGs技術(shù)比其他檢測(cè)技術(shù)對(duì)血液病患者感染病因的確定更具有優(yōu)勢(shì)，但其可能出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，結(jié)合其他檢測(cè)方法可降低錯(cuò)誤診斷的機(jī)會(huì)。

作者貢獻(xiàn)：龐如利進(jìn)行文章的構(gòu)思和研究設(shè)計(jì)，結(jié)果的分析與解釋，負(fù)責(zé)撰寫論文；龐如利、趙衛(wèi)華對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；吳梅青、石澤延、林雨負(fù)責(zé)資料收集與整理；粟燕云、周寶文、白子文負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、論文修訂與校正；趙衛(wèi)華進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制。

本文無(wú)利益沖突。