血清miR-210、miR-181a表達水平與慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者糖皮質(zhì)激素治療效果的關(guān)系及其預測價值研究

秦克，李同林，宮帥，江美芳

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見的以氣流阻塞為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，可進展為呼吸衰竭，致死率、致殘率均較高[1]。目前COPD的治療以糖皮質(zhì)激素為主，其中吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroids，ICs）以其局部抗炎作用較強、不良反應少等特點成為主要治療藥物[2]。但相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，僅40%～50%的患者對ICs具有反應性，長期使用ICs造成的不良反應促使重癥肺炎風險增加[3]，因此識別COPD患者對ICs的反應性并采取針對性治療具有重要意義[4]。微小核糖核酸（mircoRNA，miR）是一種基因調(diào)控因子，已有多種miR被證實參與肺部炎癥的調(diào)控[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在多種炎癥性肺疾病的發(fā)生中表達異常[6]，參與免疫炎性反應過程?；A(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a對香煙提取物誘導的大鼠肺泡巨噬細胞分泌具有抑制作用[7]，提示miR-181a具有抗炎作用。本研究通過檢測COPD患者ICs治療前后血清miR-210、miR-181a水平變化，分析兩種血清指標對COPD患者治療效果的預測價值，以期為臨床COPD患者ICs治療效果的評估提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月至2020年6月就診于三六三醫(yī)院門診的COPD穩(wěn)定期患者86例。納入標準：（1）符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》[8]中COPD穩(wěn)定期的診斷標準；（2）年齡＞18歲；（3）戒煙時間超過6個月；（4）就診前3個月內(nèi)未使用過抗生素治療；（5）對本研究知情且簽署知情同意書。排除標準：（1）其他呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病者；（2）嚴重心、肝、腎等重要器官疾病者；（3）對研究中使用的藥物或成分敏感者；（4）就診前有口服糖皮質(zhì)激素治療史者。本研究符合赫爾辛基宣言中關(guān)于醫(yī)學倫理的建議（2017-01）。

1.2 方法

1.2.1 藥物洗脫 所有患者根據(jù)就診前3個月內(nèi)ICs使用情況決定是否進行藥物洗脫，有ICs使用史者予以丁胺醇吸入劑進行1周的ICs藥物洗脫，3次/d；無ICs使用史者直接進入研究。

1.2.2 治療方案與分組 所有患者治療前先進行肺功能檢查與慢性阻塞性肺疾病評估測試（COPD assessment test，CAT）[8]，藥物洗脫患者于藥物洗脫后進行?；颊呔枰圆嫉啬蔚赂Ｄ亓_粉吸入劑治療，2吸/次，2次/d，連續(xù)治療4周，同時常規(guī)使用支氣管舒張劑、祛痰藥等藥物。4周后復查肺功能與CAT評分，將肺功能分級降低≥1個級別或CAT評分降低≥2分定義為有效并歸為有效組，其余為無效并歸為無效組。

1.2.3 肺功能檢查與CAT 受試者保持端坐體位，采用肺功能儀測定用力肺活量（FVC）、吸入支氣管舒張劑后的第1秒用力呼氣容積（FEV1）及最大呼氣流量（peek expiratory flow rate，PEF）。CAT：CAT 問卷共包含 8 個問題，對每個問題做出相應評分，每個問題分數(shù)為0～5分，問卷總分為0～40分，分值越高提示疾病對患者的影響越嚴重，其中0～10分為輕微影響，11～30分為較重影響，31～40分為嚴重影響。

1.2.4 血清miR-210、miR-181a表達水平檢測 于治療前（藥物洗脫患者為藥物洗脫后）、治療4周后采集患者空腹靜脈血，離心（3 000 r/min，20 min，離心半徑為12 cm）后取上層血清，置于-80 ℃環(huán)境保存待檢。采用miR提取分離試劑盒分離血清中的miR，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)miR熒光定量檢測試劑盒配置聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系：cDNA 2 μl、PreMix 10 μl、10 μmol/l上游引物與下游引物各0.4 μl、去離子水7.2 μl，在熒光定量PCR儀上進行反應：95 ℃ 15 min、94 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s，重復 40個循環(huán)，PCR儀自動生成循環(huán)曲線后得到閾值，以U6為內(nèi)參，計算miR-210、miR-181a的表達水平。

1.3 臨床資料 收集COPD患者一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、戒煙時間、病程；分析治療前、治療4周后肺功能指標（FVC、FEV1、PEF）、CAT評分、血清miR-210及miR-181a表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用sPss 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組內(nèi)比較采取配對t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析探討血清miR-210、miR-181a表達水平與肺功能指標及CAT評分的相關(guān)性，繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線）以分析血清miR-210、miR-181a表達水平對COPD患者ICs治療效果的預測價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入COPD穩(wěn)定期患者86例，其中男58例、女28例；平均年齡（60.9±7.3）歲；平均 BMI（22.3±1.4）kg/m2；病程 2～23年，平均病程（13.2±4.3）年。戒煙時間均超過半年，平均戒煙時間（5.8±1.0）年。

2.2 治療前后COPD穩(wěn)定期患者觀察指標比較 ICs治療后COPD患者FVC、FEV1、PEF較治療前升高，CAT評分及血清miR-210、miR-181a表達水平較治療前降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 COPD患者ICs治療前后觀察指標比較（±s，n=86）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters，CAT score，and serum miR-210 and miR-181a levels before and after four-week budesonide and formoterol inhalation treatment in COPD patients

表1 COPD患者ICs治療前后觀察指標比較（±s，n=86）Table 1 Comparison of pulmonary function parameters，CAT score，and serum miR-210 and miR-181a levels before and after four-week budesonide and formoterol inhalation treatment in COPD patients

注：FVC=用力肺活量，F(xiàn)EV1=第1秒用力呼氣容積，PEF=最大呼氣流量，CAT=慢性阻塞性肺疾病評估測試，miR=微小核糖核酸

血清miR-181a表達水平治療前 2.49±0.76 1.38±0.443.61±0.93 16.33±4.10 22.01±6.17 1.38±0.47治療后 2.78±0.81 1.60±0.514.32±1.03 11.57±3.27 17.41±5.29 1.09±0.32 t值 2.421 3.029 4.745 8.417 5.249 4.730 P值 0.017 0.003 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001觀察時間FVC（L）FEV1（L）PEF（L/s）CAT評分（分）血清miR-210表達水平

2.3 ICs治療前血清miR-210、miR-181a表達水平與肺功能指標、CAT評分的相關(guān)性 ICs治療前血清miR-210、miR-181a表達水平與CAT評分呈正相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 ICs治療前血清miR-210、miR-181a表達水平與肺功能指標、CAT評分的相關(guān)性分析（n=86）Table 2 Correlations of serum miR-210 and miR-181a levels with lung function parameters and CAT score in COPD patients before four-week budesonide and formoterol inhalation

2.4 ICs治療后血清miR-210、miR-181a表達水平與肺功能指標、CAT評分的相關(guān)性 ICs治療后血清miR-210、miR-181a表達水平與FEV1呈負相關(guān)（P＜0.05），見表3。

表3 ICs治療后血清miR-210、miR-181a表達與肺功能指標、CAT評分的相關(guān)性分析（n=86）Table 3 Correlation analysis of serum miR-210 and miR-181a levels with lung function parameters and CAT score after four-week budesonide and formoterol inhalation treatment

2.5 有效組與無效組患者臨床資料比較 86例患者中共有39例（45.35%）對ICs治療有效，47例無效（54.65%）。有效組治療前與治療后的血清miR-210、miR-181a表達水平低于無效組（P＜0.05）；有效組、無效組的年齡、男性性別、BMI、病程、戒煙時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 有效組與無效組患者臨床資料比較Table 4 The clinical data in COPD patients with and without responses to four-week budesonide and formoterol inhalation treatment

2.6 治療前miR-210、miR-181a表達水平對COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果的預測價值分析 治療前miR-210、miR-181a表達水平預測COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果的ROC曲線下面積為0.807、0.844，臨界值分別為19.65、1.29，靈敏度分別為0.733、0.779，特異度分別為0.767、0.802。見表5、圖1。

表5 治療前血清miR-210、miR-181a表達水平對COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果的預測價值分析Table 5 Performance of pre-treatment serum miR-210 and miR-181a levels in predicting the treatment effect of four-week budesonide and formoterol inhalation in stable COPD patients

圖1 治療前血清miR-210、miR-181a表達水平預測COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果的ROC曲線Figure 1 ROC curve of pre-treatment serum miR-210 and miR-181a levels in predicting the treatment effect of four-week budesonide and formoterol inhalation in COPD patients

3 討論

COPD是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，具有較高的致死率和致殘率。有學者指出，COPD患者氣道、肺組織多存在由巨噬細胞等多種炎性細胞參與的慢性炎癥[9]，最顯著特征為氣流受限[10]，COPD的治療以減輕呼吸道炎癥以及改善氣流受限為主要目標[11]。COPD穩(wěn)定期患者主要選擇糖皮質(zhì)激素治療[12]，其中ICs已被廣泛應用。目前COPD患者診療指南主要根據(jù)患者急性加重史、改良呼吸困難評分、CAT評分綜合評估臨床療效，但在實際臨床工作中，ICs聯(lián)合長效β2-受體激動劑使用時較難評估ICs的治療效果，且只有部分患者對ICs治療有效[13]。而長期使用ICs治療會促使重癥肺炎的風險大幅增加[14]。因此探討有效預測ICs治療效果的標志物對于評估ICs在COPD臨床治療中的使用價值及對臨床治療方案的選擇具有重要的指導意義。已有證據(jù)表明，miR-210、miR-181a與COPD密切相關(guān)，與患者肺功能及炎性反應有明顯相關(guān)性，可反映患者病情變化，并能在一定程度上預測COPD患者的急性加重及死亡[15]。本研究主要探討了COPD穩(wěn)定期患者血清miR-210、miR-181a表達水平與ICs治療效果的關(guān)系及預測價值，旨在為臨床評估COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果提供參考依據(jù)。

糖皮質(zhì)激素因其抗炎、抗休克、免疫抑制等作用而廣泛用于多種疾病，其運用于COPD患者時可有效抑制炎性反應，減輕氣道高反應性，并可通過抑制中性粒細胞的增殖與集聚而抑制磷酸酯酶A2的生物活性、減少炎性因子合成、增加氣道平滑肌對β2-受體激動劑的反應、預防氣道重塑；同時還可降低病灶區(qū)域組織血管通透性，減少氣道炎性細胞因子與體液滲出，進而減輕氣道炎癥與阻塞等[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，治療后COPD穩(wěn)定期患者FVC、FEV1、PEF明顯升高，CAT評分及血清miR-210、miR-181a表達水平明顯降低，提示ICs治療可有效減輕氣道炎癥，改善患者肺功能。布地奈德福莫特羅粉吸入劑是臨床常用的一種糖皮質(zhì)激素，具有高效、局部抗炎作用，不僅可增強內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定性，還可有效抑制機體免疫反應，降低過敏性遞質(zhì)的活性并使其含量降低；同時還可減輕酶促反應，促使支氣管收縮物質(zhì)合成降低，最終抑制平滑肌收縮，達到治療目的。ICs作為吸入性制劑可直接作用于患者肺組織以及氣道，并具有較強的局部抗炎作用，通過直接作用于氣道黏膜，減輕氣道炎癥程度與水腫情況，具有較高的生物利用率。

本研究結(jié)果顯示，ICs治療前血清miR-210、miR-181a表達水平與CAT評分呈正相關(guān)，ICs治療后血清miR-210、miR-181a表達水平與FEV1呈負相關(guān)，提示血清miR-210、miR-181a表達水平可成為COPD穩(wěn)定期患者治療效果的衡量指標之一，對評估COPD患者治療效果有一定作用。本研究結(jié)果還顯示，86例患者中共有39例（45.35%）對ICs治療有效，47例無效（54.65%），且有效組治療前與治療后血清miR-210、miR-181a表達水平均低于無效組，說明血清miR-210、miR-181a表達水平可反映ICs治療效果，治療前血清miR-210、miR-181a表達水平越低，則ICs治療后氣流受限改善程度越大，療效越明顯。研究表明，miR-210在呼吸道疾病的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色[17]。miR在細胞內(nèi)具有重要的調(diào)節(jié)作用[14]，可通過介導靶細胞基因轉(zhuǎn)錄本的降解或抑制其翻譯影響細胞發(fā)育、增殖等過程。研究表明，miR參與了COPD的發(fā)生與進展，調(diào)控COPD炎性反應以及細胞凋亡，參與內(nèi)皮細胞、巨噬細胞的病理過程[18]，決定了COPD患者的病情嚴重程度與預后[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-210在受損的組織部位呈異常表達，其變化程度與組織損傷程度保持一致[20]，因此miR-210是判斷病情嚴重程度與預后的重要標志物之一。miR-181a是人體內(nèi)組織炎性反應應激性miR，具有多種生物學效應。既往研究證實，miR-181a在腫瘤細胞生長、免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用[21]，同時miR-181a具有炎癥調(diào)控作用，可促進腫瘤細胞增殖、遷移以及侵襲能力改變等。大鼠實驗證實，COPD大鼠中miR-181a表達量高于正常大鼠，miR-181a表達量升高參與了COPD的發(fā)生[22]。另外，miR-181a對評估患者預后具有很重要的指導意義，已廣泛用于臨床多種疾病的診斷與預后評估中[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-210、miR-181a表達水平預測COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果的ROC曲線下面積分別為0.807、0.844，靈敏度分別為0.733、0.779，特異度分別為0.767、0.802，提示血清miR-210、miR-181a表達水平對COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果有較高的預測價值。

綜上所述，ICs治療有效的COPD穩(wěn)定期患者治療前與治療后的血清miR-210、miR-181a表達水平均低于無效患者，且治療前血清miR-210、miR-181a表達水平可較好地預測COPD穩(wěn)定期患者ICs治療效果。未來可進一步挖掘更多的ICs治療效果預測標志物，并通過更多標志物的聯(lián)合檢測來提高對ICs治療效果的預測價值。

作者貢獻：秦克提出研究思路，設(shè)計研究方案，提出研究假設(shè)，負責論文起草與最終版本修訂，對文章整體負責；李同林進行研究的實施；宮帥協(xié)助研究的實施、收集入組病例、匯總基線信息；江美芳負責數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計學分析。

本文無利益沖突。