腐植酸促進(jìn)候選細(xì)菌豐富植物微生物群以抑制病原體

Maura Santos Reis de Andradeda Silva，Orlando Carlos Huertas Tavares，Thiago Gon?alves Ribeiro，Camilla Santos Reis de Andradeda Silva，Carolina Santos Reis de Andradeda Silva，3，José Maria García-Mina，Vera Lúcia Divan Baldani，Andrés Calderín García，Ricardo Luiz Louro Berbara，Ederson da Concei??o Jesus 著 李子?xùn)| 熊傳教 周 欣 余玲玲 劉可星* 譯

1 巴西農(nóng)業(yè)研究公司 巴西 23897-970

2 里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦農(nóng)村大學(xué) 巴西 23890-000

3 弗洛米嫩塞聯(lián)邦大學(xué) 巴西 24210-240

4 西班牙納瓦拉大學(xué) 西班牙 31009

5 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 廣州 510642

腐殖質(zhì)（HS）通過(guò)影響土壤物理、化學(xué)和生物特性，進(jìn)而對(duì)植物有益。HS還可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，包括改變根的厚度、長(zhǎng)度、分枝和密度，從而改變根的結(jié)構(gòu)（Canellas和Olivares，2014；García等，2016；Tavares等，2020）。但是，它的影響并不局限于根形態(tài)上的變化。腐植酸（HA）能調(diào)節(jié)激素信號(hào)通路，一些科學(xué)家認(rèn)為腐殖質(zhì)組分可以模擬生長(zhǎng)素，被細(xì)胞受體識(shí)別（Canellas等，2002）。另有研究表明（Olaetxea等，2015），HA通過(guò)脫落酸（ABA）途徑調(diào)控脅迫條件下膜水通道蛋白（PIP）的基因表達(dá)。HA也可以調(diào)節(jié)植物的氧化還原代謝，調(diào)節(jié)活性氧的濃度，刺激過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和液泡膜水通道蛋白（TIPs）的表達(dá)（García等，2016）。

通過(guò)影響植物代謝，HS還可以改變根系分泌物的分布，從而干擾根際微生物群落結(jié)構(gòu)（Puglisi等，2009，2013）。HS結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使這些物質(zhì)誘發(fā)多種代謝途徑，進(jìn)而發(fā)生與植物相關(guān)的微生物相互作用。一些研究報(bào)道了外源施用HS和促生菌的益處（Canellas等，2013；Marques Júnior等，2008；Olivares等，2015）。例如施用HA后，血清草菌（Herbaspirillum seropedicae）在玉米根產(chǎn)生特異性的生物膜并定殖（Canellas和Olivares，2017），細(xì)菌和HA共接種保護(hù)植物免受水分脅迫的不利影響（Aguiar等，2016）。HA刺激氧化代謝酶（超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和抗壞血酸過(guò)氧化物酶）活性，反過(guò)來(lái)，細(xì)菌誘導(dǎo)植物能保持相對(duì)含水量和氣孔（Aguiar等，2016）。

在文獻(xiàn)中已經(jīng)證實(shí)，植物組織中自然維系著較高的微生物多樣性（Hardoim等，2008），這些內(nèi)生微生物可以通過(guò)種子遺傳，正如在水稻的研究中已經(jīng)證明的那樣。其中，與第一代種子相關(guān)的細(xì)菌群落，有45%已經(jīng)在第二代中被發(fā)現(xiàn)（Hardoim等，2012）。這種微生物群落通過(guò)多種機(jī)制影響植物的生長(zhǎng)、健康和生存（Ⅴandenkoornhuyse等，2015；Carrión等，2019），且與植物生理的變化密切相關(guān)（Hallmann和 Berg，2006），也與環(huán)境條件密切相關(guān)（Hardoim等，2012）。盡管HA很重要，但其對(duì)這些植物相關(guān)微生物群落影響的研究鮮有報(bào)道。如上所述，這些物質(zhì)會(huì)影響植物的生理變化，我們有理由認(rèn)為它們也會(huì)影響微生物群落。

在這種情況下，我們假設(shè)HA的作用與植物相關(guān)細(xì)菌群落的調(diào)節(jié)同時(shí)發(fā)生，特別是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們將HS組分中可溶于堿性pH且在酸性介質(zhì)中沉淀的HA（Schnitzer，1978），施用于水稻苗的根部，每隔72 h向營(yíng)養(yǎng)液中添加HA，持續(xù)264 h。每間隔24 h采集植物1次，連續(xù)采樣，評(píng)估水稻發(fā)育情況。通過(guò)對(duì)240 h樣品的16S rRNA基因測(cè)序，對(duì)生長(zhǎng)量變化和根系形態(tài)變化以及細(xì)菌群落的分類(lèi)學(xué)特征進(jìn)行評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 HA的提取、純化和表征

從牛糞、蚯蚓糞中分離出HAs，并根據(jù)國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)（International Humic Substances Society，IHSS，2020）推薦的方法純化，詳情請(qǐng)參閱補(bǔ)充資料。HAs的理化性質(zhì)見(jiàn)先前報(bào)道（Tavares等，2020）。

1.2 水稻植株根系形態(tài)參數(shù)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、取樣及 評(píng)價(jià)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)（Steel和 Torrie，1980）。處理包括：2個(gè)因素水平，HA施用（有或沒(méi)有HA）和采樣時(shí)間（試驗(yàn)過(guò)程中每間隔24 h采樣1次，共采樣11次），共22個(gè)組合，每個(gè)組合6次重復(fù)，對(duì)528個(gè)試驗(yàn)樣品進(jìn)行評(píng)估。

“Piauí”水稻在光周期為12 h/12 h（光/暗）的條件下生長(zhǎng)，光合作用的光子流為480 μmol/m2s，相對(duì)濕度為70%，溫度為28 ℃/24 ℃（晝/夜）。種子用2%次氯酸鈉消毒30 min，然后用蒸餾水洗滌10次。在萌發(fā)7天后，將秧苗移栽到有容量為0.7 L霍格蘭溶液的盆中（每盆4株）（Hoagland和 Arnon，1950）。

營(yíng)養(yǎng)液中HAs施用劑量為80 mg /L，當(dāng)養(yǎng)分濃度改變時(shí)，每72 h添加80 mg/L HA到營(yíng)養(yǎng)液中，對(duì)照組不施用HAs。每24 h采集1次植株，直到移栽后264 h（共11天），并測(cè)定以下變量：根和地上部干物質(zhì)量，葉面積，根系長(zhǎng)度、表面積、體積以及根尖數(shù)量。用光電計(jì)（LI-3000，Li-Cor）測(cè)算葉面積。使用Epson Expression 10000XL系統(tǒng)掃描根部，該系統(tǒng)帶有一個(gè)額外的光單元（Turbo Pascal Unit，TPU）。參照前人的研究方法（Tavares等，2020），使用WinRhizo Arabidopsi軟件（Régent Instruments Inc.，Quebec，Canada）分析根長(zhǎng)（mm）、表面積（mm2）、體積（mm3）和根尖數(shù)量。

數(shù)據(jù)正態(tài)性和同方差性分別用Shapiro-Wilk和Bartlett進(jìn)行檢驗(yàn)。參照Steel等（1980）使用的R軟件（R Core Team，2020），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（P〈0.05）。

1.3 水稻生長(zhǎng)的定量分析

根據(jù)總干物質(zhì)量和葉面積對(duì)植株生長(zhǎng)進(jìn)行分析。使用非線(xiàn)性回歸對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整，推導(dǎo)出生長(zhǎng)率，并估算出瞬時(shí)速率值（Araújo和 Rossiello，2013）。因此，在Hunt（1982）提出的各種模型中，我們決定使用基于迭代過(guò)程的Logistic模型（Hunt，1982；Ritz等，2015）。模型的選擇是基于估計(jì)系數(shù)和決定系數(shù)（R2）的顯著性，以及被測(cè)變量的時(shí)間變化的整體趨勢(shì)（Araújo，2003；Araújo和 Rossiello，2013）。這是一個(gè)漸近模型，趨于最大值。由總干物質(zhì)量或葉面積指數(shù)的Logistics函數(shù)[公式（1）]，得到絕對(duì)生長(zhǎng)率[AGR，公式（2）]、相對(duì)生長(zhǎng)率[RGR，公式（3）]和凈同化率[NAR，公式（4）]，計(jì)算公式如下：

其中，W為觀測(cè)數(shù)據(jù)，T為施用HA后的小時(shí)數(shù)，α，β，κ是非線(xiàn)性回歸系數(shù)。選擇Logistic模型是因?yàn)楣烙?jì)系數(shù)對(duì)觀測(cè)到的R2的顯著性（R2大于70%），以及所得曲線(xiàn)合適的生物學(xué)顯著性。AGR表示單位時(shí)間內(nèi)生物量生產(chǎn)的速度，RGR表示單位已有材料的生物量生產(chǎn)的速度（Hunt，1982）。通過(guò)使用DRC軟件包的迭代過(guò)程，用數(shù)學(xué)函數(shù)處理葉面積和總干物質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)（Ritz等，2015）。

用F檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。誤差的正態(tài)性通過(guò)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Bartlett檢驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證差異的同方差性（Neter等，1974；Araujo，2003）。采用R軟件（R Core Team，2020）和ggplot2包（Wickham，2016），將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為具有F檢驗(yàn)顯著性的箱形圖。

1.4 DNA提取和16S rRNA測(cè)序

第1次施用HA 240 h后，收集施用或未施用過(guò)HA的水稻植株，用于DNA提取和16S rRNA基因測(cè)序。根據(jù)PowerPlant ?Pro DNA分離試劑盒（MO BIO）的步驟，從地上部和根部提取總DNA。DNA質(zhì)量檢測(cè)采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠凝膠進(jìn)行染色，并采用分光光度法在NanoDrop 1000中進(jìn)行DNA定量。16S rRNA基因的Ⅴ4區(qū)測(cè)序采用515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHⅤGGGTWTCTAAT）引物（Caporaso等，2012），并遵循地球微生物組項(xiàng)目的協(xié)議（http://www.earthmicrobiome.org/protocolsand-standards/16S/）。使用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）夾鉗，阻斷葉綠體和線(xiàn)粒體序列的擴(kuò)增（Fitzpatrick等，2018）。在阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室環(huán)境樣品制備和測(cè)序設(shè)備MiSeq測(cè)序機(jī)上進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列分析

使用CASAⅤA v.1.8（Illumina）將基因文庫(kù)多路解編，將其存放在基因庫(kù)序列讀取檔案中，編號(hào)為SAMN5464651至SAMN5464666（補(bǔ)充表1）。序列分析使用了開(kāi)源軟件Mothur v.1.41.1（Schloss等，2009），并按照MiSeq 標(biāo)準(zhǔn)操作程序指南進(jìn)行（https://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP）。正向序列和反向序列組裝，共產(chǎn)生288780個(gè)讀取量，范圍在247～502個(gè)堿基對(duì)之間，平均庫(kù)容量為16043個(gè)讀取量。去除不明確的序列，大于257 bp的序列，以及含有8個(gè)以上均聚物的序列。這些步驟之后，總共保留了245783個(gè)序列。將其劃分為29572個(gè)獨(dú)特序列，采用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置的全局比對(duì)方法（Needleman和 Wunsch，1970）與參考數(shù)據(jù)庫(kù)（SILⅤA bacterial release 132（Quast等，2012；Yilmaz等，2014） 的Ⅴ4區(qū)進(jìn)行比對(duì)。對(duì)比序列使用pre.cluster（差異=2）程序進(jìn)行分組，并使用UCHIME軟件檢查嵌合體（Edgar等，2011），然后將嵌合體移除。使用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目分類(lèi)器工具（Cole等，2009）對(duì)操作分類(lèi)單元（OTUs）分類(lèi)，引導(dǎo)程序?yàn)?0%。去除未知OTUs和真核生物、古生菌、線(xiàn)粒體、葉綠體。采用97%相似度（切值cutoff=0.03）的平均近鄰算法對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi)，使序列能在屬水平上進(jìn)行分類(lèi)（Comeau等，2011）。

將文件導(dǎo)入R軟件（R Core Team，2020），并使用軟件包phyloseq（McMurdie和 Holmes，2013）、stringr（Wickham，2016）、vegan（Oksanen等，2020）、DESeq2（Love等，2014）、factoextra（Kassambara和 Mundt，2020）、ggpubr（Kassambara，2020）和ggplot2（Wickham，2016）進(jìn)行分析。首先，在OTU和門(mén)水平上，用OTU數(shù)據(jù)計(jì)算相關(guān)矩陣并進(jìn)行主成分分析（PCA）（Legendre和 Legendre，1998）。在vegan軟件包中，這種排序方法是基于除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DCA）測(cè)量生態(tài)梯度的長(zhǎng)度來(lái)選擇的（Ter Braak和 Prentice，1988），利用decorana函數(shù)對(duì)稀有物種減量進(jìn)行計(jì)算。使用相關(guān)矩陣來(lái)避免非常豐富的OTU主導(dǎo)分析。采用k-means方法鑒定樣本組（Legendre和 Legendre，1998），通過(guò)999排列相似性分析（ANOSIM）評(píng)估各組的顯著性（P〈0.05）（Clarke，1993；Warton等，2012）。此外，將相同的數(shù)據(jù)通過(guò)Euclidean距離和Ward算法進(jìn)行分層聚類(lèi)分析，目的是進(jìn)一步確認(rèn)群落是如何根據(jù)其分類(lèi)學(xué)組成進(jìn)行分組的。

利用軟件包DESeq2的負(fù)二項(xiàng)分布差異基因表達(dá)分析（Love等，2014），鑒定了在HA處理植物中豐度差異富集或減少的細(xì)菌屬。DESeq2估算計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的方差-均值相關(guān)性，并基于使用負(fù)二項(xiàng)分布的模型測(cè)試其差異豐度。這種方法最初是為了識(shí)別RNA測(cè)序分析中的差異表達(dá)基因而開(kāi)發(fā)的，同時(shí)也被用于識(shí)別宏基因組分析計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的差異。當(dāng)顯著時(shí)調(diào)整的P值小于1%（P〈0.01），被認(rèn)為是差異豐富的類(lèi)群。箱形圖顯示了受顯著影響的類(lèi)群的豐度。建立柱狀圖，用來(lái)顯示植物門(mén)和屬的豐度變化，未發(fā)現(xiàn)豐度〈2%的類(lèi)群。

使用R軟件包SpiecEasi（Kurtz等，2021）、igraph（Csardi等，2006）和microeco（Liu等，2021）對(duì)每個(gè)處理進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，OTUs之間的相關(guān)性由Sparcc算法推導(dǎo)（Friedman 和 Alm，2012）。通過(guò)100次重復(fù)計(jì)算相關(guān)顯著性，網(wǎng)絡(luò)中僅顯示大于0.6或小于-0.6（P〈0.01）的統(tǒng)計(jì)上顯著的相關(guān)性。使用Gephi軟件（Bastian等，2009）在Fruchterman-Reingold設(shè)計(jì)（Fruchterman等，1991）中繪制網(wǎng)絡(luò)圖，并在同一程序中計(jì)算其特性。

2 結(jié)果

2.1 HA對(duì)水稻干物質(zhì)量、根系生長(zhǎng)和發(fā)育的影響

HA對(duì)根和地上部干物質(zhì)量累積的影響在整個(gè)評(píng)估階段有所不同。第1次施用HA 24 h后，根干物質(zhì)量降低，48 h后恢復(fù)。在施用HA 144和216 h后，根干物質(zhì)量增加（P〈0.001）（圖1a）。地上部干物質(zhì)量也有類(lèi)似的變化，在施用HA 144和264 h后顯著增加（P〈0.001）（圖1b）。

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中觀察到干物質(zhì)量累積的變化，NAR、AGR和RGR的結(jié)果顯示出HA對(duì)植物生長(zhǎng)的正效應(yīng)（圖1e、圖1c、圖1d）。在2個(gè)處理中，根據(jù)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整后的Logistic模型系數(shù)極其顯著（P〈0.001）（表1）?？偢晌镔|(zhì)量的R2值在0.92～0.93之間，葉面積指數(shù)的R2值在0.90～0.92之間，始終較高，與原始數(shù)據(jù)吻合。NAR隨著HA的施用而增加（圖1e），表明HA對(duì)光合代謝成分有刺激作用。HA處理的結(jié)果表明，100 h時(shí)AGR和RGR增加，并一直保持到試驗(yàn)結(jié)束（圖1c、圖1d）。

表1 用3參數(shù)對(duì)施用或不施用腐植酸處理的“Piaui”品種水稻植株總干物質(zhì)量（TDW）和葉面積指數(shù)（LAI）進(jìn)行Logistics回歸調(diào)整的決定系數(shù)（R2）、估計(jì)系數(shù)（α、β、κ）和概率（P值）Tab.1 Determination coefficient (R2 ), estimated coefficients (α, β, κ) and probabilities (p-value) of the logistic type regression adjustments with 3 parameters for total dry weight (TDW) and leaf area index (LAI) of the plants of rice var. Piaui treated with and without humic acid

施用HA顯著增加了根干物質(zhì)量，根系長(zhǎng)度、表面積和體積（圖1a和圖2a、圖2b、圖2c），這些響應(yīng)隨測(cè)定時(shí)間不同而變化，但所有這些結(jié)果都指出了施用HA后水稻根系的形態(tài)變化和生長(zhǎng)刺激。48 h后和整個(gè)試驗(yàn)剩余時(shí)間里，根系體積顯著增加（圖2c），而在144 h后才觀察到HA對(duì)根干物質(zhì)量的影響（圖1a），根系長(zhǎng)度和表面積分別在216 h和192 h后顯著增加（圖2a，圖2b）。根尖數(shù)量除了第1次施用144 h出現(xiàn)了不利影響（P〈0.001）外，其余影響并不顯著（圖2d）。

2.2 HA作用下水稻植株共生細(xì)菌群落的變化

第1次施用HA 240 h后，收集施用和未施用HA的水稻植株，用于DNA提取和16S rRNA基因測(cè)序。利用PCA，將植物相關(guān)的細(xì)菌群落分為3大類(lèi)：一是經(jīng)過(guò)HA處理的根部細(xì)菌群落；二是沒(méi)有施用HA的根部細(xì)菌群落；三是在地上部形成的細(xì)菌群落（圖3）。這種劃分在OTU（圖3a）和門(mén)水平（圖3c）都可以觀察到，與PCA相似的DCA結(jié)果同樣支持這一劃分（補(bǔ)充圖1）。DCA的結(jié)果顯示，在根部細(xì)菌群落中，基于植物單元（根部與地上部）的細(xì)菌群落與經(jīng)HA處理的群落之間存在區(qū)別，有更高的變異性，這與地上部相關(guān)的群落具有更高的多樣性和組成變異性是一致的（圖4）。這些結(jié)果得到了聚類(lèi)分析（k-means或分層聚類(lèi)）（圖3b、圖3c）和相似性分析（ANOSIM）的支持。ANOSIM分析表明，根部細(xì)菌群落與地上部細(xì)菌群落差異顯著（R=1，P=0.001），經(jīng)HA處理的也類(lèi)似（R=0.7526，P〈0.001）。雖然這些分析表明，施用與不施用HA的地上部相關(guān)群落之間沒(méi)有明顯不同，但在門(mén)和屬水平上，某些類(lèi)群的豐度存在差異，這有待進(jìn)一步討論。在地上部細(xì)菌群落的多樣性更豐富，從門(mén)和屬的數(shù)量較多這一點(diǎn)可以看出（圖4和補(bǔ)充圖2、圖3）。

圖1 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻的根（a）和地上部（b）干物質(zhì)量以及絕對(duì)生長(zhǎng)率（c）、相對(duì)生長(zhǎng)率（d）和凈同化率（e）Fig.1 Root (a) and shoot (b) dry weight, absolute growth (c), and relative growth (d) rates and variations in the net assimilation (e) of rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖2 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻根系的長(zhǎng)度（a）、表面積（b）、體積（c）和根尖數(shù)量（d）Fig.2 Root length (a), area (b), volume (c), and the number of tips (d) of rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖3 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻根部植株間的細(xì)菌群落差異Fig.3 Bacterial communities differed between rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖4 根部和地上部中按門(mén)和屬分類(lèi)的類(lèi)群相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of taxa in roots and shoot classified at phylum and genus levels

圖4 續(xù)

通過(guò)宏基因組分類(lèi)方法，可以區(qū)分施用與不施用HA植物共生細(xì)菌群落的微生物類(lèi)群，同時(shí)，可以區(qū)分這些微生物類(lèi)群對(duì)植物生長(zhǎng)的刺激。細(xì)菌群落的響應(yīng)是：地上部變形菌門(mén)（Proteobacteria）豐度增加，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）豐度減少（圖4a）。相反地，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）在根部豐度增加。放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）在兩個(gè)植株部位中豐度減少。根瘤菌屬（Rhizobium）是最豐富的屬（圖4b），主要存在于根部，它構(gòu)成了50%以上的序列。與我們的預(yù)期相反，已被報(bào)道可促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌，如賴(lài)氏菌屬（Leifsonia）、硝銨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和羅河桿菌屬（Rhodanobacter）的豐度在HA處理的根部減少（圖4a和圖5a、圖5b、圖5c）。相應(yīng)地，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的豐度增加，尤其是粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）和噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）（圖4和圖5d、圖5e、圖5f、圖5g），這種增加通過(guò)DESeq分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果得到驗(yàn)證（補(bǔ)充表1）。假單胞菌（Pseudomonas）和 酸 桿 菌 門(mén)（Acidobacteria）的一組代表菌（Gp 1）也富集，但豐度較低（圖5h、圖5i）。雖然PCA分析結(jié)果沒(méi)有顯示出不同群落之間的明顯差異，但在某些屬的豐度上，仍然可以觀察到一些不同。例如，在HA處理的地上部，粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）、泛菌屬（Pantoea）、潘多拉菌屬（Pandoraea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和馬賽菌屬（Massilia）的豐度降低（圖5和補(bǔ)充圖4）。

圖5 在施用腐植酸（HA）的根中，其豐度不同程度減少（a、b和c）或富集（d至i）的主要類(lèi)群Fig.5 Major taxa whose abundance were differently decreased (a, b, and c) or enriched (d through i) in roots that received humic acids (HA)

最后，用網(wǎng)絡(luò)分析來(lái)研究HA的施用如何影響細(xì)菌群落成員之間的相互作用。與對(duì)照植株相比，經(jīng)HA處理植株的根部細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)有更多的節(jié)點(diǎn)和連接，且正連接比例較大（圖6a，圖6b和表2）。該網(wǎng)絡(luò)模塊化更少，每個(gè)節(jié)點(diǎn)（平均度）的連接數(shù)量更大，路徑長(zhǎng)度更短，表明群落成員之間的連接性更高（表2）。經(jīng)DESeq分析鑒定不同豐度的一些屬，分別是粘液桿菌屬（Mucilaginibacter），新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium），Gp 1，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和一種未鑒定的鞘脂桿菌科Sphingobacteriaceae（補(bǔ)充表3），同樣屬于HA處理植株根部細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的10大中心類(lèi)群。

與對(duì)照相比，HA處理的地上部細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和連接較少，負(fù)邊比例較大（圖6c、圖6d和表2）。盡管如此，前者顯示每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)略多，路徑長(zhǎng)度更短，表明群落成員之間的連接程度更高（表2）。

表2 施用與不施用腐植酸植株根部和地上部細(xì)菌的網(wǎng)絡(luò)屬性Tab.2 Attributes of bacterial networks in the roots and shoot of plants treated or not with humic acids

圖6 續(xù)

圖6 施用（a）和不施用（b）HA處理的植株根部，施用（c）和不施用（d）HA處理植株地上部的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Bacterial networks in plant roots of HA-treated (a) and no HA-treated (b), and plant shoots of HA-treated (c) and no-HA-treated (d)

3 討論

在本研究中，我們?cè)u(píng)估了HA對(duì)水稻生長(zhǎng)和根系形態(tài)的影響，并鑒定了在該條件下篩選出的細(xì)菌類(lèi)群。結(jié)果表明，HA與植物相關(guān)的微生物群之間具有協(xié)同作用，它們都可以調(diào)節(jié)植物的生理過(guò)程，從而對(duì)植物有益（Canellas 和 Olivares，2014；Hallmann 和 Berg，2006）。HA的有益作用可能來(lái)自于其對(duì)植物代謝的直接作用，或通過(guò)對(duì)植物微生物群的刺激。根系體積受到顯著影響，其他幾個(gè)生長(zhǎng)變量在植物生長(zhǎng)周期的不同時(shí)間受到刺激。HA對(duì)植物生長(zhǎng)的正影響主要表現(xiàn)為AGR、RGR和NAR的顯著提高（圖1c、圖1d、圖1e和表1）。NAR表示每單位總?cè)~面積的干物質(zhì)產(chǎn)生率，用于衡量植物的光合效率（Hunt，2017）；RGR是每單位現(xiàn)有干物質(zhì)量累計(jì)新干物質(zhì)量的速率，代表植物生產(chǎn)新干物質(zhì)的效率（Lowry和 Smith，2018）；AGR表示干物質(zhì)量隨時(shí)間的累積，本試驗(yàn)AGR值越高表明植物生長(zhǎng)過(guò)程中干物質(zhì)量增加越快，在100 h后始終較高，直到試驗(yàn)結(jié)束。

較高的生長(zhǎng)率與較高的干物質(zhì)量生產(chǎn)效率有關(guān)，說(shuō)明光合效率和養(yǎng)分吸收提高，與我們的數(shù)據(jù)一致。其他研究報(bào)告認(rèn)為HA可以促進(jìn)光合作用（Jannin等，2012；Nardi等，2002），也有關(guān)于HS刺激植物主要代謝不同組分的影響報(bào)道，包括葉綠素a和b的活性（Yang等，2004）以及碳代謝不同組分的活性，主要是與酶刺激（Nardi等，2007），碳水化合物的產(chǎn)生（Merlo等，1991）和能量代謝基因的表達(dá)（Trevisan等，2011）有關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)，施用HA可顯著提高油菜根系的液態(tài)光合速率、單個(gè)細(xì)胞葉綠體數(shù)量和淀粉粒數(shù)量，這些效應(yīng)與C、N、S同化量的增加一致（Jannin等，2012）。這些研究者還記錄了HA誘導(dǎo)的根生長(zhǎng)，在我們的工作中也觀察到了這一過(guò)程。應(yīng)用時(shí)間評(píng)估方法，我們觀察到根和植物干物質(zhì)量的增量隨觀測(cè)時(shí)間的變化而變化（圖1和圖2），以每天的取樣來(lái)評(píng)估這些參數(shù)的研究報(bào)道不多。然而，HA對(duì)根生長(zhǎng)發(fā)育的刺激作用已有研究（Canellas等，2002；García等，2016；Mora等，2012；Zandonadi等，2010）報(bào)道過(guò)。

宏基因組分類(lèi)分析表明，植物相關(guān)細(xì)菌群落對(duì)HA的施用有響應(yīng)。水培條件下，2種處理的地上部細(xì)菌群落多樣性均高于根部。HA的施用導(dǎo)致了根部群落的顯著變化，而在地上部的影響較?。▓D3）。主要的變化是根部擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）的豐度增加，地上部變形菌門(mén)（Proteobacteria）的豐度增加而擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的豐度減少。根瘤菌屬（Rhizobium）是豆科植物中最豐富的一個(gè)屬，特別是在根部。有研究報(bào)道了該屬存在于苜蓿（一種豆科植物）中，且不僅局限于根瘤，也可以在整個(gè)植株中發(fā)現(xiàn)（Sturz等，1997）。這些研究者還發(fā)現(xiàn)，葉部的細(xì)菌多樣性更高，與我們的觀察結(jié)果一致。該屬能夠在水稻上定殖（Hahn等，2016；Rosenblueth等，2018；Yanni等，1997），并被報(bào)道單獨(dú)接種或與巴西偶氮螺旋菌（Azospirillum brasilense）混合接種可促進(jìn)水稻生長(zhǎng)（Hahn等，2016）。

施用HA后，根部豐度最高的屬為噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）和粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）（圖3c、圖4d、圖4e）。這2個(gè)屬都有產(chǎn)生一系列水解酶的成員，如葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，還有參與復(fù)合多糖的降解，例如真菌、卵菌和線(xiàn)蟲(chóng)卵細(xì)胞壁中的多糖（Carrion等，2019；Ramamoorthy等，2001；Sharma等，2020；Yoon等，2012）。施用一種誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病（Nicot等，2016）并與抑制病原體的植物（Dai等，2020）有關(guān)的化合物后，根際土壤中鑒定出這些相同的屬。此外，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）對(duì)甜菜根的入侵，刺激了在抑病土壤種植植物中的噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）成員富集（Carrion等，2019），這組成員對(duì)脫分支酶和與真菌細(xì)胞壁降解相關(guān)的酶庫(kù)有貢獻(xiàn)。結(jié)合其他機(jī)制（如鐵載體的產(chǎn)生），這些功能特征可以從內(nèi)到外給植物提供保護(hù)。

假單胞菌屬（Pseudomonas）和放線(xiàn)菌Gp 1（Actinobacteria Gp 1）也在施用HA處理的根部被刺激，盡管它們的豐度比噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）和粘液桿菌屬（Mucilaginibacte）的豐度低10～20倍。假單胞菌屬（Pseudomonas）被廣泛認(rèn)為是一種促進(jìn)植物生長(zhǎng)的細(xì)菌，它通常與植物病原體的控制有關(guān)（Ramamoorthy等，2001）。除了誘導(dǎo)植物防御的直接作用外，來(lái)自該屬的細(xì)菌還能合成多種抗菌化合物和水解酶，能夠降解真菌細(xì)胞壁的成分（Ramamoorthy等，2001；Wang等，2019）。放線(xiàn)菌Gp1（Actinobacteria Gp1）被認(rèn)為是通過(guò)idol-3-乙酸和鐵載體產(chǎn)生等機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Kielak et等，2016）。我們強(qiáng)調(diào)的第二種機(jī)制也被報(bào)道為一種參與抑制植物病原體的機(jī)制（Kloepper等，1980）。總而言之，這些特性引起了人們對(duì)施用HA處理的植物中篩選出的細(xì)菌群落，可能在保護(hù)植物免受病原體侵襲方面的關(guān)注。

根部的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)在施用HA后，群落成員之間的連接性更高，這表現(xiàn)在它們的節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)量增加（圖6和表2）。一些正向的和反向的關(guān)鍵類(lèi)群被鑒定為屬于那些不同豐度的類(lèi)群，如粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）、鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）和放線(xiàn)菌Gp1（Actinobacteria Gp 1），進(jìn)一步說(shuō)明它們可能與施用HA處理的植株根部細(xì)菌群落有關(guān)，其中還包括被認(rèn)為能夠產(chǎn)生II型多酮（Klein等，2020）的纖線(xiàn)桿菌屬（Ktedonobacter）和前面已討論的在所有處理和2個(gè)植物部位均發(fā)現(xiàn)的根瘤菌屬（Rhizobium）。

近年來(lái)的研究表明，抑病土壤根際群落是植物防御的第一道防線(xiàn)（Mendes等，2011），當(dāng)這一屏障被打破時(shí)，病原體需要面對(duì)由植物誘導(dǎo)而產(chǎn)生的防御機(jī)制（Jones和Dangl，2006）。入侵和進(jìn)入植物組織后，菌群的調(diào)節(jié)可以作為另一個(gè)保護(hù)層，為抵御感染進(jìn)程的第三道防線(xiàn)（Carrion等，2019）。這方面的最新研究發(fā)現(xiàn)，在接種病原體的抑菌土壤種植的甜菜中，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）均有富集，特別是第二家族的成員對(duì)脫支酶和真菌細(xì)胞壁降解的相關(guān)酶有貢獻(xiàn)。值得注意的是，在施用HA處理后，相似的菌群增加。

這是我們第1次注意到，HAs可能在刺激植物相關(guān)的細(xì)菌群落成員中發(fā)揮作用，從而保護(hù)植物免受病原體的侵襲。鑒于這些結(jié)果，我們認(rèn)為植物組建這些微生物是為了應(yīng)對(duì)HA-根相互作用引起的脅迫（Berbara和 García，2014；García等，2016）。當(dāng)HA被施用于植物根部，HA組分在根表面凝聚，造成輕微和短暫的脅迫，在此基礎(chǔ)上，植物通過(guò)活性氧調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)植物進(jìn)入保護(hù)非生物脅迫的生理狀態(tài)（Berbara和 García，2014；García等，2016）。這種脅迫可能是刺激植物群落組成變化和潛在參與植物防御的細(xì)菌富集的機(jī)制之一。此前的研究也表明，細(xì)菌和HA的共同應(yīng)用提高了大豆植株對(duì)水分脅迫的恢復(fù)能力，進(jìn)一步支持了我們的假設(shè)（Olivares等，2017）。這些類(lèi)似研究的作者報(bào)告了在水分限制條件下，不同的甘蔗在使用細(xì)菌、HAs和兩者混合物時(shí)的反應(yīng)，復(fù)水處理后，只有HA處理的植株超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶等抗氧化酶活性仍較高。研究還指出了HS在植物對(duì)生物制劑抗性中的作用，以及對(duì)植物次生防御代謝的影響（Abdel-Monaim等，2011；Polak和Pospisil，1995）。HA處理的植株表現(xiàn)出較高的苯丙氨酸（酪氨酸）解氨酶（PAL/TAL；EC 4.3.1.5），它是1種催化酚類(lèi)化合物生物合成第1步的酶（Canellas等，2013；Schiavon等，2010），是1種次生代謝產(chǎn)物，保護(hù)植物免受各種生物和非生物脅迫（Dixon和Paiva，1995）。有研究指出，HAs對(duì)苯丙素代謝的影響與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)、共純化的真菌誘導(dǎo)子以及這些物質(zhì)的其他信號(hào)分子有關(guān)（Schiavon等，2010）。

將植物暴露于HA引起的假脅迫，可以使植物更有效地耐受未來(lái)的脅迫條件，特別是生物脅迫。這種效應(yīng)被稱(chēng)為“啟動(dòng)”效應(yīng)，已經(jīng)在先前施用過(guò)HA的玉米幼芽中觀察到（Canellas等，2020）。體外使用不同來(lái)源的HS，特別是堆肥中的HS，對(duì)真菌植物病原體具有抑制作用（Loffredo等，2008）。木霉（Trichoderma）是1種生物防治微生物，能夠抑制土傳植物病原真菌（Inbar等，1996）。相反，同樣的處理刺激木霉菌的生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，植物代謝和有益微生物的共同作用具有抑制疾病的潛力，而施用HAs后，富集了這些微生物。

我們總結(jié)得出，HA的施用可以促進(jìn)水稻根系生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)也改變了水稻細(xì)菌群落的組成。同時(shí)，我們還認(rèn)為，HA可以激發(fā)微生物的富集，并有可能作用于植物的生長(zhǎng)和植物對(duì)病原體的防御。這些結(jié)果在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，并提出了先前開(kāi)放式的問(wèn)題，例如需要找到方法來(lái)闡明HA對(duì)植物生理和植物微生物群落參與的真正作用。我們的研究結(jié)果或許可以認(rèn)為，使用HA作為策略的一部分，通過(guò)刺激植物的防御代謝包括組建抑制病原體的微生物來(lái)應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫。

4 附錄A 補(bǔ)充數(shù)據(jù)

本文的補(bǔ)充數(shù)據(jù)可在此網(wǎng)頁(yè)查閱：https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2021.104146。

致謝和參考文獻(xiàn)（略）