氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌采后生理生化及品質(zhì)的影響*

張沙沙，周 锫，羅曉莉，胡小松，張微思，孫達(dá)鋒**

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），屬牛肝菌科（Boletaceae） 蘭茂牛肝菌屬（Lanmaoa），俗稱“見手青”“紅蔥”，盛產(chǎn)于貴州、云南等地[1-2]，受當(dāng)?shù)厝讼矏?，但至今不能人工栽培。蘭茂牛肝菌不僅味道奇鮮，營養(yǎng)也非常豐富，其蛋白質(zhì)含量為56.0 g·100-1g-1（干質(zhì)量），氨基酸總量為33.40 g·100-1g-1（干質(zhì)量），是優(yōu)質(zhì)蛋白源[3]。另外還含有維生素、礦物質(zhì)、多糖、萜類等成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎等功效[4]。新鮮的蘭茂牛肝菌質(zhì)地脆嫩、含水量高，表面無保護(hù)結(jié)構(gòu)，采后呼吸作用等代謝活動(dòng)，會(huì)造成其水分和營養(yǎng)物質(zhì)流失，引起子實(shí)體褐變、軟化、腐爛，失去食用價(jià)值和商品價(jià)值。

目前，生產(chǎn)上常用的蘭茂牛肝菌保鮮技術(shù)主要是低溫保鮮。雖然成本較低，但是效果不理想，因此需要研究開發(fā)一種新的保鮮技術(shù)延長蘭茂牛肝菌保鮮期。氣調(diào)保鮮技術(shù)是通過在低溫條件下控制貯藏環(huán)境內(nèi)的氣體比例以達(dá)到保鮮的目的。根據(jù)氣調(diào)條件的產(chǎn)生方式，分為自發(fā)氣調(diào)和人工機(jī)械氣調(diào)2種；自發(fā)氣調(diào)在食用菌保鮮中應(yīng)用較多，但氣體比例不好控制[5-6]。通過人工氣調(diào)可確定貯藏環(huán)境內(nèi)的氣體參數(shù)，提高保鮮效果。人工機(jī)械氣調(diào)成本較高，目前國內(nèi)僅應(yīng)用于梨、獼猴桃等果蔬的保鮮[7-8]，能夠延緩果實(shí)的衰敗，達(dá)到較好的保鮮效果。

因此，以蘭茂牛肝菌為原料，對比研究低溫貯藏和氣調(diào)貯藏保鮮技術(shù)對蘭茂牛肝菌生理生化和品質(zhì)的影響，以期為氣調(diào)貯藏保鮮技術(shù)應(yīng)用于蘭茂牛肝菌的貯藏提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

新鮮蘭茂牛肝菌采集于云南省玉溪市哀牢山，用泡沫箱加冰袋24 h內(nèi)運(yùn)回中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、兒茶酚、過氧化氫、愈創(chuàng)木酚等試劑為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

T-214電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YGVA（定制型）氣調(diào)試驗(yàn)箱，北京陽光億事達(dá)科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LX-C型硬度計(jì)，溫州市海寶儀器有限公司；YX-306B型呼吸強(qiáng)度測定儀，北京宇翔電子應(yīng)用技術(shù)有限公司；2010型酶標(biāo)儀，安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司；D2KW-S-8恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療有限公司；HR/T20MM低溫冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 樣品處理

挑選12 kg五成熟、無機(jī)械損傷、蟲害較輕的蘭茂牛肝菌，去除雜質(zhì)后，在真空預(yù)冷機(jī)中預(yù)冷10 min，最終壓力為500 Pa，子實(shí)體中心溫度為4℃，去除田間熱。參考張燕等[9-10]的氣調(diào)保鮮參數(shù)，在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行修改。試驗(yàn)分成2組，每組5 kg，分別裝入PE保鮮袋中。貯藏溫度為（5±0.5） ℃、濕度為90%。對照組（CK）：恒溫恒濕箱；試驗(yàn)組（EG）：氣體成分為體積分?jǐn)?shù)分別為6%的O2和10%的CO2的氣調(diào)箱，每6天隨機(jī)取樣檢測。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 感官質(zhì)量評價(jià)

參照參考文獻(xiàn)[11]的方法，感官質(zhì)量評價(jià)由7位經(jīng)過訓(xùn)練的評價(jià)員對新鮮蘭茂牛肝菌的色澤、形態(tài)、質(zhì)地、氣味等指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 蘭茂牛肝菌感官質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory quality evaluation standard of Lanmaoa asiatica

1.3.2 失重率

測定蘭茂牛肝菌貯藏前后的質(zhì)量，每份樣品約600 g，重復(fù)3次，失重率（G，%） 的計(jì)算公式為：

式中：W1為貯前鮮質(zhì)量（g）；W2為貯后鮮質(zhì)量（g）。

1.3.3 硬度

將硬度計(jì)垂直于子實(shí)體表面，分別測定菌蓋和菌柄的硬度值，每個(gè)處理挑選3朵蘭茂牛肝菌，每朵蘭茂牛肝菌各測7個(gè)不同位置的硬度值，取平均值。

1.3.4 呼吸強(qiáng)度

采用呼吸強(qiáng)度測定儀測定蘭茂牛肝菌的呼吸強(qiáng)度（R，mg·kg-1h-1），計(jì)算公式為：

式中：△PPM為測定前后CO2的體積濃度差值（mg·m-3）；V為呼吸室內(nèi)氣體體積（m3）；W為樣品質(zhì)量（kg）；t為呼吸時(shí)間 （h）。

1.3.5 抗壞血酸、丙二醛含量和過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性測定

抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 含量的測定參照參考文獻(xiàn)[12]。取4 g鮮樣，加入少量石英砂和50 mL質(zhì)量濃度為0.05 mol·L-1、pH 7.0的磷酸緩沖溶液，冰浴研磨，4℃、8 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶提取液。4℃保存?zhèn)溆茫糜诿富钚缘臏y定。過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO） 的活性測定參照參考文獻(xiàn)[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 2010進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響

新鮮的蘭茂牛肝菌菌蓋和菌褶均比較亮麗，形態(tài)飽滿，質(zhì)地硬，有濃郁的香氣，隨著貯藏時(shí)間的延長，蘭茂牛肝菌逐漸出現(xiàn)異味、褐變、失水、軟爛等現(xiàn)象，從而失去商品價(jià)值和食用價(jià)值。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響結(jié)果見圖1。

圖1 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌感官評分的影響Fig.1 Effect of modified atmosphere storage on sensory score of Lanmaoa asiatica

由圖1可知，對照組和試驗(yàn)組的蘭茂牛肝菌隨著貯藏時(shí)間的延長，感官評分逐漸下降；對照組下降較快，不到13 d已失去食用價(jià)值，即不再檢測相關(guān)數(shù)據(jù)；試驗(yàn)組感官評分極顯著高于對照組（P＜0.01）。氣調(diào)保鮮貯藏延長了蘭茂牛肝菌保鮮期10天以上。

2.2 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響

水分是食用菌維持生理活動(dòng)和新鮮品質(zhì)的必要條件，食用菌失水會(huì)導(dǎo)致食用菌萎蔫，失去商品價(jià)值。蒸騰作用和呼吸作用是造成蘭茂牛肝菌在貯藏過程中嚴(yán)重失重的原因，其中蒸騰作用導(dǎo)致其失水，呼吸作用導(dǎo)致其損失干物質(zhì)[14]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌失重率的影響Fig.2 Effect of modified atmosphere storage on weight loss of Lanmaoa asiatica

由圖2可知，對照組蘭茂牛肝菌在貯藏期間失水比較嚴(yán)重，失重率極顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.01）。貯藏第7天時(shí)試驗(yàn)組的失重率為對照組的25.86%，說明氣調(diào)貯藏可以降低蘭茂牛肝菌失重率；試驗(yàn)組貯藏7天后失重嚴(yán)重。

2.3 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強(qiáng)度的影響

食用菌采收后仍然進(jìn)行著一系列生命活動(dòng)，如呼吸作用等。呼吸強(qiáng)度可代表營養(yǎng)物質(zhì)消耗的快慢，是食用菌采后生理研究中最要的指標(biāo)之一。蘭茂牛肝菌屬于呼吸躍變型食用菌，呼吸過程分為3個(gè)階段：前期、高峰期及后期。前期是品質(zhì)提高階段，后期品質(zhì)劣變，開始衰老，抗性降低。因此食用菌貯藏保鮮過程中延遲呼吸峰的出現(xiàn)非常重要。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強(qiáng)度的影響見圖3。

圖3 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌呼吸強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of modified atmosphere storage on respiratory intensity of Lanmaoa asiatica

由圖3可知，對照組呼吸峰出現(xiàn)在貯藏的第1天至第7天之間，由于測定時(shí)間間隔較長，錯(cuò)過了對照組呼吸峰值；試驗(yàn)組呼吸峰在貯藏第7天左右出現(xiàn)；對照組與試驗(yàn)組呼吸強(qiáng)度差異性顯著（P＜0.05）。氣調(diào)貯藏能夠延遲蘭茂牛肝菌呼吸峰的出現(xiàn)。

2.4 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌硬度的影響

食用菌采后貯藏期間的生理活動(dòng)會(huì)造成子實(shí)體營養(yǎng)成分的降解及水分喪失，導(dǎo)致表面皺縮，硬度下降。硬度可真實(shí)反映蘭茂牛肝菌的脆度及衰敗程度[15]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌硬度的影響結(jié)果見圖4。

圖4 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌菌蓋（A）和菌柄（B） 硬度的影響Fig.4 Effect of modified atmosphere storage on the hardness of pileus(A)and stipe(B)of Lanmaoa asiatica

由圖4可知，對照組前7天硬度下降較快，而試驗(yàn)組從第7天開始硬度下降較快，且比對照組的硬度下降更緩慢。試驗(yàn)組和對照組菌蓋硬度差異顯著（P＜0.05），對照組菌蓋硬度為試驗(yàn)組的76.43%；貯藏第7天時(shí)對照組與試驗(yàn)組的菌柄硬度差異不顯著（P＞0.05），直至第13天時(shí)硬度差異顯著（P＜0.05），說明氣調(diào)貯藏有利于蘭茂牛肝菌硬度的保持。

2.5 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌抗壞血酸含量的影響

抗壞血酸（ASA） 是蘭茂牛肝菌子實(shí)體內(nèi)源物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抗褐變能力，在運(yùn)輸貯藏過程中容易被氧化分解[16]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌抗壞血酸含量的影響結(jié)果見圖5。

由圖5可知，對照組蘭茂牛肝菌的ASA含量逐漸增加；試驗(yàn)組蘭茂牛肝菌的ASA含量在貯藏第1天～第19天均逐漸增加，19 d后開始下降；2組ASA含量差異性顯著（P＜0.05）。這可能是因?yàn)樘m茂牛肝菌在貯藏過程中存在后熟現(xiàn)象，蘭茂牛肝菌在貯藏過程中因進(jìn)一步成熟使ASA繼續(xù)合成而上升，后期由于衰老導(dǎo)致其含量逐漸下降。因此，氣調(diào)貯藏延緩了蘭茂牛肝菌子實(shí)體ASA含量峰值的出現(xiàn)時(shí)間，可有效保持蘭茂牛肝菌子實(shí)體的抗氧化能力。

圖5 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌ASA含量的影響Fig.5 Effect of modified atmosphere storage on ASA content of Lanmaoa asiatica

2.6 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD） 是一種金屬輔基酶，催化超氧陰離子自由基（O2·-）轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，減少O2·-對機(jī)體造成的傷害，是食用菌子實(shí)體中重要的自由基清除酶和保護(hù)性酶[17]。因此，氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌超氧化物歧化酶活性的影響結(jié)果見圖6。

圖6 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌SOD活性的影響Fig.6 Effect of modified atmosphere storage on SOD activity of Lanmaoa asiatica

由圖6可知，第1天～第13天貯藏過程中對照組和試驗(yàn)組的SOD活性均顯著下降，說明溫度和氣體比例的變化對SOD活性影響較大，溫度降低SOD活性減弱[18]。同時(shí)，SOD活性受到O2·-產(chǎn)生速率誘導(dǎo)[19]，O2·-產(chǎn)生越快SOD活性越高。隨著貯藏時(shí)間的延長，SOD活性逐漸增強(qiáng)，且試驗(yàn)組SOD活性低于對照組，說明對照組O2·-產(chǎn)生速率高于試驗(yàn)組。對照組和試驗(yàn)組貯藏第7天時(shí)SOD活性差異不顯著（P＞0.05），直至第 13天時(shí)差異顯著（P＜0.05）。

2.7 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD） 不僅可以作為自由基清除酶，在H2O2存在的情況下，還可氧化酚類和胺類化合物，是蘭茂牛肝菌褐變中發(fā)揮重要作用的酶類之一，可作為一種子實(shí)體老化的生理指標(biāo)[20-21]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化物酶活性的影響見圖7。

圖7 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌POD活性的影響Fig.7 Effect of modified atmosphere storage on POD activity of Lanmaoa asiatica

由圖7可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，POD活性逐漸升高，說明隨著貯藏時(shí)間延長，蘭茂牛肝菌子實(shí)體開始老化，對照組和試驗(yàn)組的蘭茂牛肝菌的POD活性差異性不顯著（P＞0.05）。

2.8 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌多酚氧化酶活性的影響

多酚氧化酶（PPO）是一類多酚類氧化酶的統(tǒng)稱，主要有漆酶和酪氨酸酶，能將酚類氧化成醌類[21-22]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌多酚氧化酶活性的影響結(jié)果見圖8。

圖8 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌PPO活性的影響Fig.8 Effect of modified atmosphere storage on PPO activity of Lanmaoa asiatica

由圖8可知，貯藏第1天至第7天對照組和試驗(yàn)組PPO活性均急劇降低，低溫會(huì)使PPO活性下降；貯藏第7天時(shí)對照組和試驗(yàn)組PPO活性差異不顯著（P＞0.05）；對照組貯藏第7天至第13天時(shí)PPO活性急劇升高，導(dǎo)致蘭茂牛肝菌褐變程度升高，而試驗(yàn)組一直保持在較低水平；貯藏第13天對照組與試驗(yàn)組PPO活性差異顯著（P＜0.05）。氣調(diào)貯藏使蘭茂牛肝菌的PPO活性保持較低水平，可延緩蘭茂牛肝菌褐變，減慢衰老進(jìn)程。

2.9 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶 （CAT） 可以催化H2O2分解為H2O和O2，是最主要的H2O2清除酶，防止H2O2直接或間接毒害或加速蘭茂牛肝菌細(xì)胞的衰老[23-24]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌過氧化氫酶活性的影響結(jié)果見圖9。

圖9 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌CAT活性的影響Fig.9 Effect of modified atmosphere storage on CAT activity of Lanmaoa asiatica

由圖9可知，對照組的CAT活性在貯藏期間是一直升高；而試驗(yàn)組CAT活性呈先升高后降低，后期再升高的趨勢；且試驗(yàn)組的CAT活性一直高于對照組。

2.1 0 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌丙二醛含量的影響

丙二醛（MDA）是細(xì)胞膜脂肪氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能夠反映蘭茂牛肝菌細(xì)胞膜衰老程度，MDA含量增加，說明細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞加劇，加速細(xì)胞的衰老[25]。氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌丙二醛含量的影響結(jié)果見圖10。

圖10 氣調(diào)貯藏對蘭茂牛肝菌MDA含量的影響Fig.10 Effect of modified atmosphere storage on MDA content of Lanmaoa asiatica

由圖10可知，貯藏第1天至第13天對照組的MDA含量顯著高于試驗(yàn)組（P＜0.05），二者的MDA含量均呈上升趨勢，氣調(diào)貯藏能夠明顯延緩MDA含量的上升，減輕蘭茂牛肝菌子實(shí)體膜脂的過氧化，延緩其衰老。

3 結(jié)論與討論

從上述試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣調(diào)貯藏保鮮條件下的蘭茂牛肝菌在子實(shí)體硬度、失重率、酶活性、感官評分、MDA含量等方面均優(yōu)于冷藏保鮮。氣調(diào)貯藏條件下子實(shí)體具有更高的抗氧化損傷能力，可以延遲呼吸峰的出現(xiàn)時(shí)間并提升其品嘗價(jià)值，延緩子實(shí)體褐變，減慢衰變進(jìn)程。相對于冷藏處理，氣調(diào)貯藏可延長蘭茂牛肝菌保鮮期10 d以上。

蘭茂牛肝菌屬于呼吸躍變型食用菌[26]，采后呼吸強(qiáng)度會(huì)繼續(xù)提高，即后熟過程，至峰值時(shí)達(dá)到完全成熟，品質(zhì)最佳，其后呼吸強(qiáng)度下降，品質(zhì)衰變。研究中試驗(yàn)組蘭茂牛肝菌呼吸峰推遲至第7天出現(xiàn)，而對照組則在采后快速出現(xiàn)。此外，前序研究[1，27]證明，試驗(yàn)組后熟過程中，蘭茂牛肝菌風(fēng)味物質(zhì)的構(gòu)成和水平會(huì)發(fā)生一系列變化，使其品嘗滋味得到提升。因此，氣調(diào)處理不僅可以延長蘭茂牛肝菌保鮮期，而且在一定時(shí)間內(nèi)可以提升其品嘗價(jià)值。

食用菌在采后衰變過程中會(huì)發(fā)生硬度變化。杏鮑菇在采后冷藏條件下會(huì)發(fā)生子實(shí)體硬化衰變，而雙孢菇（Agaricus bisporus）、秀珍菇（Pleurotus geesteranus）等食用菌在衰變中會(huì)發(fā)生軟化[28-29]。本研究中試驗(yàn)組蘭茂牛肝菌的軟化程度和速率均低于冷藏組，且其硬度變化曲線較為平緩，未觀察到快速軟化過程。然而，幾丁質(zhì)酶（chitinase） 和β-葡聚糖酶（β-glucanase）等導(dǎo)致食用菌軟化的主要酶類在蘭茂牛肝菌軟化衰變中的作用仍需進(jìn)一步探索[30]。

好氧真菌在呼吸過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），主要包括超氧陰離子（O2·-）、羥基自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等[31]。食用菌在采后由于機(jī)械損傷、微生物侵染等脅迫因素，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致脂類過氧化反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷等[32]。SOD、CAT、POD、ASA、谷胱甘肽等構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化系統(tǒng)。研究中對照組的ASA水平持續(xù)上升，且高于試驗(yàn)組水平，由此推測對照組子實(shí)體因快速進(jìn)入了衰變期，細(xì)胞內(nèi)活性氧積累后氧化還原平衡被打破，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ASA合成上調(diào)，以此應(yīng)對氧化損傷。而試驗(yàn)組有效抑制了呼吸作用，保持了其細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，因而ASA只是緩慢上升后下降，總體水平低于對照組。值得注意的是，對照組的CAT活性持續(xù)上升，趨勢與ASA一致，但活性總體低于對照組。由于ASA和CAT在細(xì)胞內(nèi)都行使分解H2O2的功能，因此推測冷藏與氣調(diào)處理下細(xì)胞分解H2O2的機(jī)制有所差異。SOD是分解自由基的關(guān)鍵酶，研究中對照組和試驗(yàn)組SOD活性先下降，之后對照組SOD活性再次回升至新鮮子實(shí)體的基線水平，而氣調(diào)組SOD活性一直較低，僅貯藏末期有所回升，但仍低于基線水平?？梢姴煌ｕr處理在初始階段均能降低細(xì)胞內(nèi)自由基水平，但隨著子實(shí)體衰變進(jìn)程，自由基水平可能再次回升，造成氧化損傷。

結(jié)合SOD和CAT活性變化情況，推測冷藏處理在起始階段可以抑制自由基水平，但無法處理大量生成的H2O2，因此細(xì)胞增加ASA合成和CAT活性。而氣調(diào)處理可以持續(xù)抑制自由基水平，生成的H2O2主要通過上調(diào)CAT活性進(jìn)行抑制。因此在不同保鮮條件下，蘭茂牛肝菌應(yīng)對氧化損傷的機(jī)制可能有所差異，但該假設(shè)需要對更多的抗氧化指標(biāo)進(jìn)行研究證明。