利用杏鮑菇殘?jiān)苽銬-氨基葡萄糖鹽酸鹽的研究*

崔 瑋，丁玲強(qiáng)，李佩佩，李學(xué)艷，騰 琪，李彩霞，李玉蘭

（1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省張掖市甘州中學(xué)，甘肅 張掖 734000）

D-氨基葡萄糖鹽酸鹽 （D-glucosamine hydrochloride，GAH） 呈白色結(jié)晶粉末，分子式為C6H13NO5HCl，是甲殼素的一種重要衍生物。氨基葡萄糖化合物類的藥物具抗炎、護(hù)肝、參與肝腎解毒等作用[1-2]。目前，GAH大多是利用沿海地區(qū)動(dòng)物甲殼中的甲殼素為原料制備[3]，具有一定的地理和氣候的限制。栽培杏鮑菇（Pleurotus eryngii）時(shí)所產(chǎn)生的菌渣中含有大量的菌絲體，而菌絲體細(xì)胞壁的主要成分是甲殼素，占細(xì)胞壁干重的20%～42%[4]，是生產(chǎn)GAH的理想原料。張掖市甘州區(qū)是甘肅省最大的杏鮑菇生產(chǎn)基地，每天均會(huì)產(chǎn)生許多杏鮑菇殘?jiān)@些殘?jiān)绾芜M(jìn)行綜合利用需要引起高度關(guān)注。目前，尚未有利用杏鮑菇菌渣制備GAH的相關(guān)研究。因此，研究旨在探索杏鮑菇殘?jiān)兄苽銰AH的理想工藝，為GAH的生產(chǎn)提供新的方法，同時(shí)也為提高杏鮑菇殘?jiān)木C合利用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

杏鮑菇殘?jiān)?，?021年9月由張掖市甘州區(qū)張掖市紫家寨農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 試劑和藥品

GAH標(biāo)準(zhǔn)品 (純度≥99%)，北京索萊寶科技有限公司；硝酸銀 (光譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉、濃鹽酸、乙酰丙酮、碳酸鈉、鉻酸鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇、正丁醇、冰醋酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛、茚三酮，天津市百世化工有限公司。

1.3 儀器

RE-52AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，溫州奧利生物醫(yī)學(xué)儀器廠；AL204電子天平，梅特勒—托利多 (上海)儀器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器，金壇市城東新瑞儀器廠；DD-5M型大容量離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司制造；AutopolⅢ-旋光儀，美國(guó)魯?shù)婪蚬尽?/p>

1.4 方法

1.4.1 GAH的制備

1） 杏鮑菇殘?jiān)念A(yù)處理

預(yù)處理時(shí)將干燥的杏鮑菇殘?jiān)?%HCl室溫浸泡12 h以上，除去無(wú)機(jī)鹽成分，然后用2%的NaOH回流煮沸3 h～4 h，除去蛋白質(zhì)成分。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的原料烘干，粉碎備用[5]。

2） GAH粗品的制備

稱取一定量預(yù)處理原料，加入三孔反應(yīng)瓶，按照一定料液比加入一定濃度的HCl攪拌，保持一定溫度反應(yīng)一定時(shí)間后，將混合液體移入離心管中，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液，在沉淀中加入100 mL蒸餾水淋洗沉淀，離心后將上清液和淋洗液合并過(guò)濾，將濾液減壓濃縮，待瓶壁析出大量晶體時(shí)停止?jié)饪s，將濃縮液與晶體一并轉(zhuǎn)出，加入過(guò)量無(wú)水乙醇冷卻至5℃左右過(guò)濾得濾渣即為GAH粗品[6]。

3） GAH的純化

采取重結(jié)晶法[7]，將粗GAH晶體溶于沸水中，加入適量活性碳，在60℃下連續(xù)攪拌1.5 h脫色。然后將溶液趁熱過(guò)濾，加入無(wú)水乙醇，劇烈攪拌2 h，冷卻至5℃左右過(guò)濾收集晶體并干燥得白色結(jié)晶粉末。

1.4.2 GAH含量的測(cè)定

用改進(jìn)的乙酰丙酮法[8]和Elson-Morgan方法[9]結(jié)合測(cè)定樣品溶液中的GAH含量。

1.4.3 杏鮑菇殘?jiān)蠫AH得率的測(cè)定

GAH得率（G，%） 的計(jì)算公式為：

式中：m為實(shí)際測(cè)得的GAH含量（g）；M為杏鮑菇殘?jiān)|(zhì)量（g）。

1.4.4 單因素考察及正交試驗(yàn)

為確定正交試驗(yàn)的因素與水平，考察了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、鹽酸濃度和料液比 [料液比為質(zhì)量（g） 與體積（mL） 的比]對(duì)GAH粗品得率的影響，分別做3次平行試驗(yàn)。

根據(jù)反應(yīng)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)因素下選擇3個(gè)水平做正交試驗(yàn)。

1.4.5 GAH的層析

采用紙層析法[10]鑒定正交驗(yàn)證試驗(yàn)所得最佳提取條件下制備并純化的GAH，展層劑為V（正丁醇）∶V（水）∶V（冰醋酸）=4∶3∶1，混合搖勻分層后棄下層。層析后用茚三酮反應(yīng)試劑顯色以及Morgan和Elson反應(yīng)試劑 [V（正丁醇）∶V（水）∶V（冰醋酸）=4∶3∶1]顯色，并計(jì)算Rf值，其計(jì)算公式為：

式中：s為原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離（mm）；S為原點(diǎn)中心至展層劑前沿的距離（mm）。

1.4.6 氯離子含量的測(cè)定

采用硝酸銀滴定法測(cè)定正交驗(yàn)證試驗(yàn)所得最佳提取條件下制備并純化的GAH氯離子含量[11]。

1.4.7 GAH樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜分析

在相同條件下測(cè)定正交驗(yàn)證試驗(yàn)所得最佳提取條件下制備并純化的GAH樣品和GAH標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖。

1.4.8 GAH的比旋光度

準(zhǔn)確稱取1.00 g GAH樣品，迅速溶解于重蒸水中，定容至50 mL。每隔10分鐘在旋光儀上測(cè)定20℃時(shí)溶液旋光度，計(jì)算出比旋光度，繪制比旋光度隨時(shí)間的變化曲線[12]，比旋光度的計(jì)算公式為：

式中：α為旋光度（°）；L為旋光管長(zhǎng)度（dm）；C為測(cè)試樣品的質(zhì)量濃度（g·mL-1）；D為旋光儀光源鈉光的波長(zhǎng)（589 nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素水平結(jié)果與分析

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)GAH得率的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)GAH得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)GAH得率的影響Fig.1 Effect of reaction time on the yield of GAH

由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)小于3.5 h，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)GAH得率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)；反應(yīng)超過(guò)3.5 h后，GAH得率開始下降。原因可能是反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，GAH在水解過(guò)程中發(fā)生復(fù)合與再分解反應(yīng)[13]?？紤]生產(chǎn)效率，選擇3.5 h為最適水解時(shí)間。

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)GAH得率的影響

不同反應(yīng)溫度對(duì)GAH得率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)GAH得率的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of GAH

由圖2可見，隨反應(yīng)溫度的升高，GAH得率先增加后降低。溫度過(guò)高，導(dǎo)致DAH的復(fù)合與分解反應(yīng)增加，生成一些低聚糖與非糖物質(zhì)，使成品顏色加深[13]。因此，選擇100℃為反應(yīng)的最適溫度。

2.1.3 鹽酸濃度對(duì)GAH得率的影響

鹽酸濃度對(duì)GAH得率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 鹽酸濃度對(duì)GAH得率的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the yield of GAH

由圖3可知，當(dāng)鹽酸濃度較低時(shí)，GAH得率隨著濃度的增大而增高，水解加快。鹽酸濃度為30%時(shí)，GAH得率較高，而且得到產(chǎn)品的顏色最白。當(dāng)鹽酸濃度大于30%時(shí)，其得率呈下降趨勢(shì)?？赡苁钱?dāng)鹽酸濃度過(guò)低時(shí)，不易打開酰胺鍵，而鹽酸濃度過(guò)高，副反應(yīng)增多，粘壁碳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，造成得率、質(zhì)量下降[13]。因此加入鹽酸的最適濃度為30%。

2.1.4 料液比對(duì)GAH得率的影響

料液比對(duì)GAH得率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對(duì)GAH得率的影響Fig.4 Effect of the ratio of material to liquid on the yield of GAH

圖4可知，料液比為1∶6時(shí)GAH得率最大。鹽酸作為催化劑和水解反應(yīng)物，用量過(guò)少，體系黏度大，反應(yīng)不充分，且易造成粘壁，增加副反應(yīng)且得率較低；但用量過(guò)高會(huì)給后續(xù)處理帶來(lái)困難且明顯增加成本，因此最適料液比為1∶6。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析料液比、反應(yīng)溫度、鹽酸濃度以及反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素中不同水平對(duì)GAH得率的影響，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)，分析探究制備GAH的理想工藝，其水平因素設(shè)計(jì)表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果于分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

表2 GAH制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiments for GAH preparation process optimization

由表2可知，極差結(jié)果R顯示：B>D>A>C，即4個(gè)因素中對(duì)GAH得率影響順序?yàn)椋篐Cl濃度>料液比>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間，最佳工藝條件為A2B2C2D2，即在料液比為1∶6、鹽酸濃度為30%、反應(yīng)溫度為100℃、反應(yīng)時(shí)間為3.5 h時(shí)從杏鮑菇殘?jiān)兄苽銰AH的得率最高。對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，GAH的平均得率為5.23%。

2.3 GAH層析分析

根據(jù)最佳工藝制備GAH粗品，再采取重結(jié)晶法純化，得白色GAH結(jié)晶粉末，以此結(jié)晶物進(jìn)行紙層析分析。紙層析圖譜見圖5。

圖5 GAH層析圖譜Fig.5 Paper chromatograms of GAH

由圖5可知，用茚三酮試劑顯色后樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)一個(gè)橘紅色斑點(diǎn)，表明該化合物中含有氨基；用Morgan和Elson試劑顯色后，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品也都出現(xiàn)一個(gè)紅色斑點(diǎn)，說(shuō)明有氨基葡萄糖存在。2個(gè)GAH樣品斑點(diǎn)的Rf值均為0.34，與GAH標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值一致，說(shuō)明試驗(yàn)制備的GAH的純度較高。

2.4 氯離子含量

經(jīng)計(jì)算可得，根據(jù)最佳工藝從杏鮑菇殘?jiān)苽涞腉AH（樣品）中，氯離子含量為18.14%，接近于標(biāo)準(zhǔn)品中氯離子含量為16.47%。進(jìn)一步說(shuō)明試驗(yàn)制備的GAH的純度較高。

2.5 紅外光譜分析

在相同條件下分別測(cè)定了GAH標(biāo)準(zhǔn)品和根據(jù)最佳工藝從杏鮑菇殘?jiān)兄苽涞腉AH樣品的紅外光譜圖，其結(jié)果見圖6。

由圖6可知，所制得的GAH產(chǎn)品在3 280.8 cm-1左右的峰是N-H鍵的伸縮振動(dòng)；2 942.7 cm-1左右峰是C-H鍵的伸縮振動(dòng)；1 614.8 cm-1左右峰是NH鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)；1 060.5 cm-1左右峰是C-N鍵的伸縮振動(dòng)；912.8 cm-1左右峰是N-H鍵的面外彎曲振動(dòng)；與標(biāo)準(zhǔn)品D-GAH紅外光譜圖相吻合。

圖6 紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram

2.6 比旋光度分析

GAH的比旋光度隨時(shí)間變化的曲線見圖7。

圖7 GAH溶液（2%）的比旋光度-時(shí)間變化曲線Fig.7 The profile of specific rotatory power of GAH solution(2%)versus time

從圖7可以看出，GAH重新溶解于水后出現(xiàn)變旋現(xiàn)象。其剛?cè)苡谒畷r(shí)比旋光度值最高，幾乎接近100°，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其比旋光度迅速下降，約2 h后，比旋光度趨于穩(wěn)定，為71.9°。這一現(xiàn)象可能的原因是，用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶的過(guò)程中，GAH以α形式析出，當(dāng)其重新溶解于水中后，α型的GAH將向β型轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定的GAH水溶液是其α型和β型的平衡混合物。

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了杏鮑菇殘?jiān)苽銰AH的反應(yīng)條件對(duì)產(chǎn)物得率的影響，重點(diǎn)研究了反應(yīng)過(guò)程中料液比、鹽酸濃度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)得率的影響。通過(guò)對(duì)工藝條件的探究，通過(guò)正交試驗(yàn)及分析，確定最佳反應(yīng)條件為料液比為1∶6、鹽酸濃度為30%、反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時(shí)間為3.5 h，在該條件下GAH的得率可以達(dá)到5.23%，經(jīng)層析、氯離子檢測(cè)、紅外光譜和比旋光度分析可知，用該工藝提取的物質(zhì)為GAH，且純度較高。因此通過(guò)杏鮑菇殘?jiān)苽銰AH的研究為其制備生產(chǎn)提供了新的方法，從而進(jìn)一步擴(kuò)展了制備途徑，同時(shí)也為提高杏鮑菇殘?jiān)木C合利用價(jià)值提供理論和必要的試驗(yàn)依據(jù)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。