血紅密孔菌菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及活性研究*

魯 鐵，李 登，朱園園，蘇正嫻，段鵬菲，陳懷中，劉 宇，謝朝暉**

（1.河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036；2.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；3.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

血紅密孔菌[Pycnoporus sanguineus（L.）Murrill]又稱血紅栓菌，隸屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科 （Polyporaceae） 密孔菌屬（Pycnoporus）；分布于我國(guó)河南、云南、湖南、陜西、四川、新疆等省份[1]。研究表明[2-4]該菌及其菌絲體發(fā)酵提取物在醫(yī)藥方面有較廣泛應(yīng)用，如消炎、燒傷后感染的治療、抗腫瘤等。此外，其富含多糖、黃酮等活性物質(zhì)。隨著食（藥）用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，真菌多糖在功能性食品開發(fā)方面具有的潛在價(jià)值日益凸顯，如提升免疫力、預(yù)防腫瘤、抗疲勞、促進(jìn)傷口痊愈等[5-9]。

血紅密孔菌的前期研究主要集中在培養(yǎng)、酶學(xué)、生態(tài)機(jī)制方面，而對(duì)其菌絲體多糖的提取及活性相關(guān)的研究尚未見報(bào)道。因此以血紅密孔菌液體發(fā)酵獲得的菌絲體為原材料，利用超聲輔助法提取多糖成分，通過(guò)單因素、多因素試驗(yàn)獲得最佳提取工藝條件，在最佳條件的基礎(chǔ)上制備的菌絲體為材料進(jìn)行活性研究，以為血紅密孔菌菌絲體多糖的提取制備以及對(duì)深入性的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與主要設(shè)備

血紅密孔菌采自平頂山市魯山縣龍?zhí)秿{景區(qū)，經(jīng)組織分離獲得菌種，保存于河南城建學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院菌物標(biāo)本室，編號(hào)為XHMK28542。其菌絲體根據(jù)參考文獻(xiàn)[2，10]的方法制備，放入烘箱60℃烘干至恒重，烘干后用粉碎機(jī)粉碎成粒徑為小于75 μm的粉末，過(guò)篩，置于密封袋內(nèi)，凍存于-20℃，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；Al（NO3）3、FeSO4·7H2O、焦性沒(méi)食子酚，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；NaOH、NaNO2，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；其他試劑均為分析純。

KQ-50B型超聲儀，昆山市超聲波儀器有限公司；JP-100A-2型紫外分光光度，上海元析儀器有限公司；PE Eenspire型酶標(biāo)儀，美國(guó)PE公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗多糖提取

精確稱取0.1 g菌絲體粉末按照料液比1∶30加入蒸餾水中，80℃熱水超聲輔助浸提15 min，然后使用水浴鍋80℃熱水提取60 min，冷卻至室溫，將粗多糖溶液轉(zhuǎn)入離心管，加入等體積Sevage溶液 [V（氯仿）∶V（正丁醇）=5∶1]，搖勻震蕩，4 000 r·min-1室溫（25℃） 離心10 min，得上清。按照1∶3的體積比向上清中添加95%的乙醇并在4℃醇沉過(guò)夜，后于4 000 r·min-1室溫 （25℃） 離心5 min，并將沉淀物抽濾，沉淀物用1 mL蒸餾水溶解。即得血紅密孔菌菌絲體粗多糖溶液。

1.2.2 血紅密孔菌菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：分別評(píng)估不同的水浴溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、超聲輔助時(shí)間 （10 min、15 min、20 min、25 min、30 min） 和熱水浸提時(shí)間（20 min、40 min、60 min、80 min、100 min） 對(duì)菌絲體多糖提取率的影響。其除單因素優(yōu)化因素外，其他粗多糖提取方法同1.2.1。

響應(yīng)面試驗(yàn)：選取提取水浴溫度、料液比、熱水浸提時(shí)間、超聲輔助時(shí)間4種單因素，以菌絲體多糖的提取率作為響應(yīng)值。采用Box-Behnken方法優(yōu)化其最佳提取條件，其他方法如1.2.1所示。

1.2.3 多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[11-13]測(cè)定多糖的含量，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=3.488 6x+0.006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 1，按該方程計(jì)算其粗多糖含量。吸光度值使用酶標(biāo)儀測(cè)定。將樣品溶液稀釋10倍得到待測(cè)液，取100 μL待測(cè)液于5 mL的試管中計(jì)算多糖含量（Y，%）。其計(jì)算公式如下：

式中：C為粗多糖的含量（g·mL-1）；V為菌絲體多糖溶液的體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.4 血紅密孔菌菌絲體多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，將菌絲體多糖溶液用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度分別為0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1、2.4 mg·mL-1、4.8 mg·mL-1、9.6 mg·mL-1的待測(cè)液。羥基自由基清除率的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[14-16]；超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[17]。

1.2.5 血紅密孔菌多糖抑菌試驗(yàn)

參照參考文獻(xiàn)[18]，以青霉素為陽(yáng)性對(duì)照，制備質(zhì)量濃度為 0.60 mg·mL-1、1.20 mg·mL-1、2.40 mg·mL-1、4.80 mg·mL-1、9.60 mg·mL-1的菌絲體多糖溶液，過(guò)濾除菌待用。并分別培養(yǎng)供試菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）溶液。利用紫外分光光度法探究不同質(zhì)量濃度菌絲體多糖對(duì)大腸桿菌等的抑菌活性，其抑菌率（I，%）的計(jì)算公式為：

式中：A0是空白對(duì)照的吸光度值；A1是樣品測(cè)量管的吸光度值；Ai是樣品背景管的吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析方法

將所測(cè)得的數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，利用Design-Expert 10.0.7對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素提取溫度、料液比、熱水浸提時(shí)間、超聲輔助時(shí)間的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Single factor test on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，在提取溫度為60℃～80℃，菌絲體多糖的提取率隨溫度升高呈現(xiàn)正相關(guān)，在80℃時(shí)達(dá)到最高峰，80℃～100℃時(shí)，隨著溫度的升高，菌絲體多糖的提取率呈下降趨勢(shì)。因此，在其他條件一定的情況下，菌絲體多糖提取的最佳溫度為80℃。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，此時(shí)菌絲體多糖的提取率最高。熱水浸提時(shí)間在20 min～40 min時(shí)，菌絲體多糖提取率呈下降趨勢(shì)，而在40 min～60 min時(shí)，菌絲體多糖提取率增加，60 min時(shí)達(dá)到峰值，峰值后呈下降趨勢(shì)，綜合所述，60 min是菌絲體多糖熱水浸提的較佳時(shí)間。超聲輔助時(shí)間在15 min時(shí)達(dá)到峰值，超聲輔助處理可以有效的使用超聲的空穴效應(yīng)破除殘留的細(xì)胞壁，以利于多糖的析出。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

選取提取水浴提取溫度、料液比、熱水浸提時(shí)間、超聲輔助時(shí)間4種單因素，以菌絲體多糖的提取率作為響應(yīng)值。采用Box-Behnken方法優(yōu)化其最佳提取條件，其他方法如1.2.1所示。在單因素的基礎(chǔ)上，采用中心組和設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1；試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果見表2。采用響應(yīng)面軟件Design-Expert對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合并進(jìn)行方差分析，得到的結(jié)果見表3。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表3數(shù)據(jù)獲得的回歸方程為：

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance for the fitted regression model

根據(jù)方差分析結(jié)果可得，菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化模型回歸極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明了模型構(gòu)建較成功，與試驗(yàn)的差異較小。決定系數(shù)R-Squared=0.942 2，調(diào)整決定系數(shù)=87.99%，說(shuō)明該模型可以反映出87.99%的變化規(guī)律，結(jié)果表明，該模型完全符合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。由F值可知，根據(jù)影響菌絲體多糖提取率的程度，對(duì)因素排序?yàn)椋毫弦罕龋ˋ） ＞熱水浸提時(shí)間（D） ＞超聲輔助時(shí)間（C）＞提取溫度（B）。兩因素交互作用對(duì)多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面結(jié)果圖見圖2。

由圖2可知，各因子之間存在交互作用，響應(yīng)面圖的斜率越陡，相互作用越顯著，斜率越小，相互作用越不顯著。分析結(jié)果表明，料液比與超聲輔助時(shí)間、超聲輔助時(shí)間與熱水浸提時(shí)間、料液比與熱水浸提時(shí)間的響應(yīng)面圖均較陡峭。根據(jù)對(duì)響應(yīng)面分析的回歸方程進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，并結(jié)合圖2兩因素交互作用對(duì)多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面可知，4個(gè)因子之間對(duì)血紅密孔菌菌絲體多糖的提取率存在最大值，對(duì)擬合出的二次多項(xiàng)式回歸方程分別求出A、B、C和D的偏導(dǎo)數(shù)得出菌絲體多糖提取的最優(yōu)工藝為超聲輔助時(shí)間

圖2 多糖產(chǎn)量的響應(yīng)面結(jié)果圖Fig.2 Response surface results plot of polysaccharide yield

15 min、熱水浸提時(shí)間59 min、提取溫度79.7℃、料液為1∶30，此條件預(yù)測(cè)的菌絲體多糖提取率為5.231%。經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)，可得菌絲體多糖平均實(shí)際提取率為5.228%，接近預(yù)測(cè)值，表明該模型能夠準(zhǔn)確反映各種因素對(duì)菌絲體多糖提取率的影響，結(jié)果可靠。

2.3 活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的多糖對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除效率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。

圖3 不同質(zhì)量濃度多糖對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of·OH and O2·-clearance rate by polysaccharides with different mass concentrations

如圖3所示，菌絲體多糖在濃度增大的趨勢(shì)下，對(duì)羥基自由基的清除率呈正相關(guān)，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.021 mg·mL-1～0.035 mg·mL-1時(shí)清除率上升幅度趨于平坦，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.035 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大值為17.80%。且菌絲體多糖濃度為0.027 mg·mL-1時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基清除率為32.31%，在同等質(zhì)量濃度下高于陽(yáng)性對(duì)照。

2.3.2 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的多糖抑菌效果統(tǒng)計(jì)見圖4。

圖4 不同質(zhì)量濃度多糖的抑菌率Fig.4 The antibacterial ability rate of polysaccharides at different mass concentrations

由圖4所示，菌絲體多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，抑菌率呈現(xiàn)明顯正相關(guān)，表明菌絲體多糖對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。在質(zhì)量濃度為1.2 mg·mL-1～2.4 mg·mL-1時(shí)對(duì)綠膿桿菌的抑菌率相差不顯著，后來(lái)隨著濃度增加，抑菌率變化明顯，在9.6 mg·mL-1時(shí)抑菌率達(dá)到最大值，表明菌絲體多糖對(duì)綠膿桿菌有明顯的抑制效果。在濃度 0.6 mg·mL-1～4.8 mg·mL-1時(shí)，對(duì)大腸肝菌的抑菌率隨質(zhì)量濃度增加而增大，后隨著質(zhì)量濃度的升高，抑菌率趨于平緩，并在質(zhì)量濃度最大時(shí)抑菌效果達(dá)到最大，由此可見菌絲體多糖對(duì)大腸桿菌有顯著的抑制效果。對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌率隨質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)正相關(guān)，在質(zhì)量濃度最高時(shí)，抑菌率達(dá)到最大值，由此可見一定質(zhì)量濃度的菌絲體多糖溶液對(duì)枯草芽孢桿菌有明顯的抑制效果。

3 討論與結(jié)論

目前，基于響應(yīng)面法對(duì)多糖提取工藝條件的優(yōu)化已得到廣泛應(yīng)用[19-22]，而這種方法在對(duì)發(fā)酵獲取菌絲體多糖的提取優(yōu)化上也得到了較好的效果，研究結(jié)果也得到了較理想的驗(yàn)證。而前期的文獻(xiàn)表明血紅密孔菌含有耐高溫的漆酶，可降解木材，且提取的色素可用于染料生產(chǎn)[23]。試驗(yàn)進(jìn)一步拓展了血紅密孔菌的新功效，對(duì)其發(fā)酵菌絲體多糖進(jìn)行制備及應(yīng)用于功能食品的開發(fā)提供了一定的參考數(shù)據(jù)。隨著人口老齡化問(wèn)題的凸顯，大健康產(chǎn)業(yè)在全球經(jīng)濟(jì)中的地位逐漸提升，菌類多糖一直是功能食品開發(fā)的熱點(diǎn)，而作為食（藥）用菌種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要來(lái)源，對(duì)拓寬新資源具有積極的導(dǎo)向作用。

通過(guò)料液比、提取溫度、超聲輔助時(shí)間、熱水浸提時(shí)間4個(gè)單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)多因素試驗(yàn)得到提取血紅密孔菌菌絲體多糖的最佳條件，得到在超聲輔助時(shí)間為15 min、熱水浸提時(shí)間為59 min、提取溫度為79.7℃、料液比為1∶30；此時(shí)血紅密孔菌菌絲體多糖的提取率達(dá)到5.231%。與同等濃度的VC對(duì)照組相比，菌絲體多糖對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，但清除能力低于VC；菌絲體多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力高于對(duì)照組，說(shuō)明菌絲體多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有較好的清除能力。此外，菌絲體多糖對(duì)4種指示菌的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用；整體來(lái)看，菌絲體多糖具有一定的抗氧化、抑菌能力，可作為一種天然的食品添加劑，在食（藥）用菌天然提取物抗氧化活性方面具有良好的應(yīng)用前景，該結(jié)果為食品工業(yè)應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。