云南地區(qū)栽培的3種羊肚菌的培養(yǎng)基篩選及生物學(xué)特性分析*

羅祥英 ，李 健 ，許天休 ，李文芝 ，曹 瑤 ，楊林雷 ，陸青青 ，沈真輝 ，楊曉君 ，李榮春 **

（1.云南菌視界生物科技有限公司，云南 昆明 651708；2.昆明市（食用菌）企業(yè)工程技術(shù)中心，云南 昆明 651708）

羊肚菌（Morchella spp.）隸屬于子囊菌門（Ascomycota） 盤菌綱 （Discomycetes） 盤菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae），是一類富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的珍稀食用菌。目前，全國(guó)廣泛推廣栽培的羊肚菌品種屬于黑色羊肚菌支系（Elata Clade）。雖然已有較多關(guān)于羊肚菌生物學(xué)特性的研究，但因栽培區(qū)域、種類以及菌株等的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同，甚至相反。因此，以云南地區(qū)栽培的主要羊肚菌種類六妹羊肚菌（M.sextelata）、梯棱羊肚菌（M.importua） 和七妹羊肚菌（M.eximia）為研究材料，系統(tǒng)研究不同碳源、氮源、2種無機(jī)鹽對(duì)3種羊肚菌共15個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生的影響，并優(yōu)化、篩選最佳培養(yǎng)基配方，為云南地區(qū)羊肚菌的大規(guī)模生產(chǎn)及栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試羊肚菌菌株均由云南菌視界生物科技有限公司保存、提供，具體信息詳見表1。

表1 供試菌株清單Tab.1 The list of tested strains

1.2 培養(yǎng)基配方

配方1培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（去皮）、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g、VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

配方2培養(yǎng)基：糊精20 g（碳源）、蛋白胨5 g（氮源）、瓊脂粉18 g、VB110 mg，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種初篩

利用配方1培養(yǎng)基活化供試菌種，獲得純培養(yǎng)菌絲。統(tǒng)計(jì)15個(gè)菌株的菌絲平均生長(zhǎng)速度，篩選出長(zhǎng)勢(shì)最好的3個(gè)菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.3.2 不同碳源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)影響試驗(yàn)

以另外14種碳源分別替代上述配方2培養(yǎng)基中的糊精，包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、乙醇、丙三醇、幾丁質(zhì)、麥粒煮汁、山梨醇、木糖，均分別稱取20 g；以無碳源的培養(yǎng)基作對(duì)照。統(tǒng)計(jì)分析不同碳源對(duì)3個(gè)初篩菌株菌絲生長(zhǎng)的影響。

以六妹羊肚菌JSJ-M1菌株為試驗(yàn)材料，每隔12小時(shí)測(cè)量菌落半徑，研究其在不同碳源下的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 不同氮源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)影響試驗(yàn)

以另外10種氮源分別替代上述配方2培養(yǎng)基中的蛋白胨，包括豆餅粉、玉米粉、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨、酒石酸銨，均分別稱取5 g；以無氮培養(yǎng)基作對(duì)照。統(tǒng)計(jì)分析不同氮源對(duì)3個(gè)初篩菌株菌絲生長(zhǎng)的影響。

以六妹羊肚菌JSJ-M1菌株為試驗(yàn)材料，每隔12小時(shí)測(cè)量菌落半徑，研究其在不同氮源下的生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 不同溫度對(duì)六妹羊肚菌JSJ-M1菌株影響試驗(yàn)

使用篩選出的最佳培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基，以六妹羊肚菌JSJ-M1菌株為材料，設(shè)置恒溫培養(yǎng)箱溫度分別為4℃、9℃、12℃、15℃、18℃、21℃、24℃、28℃、34℃共9個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，黑暗條件培養(yǎng)。

1.3.5 不同pH對(duì)六妹羊肚菌JSJ-M1菌株影響試驗(yàn)

以六妹羊肚菌JSJ-M1菌株為材料，使用篩選出的最佳培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌前用濃度為 0.1 mol·L-1的 NaOH 和濃度為 0.1 mol·L-1的HCl調(diào)節(jié)pH，采用PHS-2C型酸度計(jì)測(cè)定，設(shè)置pH為 4.0、4.5、 5.0、 5.5、6.0、6.5、 7.0、7.5、8.0、9.0共10個(gè)處理，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.3.6 KH2PO4和MgSO4對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)：使用篩選出的最佳培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別加入KH2PO4和MgSO4，均設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度梯度為0.5 g·L-1、1.0 g·L-1、1.5 g·L-1、2.0 g·L-1、2.5 g·L-1、3.0 g·L-1，以不添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理5次重復(fù)。

2）雙因素組合試驗(yàn)：在單因素的基礎(chǔ)上，通過全面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究2種無機(jī)鹽的不同組合對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及菌核形成的影響，每個(gè)組合設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)測(cè)量方法

試驗(yàn)采用90 mm的一次性滅菌培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿倒20 mL的培養(yǎng)基，固定培養(yǎng)基厚度相同。接種塊大小為直徑5 mm，置于培養(yǎng)皿中央，接種后用1層封口膜封口并置于18℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。接種后采用劃線法每隔12小時(shí)劃線測(cè)量1次菌絲生長(zhǎng)速度，并觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)以及菌核形成情況。接種培養(yǎng)15天后，挑取菌核，烘干，測(cè)量菌核干質(zhì)量。用Excel記錄并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPSS 25.0進(jìn)行均值分析、方差分析、單/雙因素ANOVA檢驗(yàn)。

菌絲生長(zhǎng)速度（V，mm·d-1）的計(jì)算公式為：

式中：L為菌絲平均直徑（mm）；t為菌絲培養(yǎng)時(shí)間 （d）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株在同一培養(yǎng)基內(nèi)菌絲長(zhǎng)勢(shì)存在差異

15個(gè)菌株在配方1培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度見圖1。

圖1 不同菌株在配方1培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度Fig.1 Growth rate of different strains on formula 1 medium

如圖1所示，15個(gè)菌株在配方1培養(yǎng)基上的菌絲長(zhǎng)勢(shì)存在差異。其中生長(zhǎng)最快的菌株為六妹羊肚菌JSJ-M1，平均生長(zhǎng)速度為12.65 mm·d-1；菌株JSJ-M2菌絲生長(zhǎng)較快，平均生長(zhǎng)速度為11.96 mm·d-1。七妹羊肚菌中菌絲生長(zhǎng)較快的菌株為JSJ-M6，平均生長(zhǎng)速度為12.34 mm·d-1。梯棱羊肚菌中生長(zhǎng)較快的菌株為JSJ-M14和JSJ-M15，平均生長(zhǎng)速度分別為11.71 mm·d-1和 11.98 mm·d-1。通過篩選，以菌株JSJ-M1、JSJ-M6、JSJ-M15為材料進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 不同碳源對(duì)3個(gè)羊肚菌菌株的影響

3個(gè)羊肚菌菌株在不同碳源培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度見圖2。

圖2 3個(gè)羊肚菌菌株在不同碳源培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度Fig.2 Mycelial growth rate of three Morchella strains on the different carbon sources media

由圖2可知，不同碳源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)影響較大，JSJ-M1、JSJ-M6和JSJ-M15菌株生長(zhǎng)的最佳碳源均為可溶性淀粉，平均菌絲生長(zhǎng)速度分別為14.57 mm·d-1、14.30 mm·d-1和 14.04 mm·d-1。其次是糊精、幾丁質(zhì)和蔗糖；其中JSJ-M1菌株對(duì)糊精的利用優(yōu)于幾丁質(zhì)和蔗糖，JSJ-M6菌株對(duì)幾丁質(zhì)的利用優(yōu)于糊精和蔗糖，JSJ-M15菌株對(duì)蔗糖的利用優(yōu)于幾丁質(zhì)和糊精。在以乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇為碳源時(shí)，JSJ-M1和JSJ-M6菌株的生長(zhǎng)速度與不添加碳源的對(duì)照組的菌絲生長(zhǎng)速度無顯著差異，不加碳源的對(duì)照組雖然菌絲生長(zhǎng)較快，但是菌絲非常稀疏、纖細(xì)；3個(gè)菌株對(duì)乳糖的利用存在較大的差異，以乳糖為碳源時(shí)，JSJ-M1、JSJ-M6、JSJM15菌株的菌絲生長(zhǎng)速度分別為11.76 mm·d-1、8.66 mm·d-1、5.56 mm·d-1。JSJ-M15 菌株對(duì)丙三醇和麥粒煮汁的利用與麥芽糖無異而優(yōu)于乳糖，這與JSJM1和JSJ-M6菌株相反。3個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)最差碳源均為半乳糖、乙醇和木糖。

通過觀察、統(tǒng)計(jì)3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)，分析羊肚菌對(duì)碳源的綜合利用情況，結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.2 The effects of different carbon sources on the growth of Morchella spp.mycelia

如表2所示，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)在不同碳源條件下羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)速度存在顯著差異，即不同碳源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響較大。在可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上3個(gè)羊肚菌菌株的綜合平均生長(zhǎng)速度最快，為14.30 mm·d-1，顯著優(yōu)于其他碳源。其次是蔗糖、幾丁質(zhì)和糊精，綜合平均生長(zhǎng)速度分別為 12.22 mm·d-1、11.99 mm·d-1和 11.93 mm·d-1，雖然這3個(gè)碳源之間無顯著差異，但顯著優(yōu)于除了可溶性淀粉以外的其他碳源。在麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲較粗壯、濃密，長(zhǎng)勢(shì)較好，綜合菌絲平均生長(zhǎng)速度為9.89 mm·d-1。以山梨醇、乳糖、甘露醇作為碳源以及對(duì)照培養(yǎng)基內(nèi)的菌絲生長(zhǎng)速度雖然較快，但是菌絲非常稀疏、纖細(xì)，長(zhǎng)勢(shì)很弱，說明羊肚菌菌絲生長(zhǎng)不能很好的利用乳糖、甘露醇、山梨醇。以丙三醇、果糖等作為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較粗壯，但是生長(zhǎng)速度很慢。而在以木糖、半乳糖、乙醇作為碳源的培養(yǎng)基上，羊肚菌菌絲基本不能生長(zhǎng)。綜上所述，羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)碳源為可溶性淀粉；以可溶性淀粉、糊精、幾丁質(zhì)和蔗糖作為碳源時(shí)，羊肚菌菌絲粗壯、濃密、長(zhǎng)勢(shì)很好，為羊肚菌栽培的優(yōu)選碳源。

2.3 不同氮源對(duì)3個(gè)羊肚菌菌株的影響

3個(gè)羊肚菌菌株在不同氮源培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度見圖3。

圖3 3個(gè)羊肚菌在不同氮源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度Fig.3 Mycelial growth rate of three Morchella strains on the different nitrogen sources media

如圖3所示，3個(gè)羊肚菌菌株在以酒石酸銨為氮源的培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，此外其他試驗(yàn)組與對(duì)照組相差不明顯。JSJ-M1和JSJ-M6菌株對(duì)氮源的適應(yīng)利用范圍較廣，但JSJM15菌株僅在以豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度較對(duì)照組有所提高。

通過觀察、統(tǒng)計(jì)3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)，分析羊肚菌對(duì)氮源的綜合利用情況，結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.3 The effects of different nitrogen sources on the growth of Morchella spp.mycelia

由表3可知，羊肚菌菌絲生長(zhǎng)可利用的氮源較為廣泛，供試的氮源條件下羊肚菌菌絲生長(zhǎng)較快。豆餅粉、硝酸鈉、玉米粉、蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、牛肉膏為羊肚菌菌絲生長(zhǎng)的優(yōu)選氮源，其綜合菌絲平均生長(zhǎng)速度在 11.46 mm·d-1～13.11 mm·d-1之間，無顯著差異，且菌絲粗壯、濃密。以氯化銨、硫酸銨為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照無顯著差異，但是菌絲較對(duì)照組粗壯、濃密、長(zhǎng)勢(shì)較好。以酒石酸銨為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最慢，為6.72 mm·d-1；在生長(zhǎng)后期形成絨毛狀菌絲，白色，易老化。此外，以硝酸鈉和硝酸鉀作為氮源時(shí)，氣生菌絲生長(zhǎng)茂盛，菌絲粗壯、濃密。

2.4 不同條件下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的生長(zhǎng)情況

2.4.1 不同碳源下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的生長(zhǎng)曲線

比較初篩獲得的最優(yōu)菌株六妹羊肚菌JSJ-M1在不同碳源下的生長(zhǎng)曲線，見圖4。

圖4 六妹羊肚菌JSJ-M1菌株在不同碳源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of Morchella sextelata JSJ-M1 strain on the different carbon sources media

由圖4可知，六妹羊肚菌JSJ-M1菌株在半乳糖、乙醇和木糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速度顯著低于對(duì)照；供試的其他碳源條件下，菌絲生長(zhǎng)趨于線性增長(zhǎng)。

2.4.2 不同氮源下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的生長(zhǎng)曲線

比較初篩獲得的最優(yōu)菌株六妹羊肚菌JSJ-M1在不同氮源下的生長(zhǎng)曲線，見圖5。

圖5 六妹羊肚菌JSJ-M1菌株在不同氮源下的生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of Morchella sextelata JSJ-M1 strain on the different nitrogen sources media

由圖5可知，在以酒石酸銨為氮源時(shí)，六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的菌絲生長(zhǎng)最緩慢；其他供試的氮源條件下，菌絲均趨于線性增長(zhǎng)。

2.4.3 不同溫度對(duì)六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的影響

不同溫度下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的菌落形態(tài)見圖6，菌絲生長(zhǎng)速度見圖7。

由圖6和圖7可知，六妹羊肚菌JSJ-M1菌株能夠在4℃～28℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)。在21℃、24℃條件下菌絲生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)速度分別為13.29 mm·d-1和13.30 mm·d-1。在12℃～18℃時(shí)易形成菌核，菌絲分泌色素較少。在28℃時(shí)不形成菌核，菌絲分泌大量色素，變黃。34℃時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。

圖6 不同溫度下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology of Morchella sextelata JSJ-M1 strain at different temperatures

圖7 不同溫度下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的菌絲生長(zhǎng)速度Fig.7 Mycelial growth rate of Morchella sextelata JSJ-M1 strain at different temperatures

2.4.4 不同pH對(duì)六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的影響

不同pH對(duì)六妹羊肚菌JSJ-M1菌株菌絲生長(zhǎng)速度的影響見圖8。

由圖8可知，適合六妹羊肚菌JSJ-M1菌株菌絲生長(zhǎng)的pH范圍較廣，pH 4.0～9.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)；最適pH為5.5～7.0。

圖8 不同pH條件下六妹羊肚菌JSJ-M1菌株的菌絲生長(zhǎng)速度Fig.8 Mycelial growth rate of Morchella sextelata JSJ-M1 strain under different pH conditions

2.5 無機(jī)鹽對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及菌核形成的影響

2.5.1 單因素試驗(yàn)

不同質(zhì)量濃度KH2PO4的培養(yǎng)基以及不同質(zhì)量濃度MgSO4的培養(yǎng)基中3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)情況及形態(tài)分別見圖9和圖10。

如圖9和圖10所示，在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加不同質(zhì)量濃度的KH2PO4均能夠促進(jìn)3個(gè)菌株的菌核形成；單獨(dú)添加不同質(zhì)量濃度MgSO4時(shí)，除了JSJ-M6菌株在1.0 g·L-1MgSO4培養(yǎng)基中可形成菌核外，其他處理均不能形成菌核。

圖9 不同KH2PO4質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基上3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.9 Mycelial growth of three Morchella strains on medium with different mass concentrations of KH2PO4

圖10 不同MgSO4質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基上3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)情況Fig.10 Mycelial growth of three Morchella strains on medium with different mass concentrations of MgSO4

不同濃度的KH2PO4對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度、菌核形成的影響見圖11。

圖11 不同KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲及菌核的影響Fig.11 The effect of different mass concentrations of KH2PO4on the mycelia and sclerotia of three Morchella strains

如圖 11 所示，在 0.5 g·L-1～3.0 g·L-1KH2PO4培養(yǎng)基中3個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度均低于不添加KH2PO4的培養(yǎng)基，但均有菌核形成。在0.5 g·L-1～2.0 g·L-1KH2PO4培養(yǎng)基中，3個(gè)菌株形成菌核較多；KH2PO4質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1時(shí)形成菌核最多，JSJM1、JSJ-M6、JSJ-M15菌株的菌核干質(zhì)量分別為0.038 g/皿、0.048 g/皿、0.075 g/皿；KH2PO4質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1時(shí)，3個(gè)菌株的菌核形成最少；不添加KH2PO4的培養(yǎng)基中無菌核形成。

不同質(zhì)量濃度的MgSO4對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度的影響見圖12。

如圖12所示，培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1～2.0 g·L-1的 MgSO4時(shí)能夠促進(jìn)羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)。MgSO4質(zhì)量濃度為1.0 g·L-1時(shí)，JSJ-M1和JSJ-M6菌株的菌絲生長(zhǎng)最快，分別達(dá)到18.14 mm·d-1和15.87 mm·d-1；而JSJ-M15菌株在質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，達(dá)到16.16 mm·d-1。

圖12 不同MgSO4質(zhì)量濃度對(duì)3個(gè)羊肚菌菌株菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.12 The effect of different mass concentrations of MgSO4 on the growth of mycelia of three Morchella strains

綜上所述，培養(yǎng)基中添加KH2PO4可以促進(jìn)羊肚菌菌核的形成，且質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1～2.0 g·L-1時(shí)較好，但對(duì)菌絲的生長(zhǎng)沒有顯著的促進(jìn)作用；培養(yǎng)基中添加MgSO4對(duì)羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，且質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1～2.0 g·L-1時(shí)較好，但對(duì)菌核的形成沒有促進(jìn)作用。

2.5.2 雙因素組合試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行雙因素組合試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)3個(gè)菌株的綜合平均菌絲生長(zhǎng)速度及綜合平均菌核干質(zhì)量，結(jié)果見表4。

由表4可知，MgSO4質(zhì)量濃度相同時(shí)，隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；KH2PO4質(zhì)量濃度相同時(shí)，隨著MgSO4質(zhì)量濃度的增加羊肚菌菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在不同組合條件下均有菌核形成，菌核的干質(zhì)量與2種無機(jī)鹽的添加量之間無明顯規(guī)律。

表4 雙因素組合試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of two-factor combination experiment

對(duì)組合試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

由表5可知，MgSO4和KH2PO4對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)有顯著的影響，且2個(gè)因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響存在顯著的交互作用。

表5 雙因素方差分析Tab.5 Two-way analysis of variance

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

結(jié)合菌絲生長(zhǎng)速度、菌核形成的質(zhì)量及生產(chǎn)成本等因素，無機(jī)鹽的添加量應(yīng)優(yōu)先選擇組合1（KH2PO4的質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1、MgSO4的質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1），此條件下羊肚菌的綜合平均菌絲生長(zhǎng)速度為18.93 mm·d-1，綜合平均菌核干質(zhì)量為0.15 g/皿。以此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見圖13。

如圖13所示，CK為不添加任何無機(jī)鹽時(shí)3個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)及菌核情況，綜合平均菌絲生長(zhǎng)速度為14.81 mm·d-1，培養(yǎng)15天后不形成菌核；添加組合1的培養(yǎng)基中3個(gè)菌株的綜合平均菌絲生長(zhǎng)速度為19.03 mm·d-1，培養(yǎng)15天后測(cè)量綜合平均菌核干質(zhì)量為0.17 g/皿。

圖13 組合1培養(yǎng)基中3個(gè)羊肚菌菌株的菌絲生長(zhǎng)及菌核形成情況Fig.13 Mycelial growth and sclerotium formation of three Morchella strains in the medium of group 1

2.6 羊肚菌的菌核形態(tài)

2.6.1 梯棱羊肚菌JSJ-M15菌核形成的形態(tài)變化

羊肚菌菌核在形成過程中形態(tài)不斷發(fā)生變化，以梯棱羊肚菌JSJ-M15為例，其菌核形態(tài)變化見圖14。

如圖14所示，梯棱羊肚菌JSJ-M15菌核形成初期為白色；后期慢慢聚集變大，顏色逐漸變黃，形狀不規(guī)則；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌核細(xì)胞分泌大量色素，菌核顏色呈現(xiàn)淺黃色、黃色、棕褐色、黑色的順序變化。

圖14 梯棱羊肚菌JSJ-M15菌核形成過程Fig.14 The sclerotium formation process of Morchella importuna JSJ-M15

2.6.2 3個(gè)羊肚菌菌株的菌核類型

在對(duì)3個(gè)不同品種的羊肚菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了不同的菌核類型，見圖15。

如圖15所示，3個(gè)羊肚菌菌絲在試管和平板中的菌核形成情況不同，會(huì)出現(xiàn)4種菌核類型及無菌核的現(xiàn)象。出現(xiàn)的菌核類型包括：1）試管I型：菌核聚集在試管壁邊緣；2）試管Ⅱ型：菌核分布在培養(yǎng)基表面；3）平板I型：菌核聚集在接種塊中央，向邊緣擴(kuò)散；4）平板Ⅱ型：菌核在培養(yǎng)基表面分散分布。

圖15 羊肚菌不同的菌核類型Fig.15 Different sclerotium types of Morchella spp.

供試的六妹羊肚菌JSJ-M1、七妹羊肚菌JSJ-M6和梯棱羊肚菌JSJ-M15菌株在相同條件下，菌核的形成率分別為88%、85%和90%。就形成菌核的形態(tài)分布而言，六妹羊肚菌JSJ-M1和七妹羊肚菌JSJM6菌株形成的菌核多為試管Ⅱ型和平板Ⅱ型，梯棱羊肚菌JSJ-M15菌株形成的菌核多為試管Ⅰ型和平板I型。

3 結(jié)論與討論

已有研究證明羊肚菌屬真菌有土壤腐生型和外生菌根共生型2種生態(tài)型[1]，因此，在羊肚菌屬中僅有少數(shù)土壤腐生型品種實(shí)現(xiàn)了人工栽培，其中六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌和七妹羊肚菌是全國(guó)廣泛栽培的羊肚菌種類[2]。刁治民[3]、董雪[4]、柴林山[5]、朱永真[6-7]、熊亞等[8]對(duì)單個(gè)菌株或同一品種不同菌株的碳源、氮源利用情況進(jìn)行研究，但因研究種類不同、菌株不同、栽培地域不同等差異，導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同；這說明不同地區(qū)、不同種類甚至同一物種的不同菌株之間的生物學(xué)特性均存在較大差異。因此，通過選擇3個(gè)主栽品種的不同菌株進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同菌株對(duì)碳源、氮源的利用、無機(jī)鹽的敏感程度以及菌核形成類型等均存在差異。通過比較分析，篩選出3個(gè)菌株通用的較優(yōu)碳源為可溶性淀粉、糊精、幾丁質(zhì)、蔗糖和麥芽糖，較優(yōu)氮源為玉米粉、豆餅粉、硝酸鉀、硝酸鈉等。3個(gè)菌株菌絲生長(zhǎng)最差碳源均為木糖、半乳糖和乙醇，菌絲生長(zhǎng)最差氮源均為酒石酸氨；羊肚菌菌絲對(duì)硝態(tài)氮的利用優(yōu)于銨態(tài)氮。同時(shí)通過對(duì)初篩時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快的六妹羊肚菌JSJ-M1菌株進(jìn)行育種試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株不適宜在以半乳糖、乙醇和木糖為碳源和以酒石酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為18℃～24℃，最適pH為5.5～7.0。在培養(yǎng)基中添加KH2PO4可以促進(jìn)羊肚菌菌核的形成，且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1～2.0 g·L-1時(shí)較好，但對(duì)菌絲的生長(zhǎng)沒有顯著的促進(jìn)作用；在培養(yǎng)基中添加MgSO4對(duì)羊肚菌菌絲的生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1～2.0 g·L-1時(shí)較好，但對(duì)菌核的形成沒有促進(jìn)作用。這一結(jié)論為羊肚菌菌種生產(chǎn)、液體培養(yǎng)條件優(yōu)化等提供參考依據(jù)。

Buscot等[9]認(rèn)為，羊肚菌在人工栽培條件下能夠形成2種菌核：一種形成時(shí)間早并簇集分布在培養(yǎng)皿邊緣，稱為簇集菌核，簇集菌核可能與形成子實(shí)體有關(guān)；另一種形成晚且分散分布，稱為分散菌核，分散菌核主要起儲(chǔ)藏營(yíng)養(yǎng)和抵御低溫的作用。此次供試的3個(gè)羊肚菌菌株在同一培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況、菌核形成能力以及菌核形成類型也不同，六妹羊肚菌和七妹羊肚菌2個(gè)品種形成的菌核多為試管Ⅱ型和平板Ⅱ型，梯棱羊肚菌品種形成的菌核多為試管Ⅰ型和平板I型。Volk[10]認(rèn)為羊肚菌形成菌核的條件是低溫培養(yǎng)或養(yǎng)分枯竭。試驗(yàn)結(jié)果表明，較低溫有利于菌核的形成，4℃～21℃易形成菌核而且數(shù)量較多，高于24℃不能形成菌核，而且菌絲變黃，老化，分泌大量色素。

羊肚菌的菌核在菌種生產(chǎn)、栽培時(shí)常有發(fā)生，菌核的形成與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基厚度、培養(yǎng)基pH、培養(yǎng)溫度、氧氣、光照、無機(jī)鹽等許多因素密切相關(guān)[11-14]。在進(jìn)行單因素試驗(yàn)，特別是以菌核為指標(biāo)時(shí)，必須控制其他因素一致，否則結(jié)果可能差異比較大。這也可能是造成不同研究者的結(jié)果之間差異較大的原因之一。目前，雖然對(duì)羊肚菌的生物學(xué)特性研究較多，但碳氮比、溫度、pH、氧氣等影響菌絲生長(zhǎng)、菌核形成的因素之間的相互作用關(guān)系，以及菌絲吸收營(yíng)養(yǎng)的內(nèi)在機(jī)制，誘發(fā)菌絲向菌核轉(zhuǎn)變的機(jī)制等還有待進(jìn)一步深入研究。