梯棱羊肚菌單孢菌株田間混合栽培出菇試驗(yàn)*

賀國強(qiáng)

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）屬于黑色羊肚菌類群，隸屬于子囊菌門（Ascomycota） 盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchel laceae） 羊肚菌屬（Morchella），營腐生營養(yǎng)類型，屬于羊肚菌中可馴化的主要品種之一[1]，目前已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模栽培。梯棱羊肚菌子囊孢子發(fā)育過程的核行為觀察分析表明，梯棱羊肚菌的子囊孢子雖為多核體，但其細(xì)胞核均是來自早期減數(shù)分裂后進(jìn)行有絲分裂形成的8個細(xì)胞核中的1個，因而其子囊孢子為同核體[2]。通過分析交配型基因，已證明梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合真菌[3-5]。其每個單孢含有1種交配型基因（MAT1-1-1或MAT1-2-1），且2種不同交配型基因的相互作用可能是完成生活史所必須的。這為不同交配型菌株間的雜交出菇提供了遺傳基礎(chǔ)。

目前栽培羊肚菌普遍采用組織分離獲得菌種，但組織分離、轉(zhuǎn)代次數(shù)等因素會導(dǎo)致羊肚菌菌株其中1種交配型基因逐漸減少或衰退[6-7]，無法完成有性生殖的過程，從而無法出菇。此外，羊肚菌交配型基因預(yù)測出菇還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。擔(dān)子菌的雜交育種通常可以以單孢之間拮抗線的鎖狀聯(lián)合為標(biāo)記，但羊肚菌屬于子囊菌，菌絲無明顯的鎖狀聯(lián)合，難以從實(shí)驗(yàn)室階段得出是否雜交成功的結(jié)論。羊肚菌基因型的鑒定已經(jīng)是較為成熟的技術(shù)手段，因此，通過將不同基因型的羊肚菌制成單孢固體菌種，再于田間混合播種，可直接觀測結(jié)果，極大地方便了羊肚菌田間雜交育種。

通過顯微操作法分離梯棱羊肚菌親本菌株，收集得到其單孢群體并測定單孢群體的交配型，隨后對單孢群體間進(jìn)行田間條件下的隨機(jī)配對雜交，篩選得到優(yōu)勢組合和含有2種交配型基因的菌株，以期為羊肚菌育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及儀器、試劑

梯棱羊肚菌栽培菌株M-Y15、M-CY、M-HM為親本菌株（F0），源自商業(yè)化栽培菌株和野生馴化菌株，保存于北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站食用菌實(shí)驗(yàn)室。采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合ITS序列分析確證是梯棱羊肚菌。利用自然彈射法收集羊肚菌的子囊孢子。

VS-1300L-U超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S1000PCR儀，美國伯樂公司；JY-SP5電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY04S-3B凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。所用試劑包括PDA培養(yǎng)基，Oxoid公司；Tris，賽默飛世爾科技公司；HCl、EDTA、苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇，購自國藥集團(tuán)；ddH2O，天根生化科技（北京）有限公司等。

1.2 單孢分離及純化

采用顯微操作技術(shù)分離羊肚菌單個子囊孢子，分離方法參照參考文獻(xiàn)[8]。將羊肚菌孢子用無菌的20%甘油水溶液懸浮，然后在40倍顯微鏡視野下用毛細(xì)管挑針吸住分散的單個子囊孢子，抬針，將吸取的子囊孢子在無菌操作環(huán)境下轉(zhuǎn)移（小洗耳球吹出） 至PDA培養(yǎng)基平板，置于23℃避光培養(yǎng)，約36 h～48 h可見萌發(fā)形成的單菌落。肉眼觀察平皿內(nèi)菌絲，并使用顯微鏡觀察，若明顯由一個子囊孢子萌發(fā)形成輻射狀菌絲，基本可視為單孢菌株。無菌操作及時切取菌絲生長末端的單根菌絲，轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基內(nèi)，即獲得純化的單孢菌絲。單孢群體（F1）編號為M-n，M表示親本菌株名稱；n為數(shù)字編號，代表第n個單孢。

1.3 交配型基因的測定

羊肚菌DNA的提取參照參考文獻(xiàn)[8]。菌絲體或組織塊經(jīng)液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%，PVP 2%，Tris-HCl 100 mmol·L-1， EDTA 20 mmol·L-1， NaCl 1.4 mol·L-1）裂解獲得DNA粗提液，經(jīng)V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1的混合液去除蛋白后，再經(jīng)乙醇沉淀、RNAase消解去除RNA污染，最終獲得純凈DNA，稀釋至50 ng·μL-1，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

交配型基因的擴(kuò)增引物為MAT1、MAT2[8]。擴(kuò)增目標(biāo)片段大小分別為1 837 bp和1 740 bp，分別為MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全長。擴(kuò)增體系 （25 μL） 包括 2 × PCR mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的 MAT1或 MAT2引物各 1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 栽培出菇

羊肚菌人工栽培方法參照參考文獻(xiàn)[9]。菌種制備采用三級菌種制作方案，栽培種和外源營養(yǎng)袋配方參照參考文獻(xiàn)[10]。通過復(fù)篩獲得菌絲生長快且產(chǎn)核能力強(qiáng)的單孢菌株，根據(jù)交配型基因類型分為2組。從每個組內(nèi)隨機(jī)選取一個菌株，即選取不同交配型基因不同的單孢之間隨機(jī)進(jìn)行組合配對，并分別在2個組內(nèi)隨機(jī)挑選2株混合播種，進(jìn)行栽培出菇試驗(yàn)。每個處理3個小區(qū)，每個小區(qū)面積0.5 m2。栽培試驗(yàn)于2020年11月～2021年4月在北京市大興區(qū)青云店鎮(zhèn)羊肚菌生產(chǎn)基地進(jìn)行。播種時間根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂驐l件而定（11月上旬），播種量為0.5 kg·m-2；播種后 7 d～20 d，進(jìn)行 1.2 kg·m-2的外源營養(yǎng)袋補(bǔ)充處理；出菇前20天進(jìn)行撤袋、催菇操作。記錄出菇時間、出菇密度、出菇時土壤及環(huán)境溫度。栽培出菇后的子囊果為F2群體。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

待子囊果7分～8分成熟后，全部采收，統(tǒng)計(jì)出菇個數(shù)、鮮菇產(chǎn)量。測定鮮子囊果的菌蓋長度和寬度、菌柄的長度和直徑。測定每個組合的全部子囊果，取平均值。顯著性采用SPSS 16.0軟件中Duncan式新復(fù)極差法進(jìn)行分析。最后將子囊果自然晾干，稱量獲得干質(zhì)量。折干率（D，%）指采收的食用菌經(jīng)晾曬（或烘干）后的比重，其計(jì)算公式為：

式中：W1為晾干（或烘干）后子囊果質(zhì)量（g·m-2）；W2為晾干（或烘干）前鮮子囊果質(zhì)量（g·m-2），即鮮菇產(chǎn)量。

根據(jù)陳影等[11]的研究，梯棱羊肚菌的6個子實(shí)體數(shù)量性狀（菌蓋的長度和寬度、長度與寬度比值、厚度以及菌柄的長度和直徑）基本符合正態(tài)分布，可以作為羊肚菌子實(shí)體數(shù)量性狀的評價指標(biāo)。參照參考文獻(xiàn)[12]的賦分法并稍作改進(jìn)，對菌蓋長度、菌柄長度、菌蓋直徑、菌柄直徑賦分評價，總得分高者為性狀優(yōu)良的子囊果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢菌株的交配型基因分型

試驗(yàn)獲得的單孢菌株的基因型檢測結(jié)果見表1。

表1 單孢菌株的交配型基因分型Tab.1 Analysis of mating type genes of monospora strains

由表1可知，分離得到的單孢菌株只含有2種交配型基因中的1種。根據(jù)交配型基因的不同分為2組。

2.2 單孢雜交組合的出菇情況

在田間將含有不同交配型基因的單孢菌株兩兩混合播種，并在分別在2個組內(nèi)隨機(jī)挑選2株進(jìn)行混合播種，共配制組合190對。經(jīng)田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)，100個不同交配型單孢混合播種組合及90個同交配型混合播種組合全部可以觀察到菌絲生長，并產(chǎn)生“菌霜”（分生孢子），有73個組合能形成直徑1 mm～2 mm的白色圓球形原基，但最終僅有55個組合發(fā)育成成熟的子囊果。在這55個組合中，每個組合在0.5 m2試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 子囊果正常生長發(fā)育組合的統(tǒng)計(jì)Tab.2 Data statistics of combinations that normally grew and developed

如表2所示，在能發(fā)育成熟子囊果的55個組合中，不同交配型混合播種的組合為44個，占4/5；相同交配型混合播種的組合為11個，占1/5。各組合收獲得子囊果個數(shù)差異較大，從2個（組合6、組合8、組合29） 到19個（組合49），反映了不同組合間出菇的能力不同。各組合0.5 m2區(qū)域內(nèi)鮮子囊果總質(zhì)量最少為20.00 g（組合20），最多為389.95 g（組合15）；干子囊果總質(zhì)量最少為5.00 g（組合20），最多為24.75 g（組合48）。單個子囊果鮮質(zhì)量為6.67 g～46.67 g；單個子囊果干質(zhì)量為0.72 g～6.19 g。

2.3 單孢混合播種組合子囊果優(yōu)選情況

實(shí)際生產(chǎn)中，羊肚菌的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)最為重要。因此，對能形成正常子囊果的55個組合的產(chǎn)量進(jìn)行分析，根據(jù)各組合的鮮菇和干菇產(chǎn)量，篩選出鮮菇產(chǎn)量大于300 g·m-2（每667平方米日光溫室按有效栽培面積450 m2計(jì)算，折合鮮菇產(chǎn)量為135 kg）和干菇產(chǎn)量大于24 g·m-2的雜交組合，共15個。優(yōu)選組合的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 篩選出15個組合的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Yield statistics of 15 combinations selected

由表3可知，其中組合15（CY-21×HM-13）鮮菇產(chǎn)量達(dá)788.91 g·m-2，折合每667平方米鮮菇產(chǎn)量為355.01 kg；其次組合39（Y15-8×HM-12） 鮮菇產(chǎn)量達(dá)620.12 g·m-2，折合每667平方米鮮菇產(chǎn)量為279.05 kg。篩選出的15個組合子囊果折干率為3.94%～12.61%。

篩選出的高產(chǎn)量15個組合的子實(shí)體性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

表4 篩選出的15個組合的子囊果性狀統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表4可知，15個雜交組合中，菌蓋平均長度最小為6.42 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為10.26 cm（組合39，Y15-8×HM-12）；菌柄平均長度最小為4.02 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為9.6 cm（組合41，Y15-8×HM-14）；菌蓋平均直徑最小為2.58 cm（組合15，HM-13×CY-2），最大為4.67 cm（組合49，Y15-16×HM-14）；菌柄平均直徑最小為0.92 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為2.58 cm（組合41，Y15-8×HM-14）。通過初步比較，組合41、組合49、組合39在單一性狀中表現(xiàn)尤為突出。

商品性優(yōu)良的羊肚菌子囊果標(biāo)準(zhǔn)為個大、菇型松塔型，反映在菌蓋長度、菌柄長度、菌蓋直徑、菌柄直徑值的大小，因此對這些指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，其評價結(jié)果見表5。

表5 篩選出的15個組合的子囊果性狀賦分統(tǒng)計(jì)Tab.5 Score statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表5可知，15個組合中得分由高到低排列依次為組合41（Y15-8×HM-14）、組合49（Y15-16×HM-14）、組合 39（Y15-8×HM-12）、組合16（CY-21×HM-14） 和組合 5（CY-1×HM-14）、組合 40（Y15-8×HM-13）、組合 53（Y15-22×HM-12）、組合 4（CY-1×HM13）、組合 54（Y15-22×HM-13）和組合 48（Y15-16×HM-13）、組合 36（HM24×Y15-1）、組合 10（HM-14×CY10）、組合13（CY21×Y15-24）、組合 15（CY21×HM13）、組合 1（CY-1×Y15-1）。得分越高表明該組合子囊果形狀越好，具有優(yōu)質(zhì)潛力。因此，選取得分超過20的組合，即組合41（Y15-8×HM14）、組合49（Y15-16×HM14）、組合39（Y15-8×HM12） 作為優(yōu)選的組合。

2.3 優(yōu)選組合子囊果組織分離菌株交配型基因檢測

優(yōu)選組合子囊果組織分離菌株交配型基因檢測結(jié)果電泳圖見圖1。

由圖1所示，對優(yōu)選的3個子實(shí)體進(jìn)行組織分離，獲得3個菌株，經(jīng)檢測均含有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因，可以作為下一步品種篩選的菌株使用。

圖1 優(yōu)選組合交配型基因PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection results of mating type genes in selected combinations

3 討論與結(jié)論

3.1 羊肚菌單孢田間雜交可以用于品種選育

羊肚菌屬于子囊菌，缺少香菇（Lentinus edodes）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 等擔(dān)子菌菌絲形成的鎖狀聯(lián)合，難以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過菌絲的觀察而得出是否雜交成功的結(jié)果。因此，羊肚菌交配型基因預(yù)測出菇還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，只能作為必要條件而不是充要條件。將羊肚菌單孢菌株在田間混合播種，有73個組合能形成直徑1 mm～2 mm的白色圓球形原基，但最終僅有55個組合發(fā)育成成熟的子囊果。因此可以直接通過觀察原基形成和子囊果的發(fā)育作為品種篩選的直觀指標(biāo)，簡單易行，并且方法可靠。但是試驗(yàn)中相同交配型的單孢混合播種也可以形成原基，其中一些也可以正常發(fā)育成子囊果，這與梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合真菌[3-5]，需要MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因才能完成生活史的結(jié)論不一致。柴紅梅等研究表明單孢分離菌株的異核不對稱特揭示梯棱羊肚菌為假同宗結(jié)合真菌[13]。因此，梯棱羊肚菌可能存在“單孢菌株出菇”的現(xiàn)象。有研究推測，分生孢子可能扮演“不動精子”的角色，從而發(fā)揮作用[14-15]。由于此次試驗(yàn)組合數(shù)量多，不同單孢組合間未完全進(jìn)行區(qū)隔，各組合的分生孢子可能隨空氣流動，從而提供不同的交配型基因。后續(xù)研究中，可以進(jìn)行單孢菌株的完全區(qū)隔試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

3.2 綜合分析評價子囊果形狀更為科學(xué)

對于羊肚菌農(nóng)藝性狀包括菌絲長勢、抗病性、產(chǎn)量表現(xiàn)等進(jìn)行分析。190個組合中僅有73個形成原基，出菇率為38%，但在子囊果發(fā)育過程中有18個組合的子囊果發(fā)生敗育，最終發(fā)育成子囊果的組合比例僅為29%。因此，抗逆性是品種選育的一個重要指標(biāo)。

在羊肚菌的栽培中，產(chǎn)量是評價菌種特性的極其重要的指標(biāo)。但是子囊果的性狀也尤為重要[11]，也是產(chǎn)品具有商品性的重要參考。農(nóng)藝優(yōu)良性狀是指具有許多可辨別性狀的最佳表現(xiàn)，除產(chǎn)量外，還包括一系列表型，如菌絲生長階段的萌發(fā)勢、營養(yǎng)勢，子囊果生長階段包括抗病性、子囊果形狀、單菇質(zhì)量、菌蓋長、菌蓋直徑、菌柄長度、菌柄直徑。因此，研究以產(chǎn)量為初篩指標(biāo)，篩選出產(chǎn)量高于300 g·m-2的組合有15個，對菌蓋長度、菌柄長度、菌蓋直徑、菌柄直徑等性狀進(jìn)行綜合評價賦分后，篩選出得分前3位的優(yōu)選組合為組合41（Y15-8×HM-14）、組合 49（Y15-16×HM-14） 和組合 39（Y15-8×HM-12）。

3.3 羊肚菌單孢雜交方法可獲得雜交菌株

包括羊肚菌在內(nèi)的大多數(shù)子囊菌真菌，交配型基因有很重要的作用，是有性生殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此交配型位點(diǎn)基因是羊肚菌品種選育中重要的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有的生活史表明，僅MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因同時存在，羊肚菌才能完成有性生殖過程，并成功形成可育的子實(shí)體（子囊果）[12]。單孢群體F1只含有1種交配型基因，可以采用田間混合播種的方法使2種交配型菌絲結(jié)合，從而完成有性生殖。

目前在羊肚菌的栽培中，普遍沿用擔(dān)子菌的思維模式，通過采用組織分離的方法獲得栽培菌株用于生產(chǎn)中，但羊肚菌的菌絲細(xì)胞存在多個細(xì)胞核[10]，而且隨著組織分離和轉(zhuǎn)代的次數(shù)增加，羊肚菌細(xì)胞核會發(fā)生不均等遷移，導(dǎo)致菌株中的其中1種基因型逐漸減少或衰退[6-7]，無法完成有性生殖的過程，從而無法出菇。因此，在品種選育過程中通過組織分離獲得優(yōu)選子囊果的組織分離菌絲體必須經(jīng)過交配型基因的檢測，確保同時含有2種交配型基因，才能用于下一步生產(chǎn)中。

此次試驗(yàn)梯棱羊肚菌F1單孢菌株間混合播種組合出菇率為38%，發(fā)育成子囊果的比例為29%。通過子實(shí)體性狀和產(chǎn)量分析，從F2出菇子囊果篩選出產(chǎn)量較高的15個組合，平均單產(chǎn)為0.30 kg·m-2～0.78 kg·m-2；優(yōu)選出3個菇型性狀的組合組合41（Y15-8×HM-14）、組合 49（Y15-16×HM-14） 和組合39（Y15-8×HM-12）。從所篩選的3個組合子囊果經(jīng)過組織分離得到3個雜交菌株，交配型檢測表明均含有2種交配型基因，該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為羊肚菌單孢雜交育種工作奠定了基礎(chǔ)。