梯棱羊肚菌單孢菌株田間混合栽培出菇試驗(yàn)*

賀國(guó)強(qiáng)

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）屬于黑色羊肚菌類群，隸屬于子囊菌門（Ascomycota） 盤菌綱（Pezizomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchel laceae） 羊肚菌屬（Morchella），營(yíng)腐生營(yíng)養(yǎng)類型，屬于羊肚菌中可馴化的主要品種之一[1]，目前已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模栽培。梯棱羊肚菌子囊孢子發(fā)育過程的核行為觀察分析表明，梯棱羊肚菌的子囊孢子雖為多核體，但其細(xì)胞核均是來自早期減數(shù)分裂后進(jìn)行有絲分裂形成的8個(gè)細(xì)胞核中的1個(gè)，因而其子囊孢子為同核體[2]。通過分析交配型基因，已證明梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合真菌[3-5]。其每個(gè)單孢含有1種交配型基因（MAT1-1-1或MAT1-2-1），且2種不同交配型基因的相互作用可能是完成生活史所必須的。這為不同交配型菌株間的雜交出菇提供了遺傳基礎(chǔ)。

目前栽培羊肚菌普遍采用組織分離獲得菌種，但組織分離、轉(zhuǎn)代次數(shù)等因素會(huì)導(dǎo)致羊肚菌菌株其中1種交配型基因逐漸減少或衰退[6-7]，無法完成有性生殖的過程，從而無法出菇。此外，羊肚菌交配型基因預(yù)測(cè)出菇還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段。擔(dān)子菌的雜交育種通?？梢砸詥捂咧g拮抗線的鎖狀聯(lián)合為標(biāo)記，但羊肚菌屬于子囊菌，菌絲無明顯的鎖狀聯(lián)合，難以從實(shí)驗(yàn)室階段得出是否雜交成功的結(jié)論。羊肚菌基因型的鑒定已經(jīng)是較為成熟的技術(shù)手段，因此，通過將不同基因型的羊肚菌制成單孢固體菌種，再于田間混合播種，可直接觀測(cè)結(jié)果，極大地方便了羊肚菌田間雜交育種。

通過顯微操作法分離梯棱羊肚菌親本菌株，收集得到其單孢群體并測(cè)定單孢群體的交配型，隨后對(duì)單孢群體間進(jìn)行田間條件下的隨機(jī)配對(duì)雜交，篩選得到優(yōu)勢(shì)組合和含有2種交配型基因的菌株，以期為羊肚菌育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及儀器、試劑

梯棱羊肚菌栽培菌株M-Y15、M-CY、M-HM為親本菌株（F0），源自商業(yè)化栽培菌株和野生馴化菌株，保存于北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站食用菌實(shí)驗(yàn)室。采用形態(tài)學(xué)特征結(jié)合ITS序列分析確證是梯棱羊肚菌。利用自然彈射法收集羊肚菌的子囊孢子。

VS-1300L-U超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S1000PCR儀，美國(guó)伯樂公司；JY-SP5電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY04S-3B凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。所用試劑包括PDA培養(yǎng)基，Oxoid公司；Tris，賽默飛世爾科技公司；HCl、EDTA、苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇，購自國(guó)藥集團(tuán)；ddH2O，天根生化科技（北京）有限公司等。

1.2 單孢分離及純化

采用顯微操作技術(shù)分離羊肚菌單個(gè)子囊孢子，分離方法參照參考文獻(xiàn)[8]。將羊肚菌孢子用無菌的20%甘油水溶液懸浮，然后在40倍顯微鏡視野下用毛細(xì)管挑針吸住分散的單個(gè)子囊孢子，抬針，將吸取的子囊孢子在無菌操作環(huán)境下轉(zhuǎn)移（小洗耳球吹出） 至PDA培養(yǎng)基平板，置于23℃避光培養(yǎng)，約36 h～48 h可見萌發(fā)形成的單菌落。肉眼觀察平皿內(nèi)菌絲，并使用顯微鏡觀察，若明顯由一個(gè)子囊孢子萌發(fā)形成輻射狀菌絲，基本可視為單孢菌株。無菌操作及時(shí)切取菌絲生長(zhǎng)末端的單根菌絲，轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基內(nèi)，即獲得純化的單孢菌絲。單孢群體（F1）編號(hào)為M-n，M表示親本菌株名稱；n為數(shù)字編號(hào)，代表第n個(gè)單孢。

1.3 交配型基因的測(cè)定

羊肚菌DNA的提取參照參考文獻(xiàn)[8]。菌絲體或組織塊經(jīng)液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%，PVP 2%，Tris-HCl 100 mmol·L-1， EDTA 20 mmol·L-1， NaCl 1.4 mol·L-1）裂解獲得DNA粗提液，經(jīng)V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1的混合液去除蛋白后，再經(jīng)乙醇沉淀、RNAase消解去除RNA污染，最終獲得純凈DNA，稀釋至50 ng·μL-1，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

交配型基因的擴(kuò)增引物為MAT1、MAT2[8]。擴(kuò)增目標(biāo)片段大小分別為1 837 bp和1 740 bp，分別為MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全長(zhǎng)。擴(kuò)增體系 （25 μL） 包括 2 × PCR mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的 MAT1或 MAT2引物各 1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。所有擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.4 栽培出菇

羊肚菌人工栽培方法參照參考文獻(xiàn)[9]。菌種制備采用三級(jí)菌種制作方案，栽培種和外源營(yíng)養(yǎng)袋配方參照參考文獻(xiàn)[10]。通過復(fù)篩獲得菌絲生長(zhǎng)快且產(chǎn)核能力強(qiáng)的單孢菌株，根據(jù)交配型基因類型分為2組。從每個(gè)組內(nèi)隨機(jī)選取一個(gè)菌株，即選取不同交配型基因不同的單孢之間隨機(jī)進(jìn)行組合配對(duì)，并分別在2個(gè)組內(nèi)隨機(jī)挑選2株混合播種，進(jìn)行栽培出菇試驗(yàn)。每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積0.5 m2。栽培試驗(yàn)于2020年11月～2021年4月在北京市大興區(qū)青云店鎮(zhèn)羊肚菌生產(chǎn)基地進(jìn)行。播種時(shí)間根據(jù)當(dāng)?shù)貧夂驐l件而定（11月上旬），播種量為0.5 kg·m-2；播種后 7 d～20 d，進(jìn)行 1.2 kg·m-2的外源營(yíng)養(yǎng)袋補(bǔ)充處理；出菇前20天進(jìn)行撤袋、催菇操作。記錄出菇時(shí)間、出菇密度、出菇時(shí)土壤及環(huán)境溫度。栽培出菇后的子囊果為F2群體。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

待子囊果7分～8分成熟后，全部采收，統(tǒng)計(jì)出菇個(gè)數(shù)、鮮菇產(chǎn)量。測(cè)定鮮子囊果的菌蓋長(zhǎng)度和寬度、菌柄的長(zhǎng)度和直徑。測(cè)定每個(gè)組合的全部子囊果，取平均值。顯著性采用SPSS 16.0軟件中Duncan式新復(fù)極差法進(jìn)行分析。最后將子囊果自然晾干，稱量獲得干質(zhì)量。折干率（D，%）指采收的食用菌經(jīng)晾曬（或烘干）后的比重，其計(jì)算公式為：

式中：W1為晾干（或烘干）后子囊果質(zhì)量（g·m-2）；W2為晾干（或烘干）前鮮子囊果質(zhì)量（g·m-2），即鮮菇產(chǎn)量。

根據(jù)陳影等[11]的研究，梯棱羊肚菌的6個(gè)子實(shí)體數(shù)量性狀（菌蓋的長(zhǎng)度和寬度、長(zhǎng)度與寬度比值、厚度以及菌柄的長(zhǎng)度和直徑）基本符合正態(tài)分布，可以作為羊肚菌子實(shí)體數(shù)量性狀的評(píng)價(jià)指標(biāo)。參照參考文獻(xiàn)[12]的賦分法并稍作改進(jìn)，對(duì)菌蓋長(zhǎng)度、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、菌柄直徑賦分評(píng)價(jià)，總得分高者為性狀優(yōu)良的子囊果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢菌株的交配型基因分型

試驗(yàn)獲得的單孢菌株的基因型檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 單孢菌株的交配型基因分型Tab.1 Analysis of mating type genes of monospora strains

由表1可知，分離得到的單孢菌株只含有2種交配型基因中的1種。根據(jù)交配型基因的不同分為2組。

2.2 單孢雜交組合的出菇情況

在田間將含有不同交配型基因的單孢菌株兩兩混合播種，并在分別在2個(gè)組內(nèi)隨機(jī)挑選2株進(jìn)行混合播種，共配制組合190對(duì)。經(jīng)田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)，100個(gè)不同交配型單孢混合播種組合及90個(gè)同交配型混合播種組合全部可以觀察到菌絲生長(zhǎng)，并產(chǎn)生“菌霜”（分生孢子），有73個(gè)組合能形成直徑1 mm～2 mm的白色圓球形原基，但最終僅有55個(gè)組合發(fā)育成成熟的子囊果。在這55個(gè)組合中，每個(gè)組合在0.5 m2試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 子囊果正常生長(zhǎng)發(fā)育組合的統(tǒng)計(jì)Tab.2 Data statistics of combinations that normally grew and developed

如表2所示，在能發(fā)育成熟子囊果的55個(gè)組合中，不同交配型混合播種的組合為44個(gè)，占4/5；相同交配型混合播種的組合為11個(gè)，占1/5。各組合收獲得子囊果個(gè)數(shù)差異較大，從2個(gè)（組合6、組合8、組合29） 到19個(gè)（組合49），反映了不同組合間出菇的能力不同。各組合0.5 m2區(qū)域內(nèi)鮮子囊果總質(zhì)量最少為20.00 g（組合20），最多為389.95 g（組合15）；干子囊果總質(zhì)量最少為5.00 g（組合20），最多為24.75 g（組合48）。單個(gè)子囊果鮮質(zhì)量為6.67 g～46.67 g；單個(gè)子囊果干質(zhì)量為0.72 g～6.19 g。

2.3 單孢混合播種組合子囊果優(yōu)選情況

實(shí)際生產(chǎn)中，羊肚菌的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)最為重要。因此，對(duì)能形成正常子囊果的55個(gè)組合的產(chǎn)量進(jìn)行分析，根據(jù)各組合的鮮菇和干菇產(chǎn)量，篩選出鮮菇產(chǎn)量大于300 g·m-2（每667平方米日光溫室按有效栽培面積450 m2計(jì)算，折合鮮菇產(chǎn)量為135 kg）和干菇產(chǎn)量大于24 g·m-2的雜交組合，共15個(gè)。優(yōu)選組合的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)見表3。

表3 篩選出15個(gè)組合的產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Yield statistics of 15 combinations selected

由表3可知，其中組合15（CY-21×HM-13）鮮菇產(chǎn)量達(dá)788.91 g·m-2，折合每667平方米鮮菇產(chǎn)量為355.01 kg；其次組合39（Y15-8×HM-12） 鮮菇產(chǎn)量達(dá)620.12 g·m-2，折合每667平方米鮮菇產(chǎn)量為279.05 kg。篩選出的15個(gè)組合子囊果折干率為3.94%～12.61%。

篩選出的高產(chǎn)量15個(gè)組合的子實(shí)體性狀統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

表4 篩選出的15個(gè)組合的子囊果性狀統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表4可知，15個(gè)雜交組合中，菌蓋平均長(zhǎng)度最小為6.42 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為10.26 cm（組合39，Y15-8×HM-12）；菌柄平均長(zhǎng)度最小為4.02 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為9.6 cm（組合41，Y15-8×HM-14）；菌蓋平均直徑最小為2.58 cm（組合15，HM-13×CY-2），最大為4.67 cm（組合49，Y15-16×HM-14）；菌柄平均直徑最小為0.92 cm（組合1，CY-1×Y15-1），最大為2.58 cm（組合41，Y15-8×HM-14）。通過初步比較，組合41、組合49、組合39在單一性狀中表現(xiàn)尤為突出。

商品性優(yōu)良的羊肚菌子囊果標(biāo)準(zhǔn)為個(gè)大、菇型松塔型，反映在菌蓋長(zhǎng)度、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、菌柄直徑值的大小，因此對(duì)這些指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

表5 篩選出的15個(gè)組合的子囊果性狀賦分統(tǒng)計(jì)Tab.5 Score statistics of ascocarp characters of 15 selected combinations

由表5可知，15個(gè)組合中得分由高到低排列依次為組合41（Y15-8×HM-14）、組合49（Y15-16×HM-14）、組合 39（Y15-8×HM-12）、組合16（CY-21×HM-14） 和組合 5（CY-1×HM-14）、組合 40（Y15-8×HM-13）、組合 53（Y15-22×HM-12）、組合 4（CY-1×HM13）、組合 54（Y15-22×HM-13）和組合 48（Y15-16×HM-13）、組合 36（HM24×Y15-1）、組合 10（HM-14×CY10）、組合13（CY21×Y15-24）、組合 15（CY21×HM13）、組合 1（CY-1×Y15-1）。得分越高表明該組合子囊果形狀越好，具有優(yōu)質(zhì)潛力。因此，選取得分超過20的組合，即組合41（Y15-8×HM14）、組合49（Y15-16×HM14）、組合39（Y15-8×HM12） 作為優(yōu)選的組合。

2.3 優(yōu)選組合子囊果組織分離菌株交配型基因檢測(cè)

優(yōu)選組合子囊果組織分離菌株交配型基因檢測(cè)結(jié)果電泳圖見圖1。

由圖1所示，對(duì)優(yōu)選的3個(gè)子實(shí)體進(jìn)行組織分離，獲得3個(gè)菌株，經(jīng)檢測(cè)均含有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因，可以作為下一步品種篩選的菌株使用。

圖1 優(yōu)選組合交配型基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR detection results of mating type genes in selected combinations

3 討論與結(jié)論

3.1 羊肚菌單孢田間雜交可以用于品種選育

羊肚菌屬于子囊菌，缺少香菇（Lentinus edodes）、雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 等擔(dān)子菌菌絲形成的鎖狀聯(lián)合，難以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過菌絲的觀察而得出是否雜交成功的結(jié)果。因此，羊肚菌交配型基因預(yù)測(cè)出菇還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，只能作為必要條件而不是充要條件。將羊肚菌單孢菌株在田間混合播種，有73個(gè)組合能形成直徑1 mm～2 mm的白色圓球形原基，但最終僅有55個(gè)組合發(fā)育成成熟的子囊果。因此可以直接通過觀察原基形成和子囊果的發(fā)育作為品種篩選的直觀指標(biāo)，簡(jiǎn)單易行，并且方法可靠。但是試驗(yàn)中相同交配型的單孢混合播種也可以形成原基，其中一些也可以正常發(fā)育成子囊果，這與梯棱羊肚菌為異宗結(jié)合真菌[3-5]，需要MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因才能完成生活史的結(jié)論不一致。柴紅梅等研究表明單孢分離菌株的異核不對(duì)稱特揭示梯棱羊肚菌為假同宗結(jié)合真菌[13]。因此，梯棱羊肚菌可能存在“單孢菌株出菇”的現(xiàn)象。有研究推測(cè)，分生孢子可能扮演“不動(dòng)精子”的角色，從而發(fā)揮作用[14-15]。由于此次試驗(yàn)組合數(shù)量多，不同單孢組合間未完全進(jìn)行區(qū)隔，各組合的分生孢子可能隨空氣流動(dòng)，從而提供不同的交配型基因。后續(xù)研究中，可以進(jìn)行單孢菌株的完全區(qū)隔試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

3.2 綜合分析評(píng)價(jià)子囊果形狀更為科學(xué)

對(duì)于羊肚菌農(nóng)藝性狀包括菌絲長(zhǎng)勢(shì)、抗病性、產(chǎn)量表現(xiàn)等進(jìn)行分析。190個(gè)組合中僅有73個(gè)形成原基，出菇率為38%，但在子囊果發(fā)育過程中有18個(gè)組合的子囊果發(fā)生敗育，最終發(fā)育成子囊果的組合比例僅為29%。因此，抗逆性是品種選育的一個(gè)重要指標(biāo)。

在羊肚菌的栽培中，產(chǎn)量是評(píng)價(jià)菌種特性的極其重要的指標(biāo)。但是子囊果的性狀也尤為重要[11]，也是產(chǎn)品具有商品性的重要參考。農(nóng)藝優(yōu)良性狀是指具有許多可辨別性狀的最佳表現(xiàn)，除產(chǎn)量外，還包括一系列表型，如菌絲生長(zhǎng)階段的萌發(fā)勢(shì)、營(yíng)養(yǎng)勢(shì)，子囊果生長(zhǎng)階段包括抗病性、子囊果形狀、單菇質(zhì)量、菌蓋長(zhǎng)、菌蓋直徑、菌柄長(zhǎng)度、菌柄直徑。因此，研究以產(chǎn)量為初篩指標(biāo)，篩選出產(chǎn)量高于300 g·m-2的組合有15個(gè)，對(duì)菌蓋長(zhǎng)度、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋直徑、菌柄直徑等性狀進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)賦分后，篩選出得分前3位的優(yōu)選組合為組合41（Y15-8×HM-14）、組合 49（Y15-16×HM-14） 和組合 39（Y15-8×HM-12）。

3.3 羊肚菌單孢雜交方法可獲得雜交菌株

包括羊肚菌在內(nèi)的大多數(shù)子囊菌真菌，交配型基因有很重要的作用，是有性生殖的關(guān)鍵調(diào)控因子，因此交配型位點(diǎn)基因是羊肚菌品種選育中重要的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有的生活史表明，僅MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因同時(shí)存在，羊肚菌才能完成有性生殖過程，并成功形成可育的子實(shí)體（子囊果）[12]。單孢群體F1只含有1種交配型基因，可以采用田間混合播種的方法使2種交配型菌絲結(jié)合，從而完成有性生殖。

目前在羊肚菌的栽培中，普遍沿用擔(dān)子菌的思維模式，通過采用組織分離的方法獲得栽培菌株用于生產(chǎn)中，但羊肚菌的菌絲細(xì)胞存在多個(gè)細(xì)胞核[10]，而且隨著組織分離和轉(zhuǎn)代的次數(shù)增加，羊肚菌細(xì)胞核會(huì)發(fā)生不均等遷移，導(dǎo)致菌株中的其中1種基因型逐漸減少或衰退[6-7]，無法完成有性生殖的過程，從而無法出菇。因此，在品種選育過程中通過組織分離獲得優(yōu)選子囊果的組織分離菌絲體必須經(jīng)過交配型基因的檢測(cè)，確保同時(shí)含有2種交配型基因，才能用于下一步生產(chǎn)中。

此次試驗(yàn)梯棱羊肚菌F1單孢菌株間混合播種組合出菇率為38%，發(fā)育成子囊果的比例為29%。通過子實(shí)體性狀和產(chǎn)量分析，從F2出菇子囊果篩選出產(chǎn)量較高的15個(gè)組合，平均單產(chǎn)為0.30 kg·m-2～0.78 kg·m-2；優(yōu)選出3個(gè)菇型性狀的組合組合41（Y15-8×HM-14）、組合 49（Y15-16×HM-14） 和組合39（Y15-8×HM-12）。從所篩選的3個(gè)組合子囊果經(jīng)過組織分離得到3個(gè)雜交菌株，交配型檢測(cè)表明均含有2種交配型基因，該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為羊肚菌單孢雜交育種工作奠定了基礎(chǔ)。