冷凍貯苗對(duì)當(dāng)歸早薹、生物量和品質(zhì)的影響

黎潔，劉曉霞，羅蜜蜜，黃天苗，謝雕雕，2，張海燕，栗孟飛，，魏建和

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，甘肅 武威 733200；3.蘭州新區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究院有限公司，甘肅 蘭州 730300；4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

當(dāng)歸為常用大宗藥材，來自多年生草本植物當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛和潤(rùn)腸通便等功效，現(xiàn)多用于治療貧血、婦科疾病、卒中等癥[1-2]。化學(xué)研究表明，當(dāng)歸含有阿魏酸、藁本內(nèi)酯、多糖、黃酮和酚類等多種化學(xué)成分[2-3]。當(dāng)歸主產(chǎn)于我國(guó)甘肅、四川和云南等高寒陰濕地區(qū)，年需求量超過3萬t，年在地面積約4.4萬hm2以上[4-6]。目前生產(chǎn)中，當(dāng)歸第2年收獲肉質(zhì)根用作藥材，留存于地中的根第3年抽薹開花收獲種子用于種苗繁育[6]。然而，30%～50%的植株第2年就出現(xiàn)提前抽薹開花(即早薹開花)，使得肉質(zhì)根木質(zhì)化不能入藥[1，7]。種植中早薹開花導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)問題一直是多年來困擾當(dāng)歸優(yōu)質(zhì)藥材生產(chǎn)的嚴(yán)重問題之一[6]。

很多研究表明，當(dāng)歸為“低溫長(zhǎng)日照型”植物，即植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)必須同時(shí)滿足低溫春化作用和長(zhǎng)日照[7-9]。由于春化階段主要發(fā)生在種苗越冬貯存期間，貯存空間小便于集中控制溫度；而光照階段必須發(fā)生在種苗移栽后的正常生長(zhǎng)期間，田間栽培空間大難以大面積縮短日照時(shí)間[8]。因此，從實(shí)際生產(chǎn)來看，控制春化階段遠(yuǎn)比控制光照階段更加可行。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸種苗春化作用溫度為0～5℃，也即規(guī)避春化作用的溫度為：<0 ℃貯苗、>5 ℃貯苗或0～5 ℃貯苗期間給予一定時(shí)間高溫(約30 ℃)[6，8]。研究表明，<0 ℃貯苗最為可行，因?yàn)?5 ℃和高溫“去春化”貯苗方式，極易出現(xiàn)種苗腐爛等問題[8,10]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)越冬期當(dāng)歸種苗進(jìn)行-4～-2 ℃和-12～-10 ℃貯藏，移栽后早薹率分別降低至5.6%和0[10]。但冷凍貯苗溫度并不是越低效果越好，溫度越低種苗移栽后返青時(shí)間越長(zhǎng)，且生長(zhǎng)勢(shì)越弱，產(chǎn)量降低[7，11]。綜合文獻(xiàn)資料顯示，到目前為止，對(duì)于種苗冷凍貯藏的研究?jī)H局限于早薹率統(tǒng)計(jì)和產(chǎn)量評(píng)估，而對(duì)于冷凍貯苗后成藥根品質(zhì)，以及冷凍貯藏對(duì)不同種苗類型的影響還未見研究報(bào)道。為此，本研究以不同類型當(dāng)歸種苗為材料，就不同貯藏溫度(0和-5 ℃)移栽后，進(jìn)行植株早薹率、成藥根生物量、主要活性物質(zhì)含量以及抗氧化能力測(cè)定與分析，旨在為選擇適宜的當(dāng)歸種苗冷凍貯藏條件提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019～2020年在甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司(海拔2 423 m；E 103°07′39.21″，N 37°01′0.45″)進(jìn)行。2019年10月底，采集當(dāng)歸(岷歸1號(hào))一年生正常種苗(岷縣茶埠鎮(zhèn)溝門村，海拔2 349 m；E 104°06′22.31″，N 34°28′54.94″)和火藥籽苗(岷縣閭井鎮(zhèn)小鞏灘村，海拔2 773 m；E 104°36′33.97″，N 34°20′05.50″)，將種苗含水量晾至約70%，分別置于0和-5 ℃冰箱中冷凍貯藏。

降溫和貯藏方法：首先，將溫度降溫至0 ℃，0 ℃處理保持恒溫；-5 ℃處理先在0 ℃處理3 d，然后以1 ℃/d降溫至-5 ℃，并恒溫貯藏；2020年4月初，按照1 ℃/d梯度升溫至0 ℃，解凍后取出用于田間栽培。需要強(qiáng)調(diào)的是，種苗貯藏期間保證供電。

1.2 儀器與試劑

ACQUITY Arc型四元梯度超快速液相色譜儀(Waters公司，美國(guó))，Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm，美國(guó))，V1800 型可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。阿魏酸(ferulic acid，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110773-201915)，藁本內(nèi)酯(ligustilide，北京索笛計(jì)量科技有限公司，批號(hào)20041005)，沒食子酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)和兒茶素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，北京索萊寶科技有限公司)，其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種苗分級(jí)與移栽 種苗解凍后，首先，按照根莖大小進(jìn)行分類：小苗(0.3～0.4 cm)、中苗(0.4～0.5 cm)和大苗(0.5～0.6 cm)；其次，分別挑選無損傷、無叉根、有根系活力的種苗20株用于移栽，每處理3次重復(fù)；然后，移栽定植于日光溫棚，定植前一次性施入甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司“綠能瑞奇牌”復(fù)合微生物肥(1 350 kg/hm2)作底肥。每個(gè)處理定植面積約3 m2，種植方式為覆黑膜壟作，行株距20 cm×20 cm，穴深15 cm，每穴1株。生長(zhǎng)期間采用統(tǒng)一常規(guī)田間管理，不再施肥，土壤含水量控制在25%～30%，溫度控制在10～28 ℃。

1.3.2 早薹率統(tǒng)計(jì)和生物量測(cè)定 2020年8月中旬，統(tǒng)計(jì)不同處理抽薹株數(shù)，抽薹率(%)=抽薹株數(shù)/20株×100%；10月中旬地上部分枯萎時(shí)，采挖植株根部，流水沖洗干凈后置于室溫通風(fēng)處陰干，測(cè)定植株干質(zhì)量。

1.3.3 活性物質(zhì)含量及抗氧化能力測(cè)定

1.3.3.1 提取液的制備 取陰干的根莖粉碎后過0.18 mm篩，準(zhǔn)確稱取0.2 g置于250 mL圓底燒瓶中，加入20 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，60 ℃加熱回流提取30 min，自然冷卻至室溫，再稱定質(zhì)量，用70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液-20 ℃保存，用于阿魏酸、藁本內(nèi)酯、可溶性糖、總酚類和總黃酮類化合物含量以及體外抗氧化能力測(cè)定。

1.3.3.2 阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的測(cè)定 采用HPLC法測(cè)定阿魏酸和藁本內(nèi)酯的含量，參考鄧雪琪等[12]的方法測(cè)定。具體步驟：將1.3.3.1中提取液用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)樣量10 μL，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相為1.0%乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫為(0～8 min，38%～90% B；8～12 min，90%～38%B；12～14 min，38% B)。

以阿魏酸和藁本內(nèi)酯為對(duì)照品，采用梯度質(zhì)量濃度稀釋法用色譜甲醇配制，依次配制成混合質(zhì)量濃度分別為0.03、0.08、0.20、0.51、1.28 μg/mL的阿魏酸對(duì)照品溶液和3.20、8.00、20.00、50.00、100 μg/mL的藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液；以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到阿魏酸對(duì)照品回歸方程為Y=3.40×105C1-9742.3(R2=0.999)，藁本內(nèi)酯對(duì)照品回歸方程為Y=4.68×103C2+8 534.1(R2=0.998)，樣品中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量計(jì)算公式如下：

阿魏酸含量(mg/g)=

單株阿魏酸含量(mg/株)=阿魏酸含量×單株干質(zhì)量

單株藁本內(nèi)酯含量(mg/株)=藁本內(nèi)酯含量×單株干質(zhì)量

式中：C1為樣品中阿魏酸質(zhì)量濃度(μg/mL)；C2為樣品中藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度(μg/mL)；Y為樣品峰面積(mAU×s)；V為提取液的體積(mL)；M為制備提取液材料的干質(zhì)量(g)。

1.3.3.3 可溶性糖含量的測(cè)定 可溶性糖含量的測(cè)定采用硫酸苯酚法，參考栗孟飛等[5]和Dubois等[13]的方法。其中，測(cè)定時(shí)提取液加樣量均為15 μL，以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定可溶性糖的含量，計(jì)算公式為：

單株可溶性糖含量(mg/株)=可溶性糖含量×單株干質(zhì)量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(μg)=126.58A-6.89(R2=0.993)

式中：C為可溶性糖的量(μg)；V1為吸取樣品溶液的體積(mL)；V2為提取液的體積(mL)；A為樣品的吸光值；M為制備提取液材料的干質(zhì)量(g)。

1.3.3.4 總黃酮類化合物含量的測(cè)定 總黃酮類化合物含量的測(cè)定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法，參考栗孟飛等[5]和Lay等[14]的方法。其中，測(cè)定時(shí)提取液加樣量均為1.5 mL，以兒茶素(catechin，CE)為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定總黃酮類化合物的含量，計(jì)算公式為：

單株總黃酮類含量(mg/株)=總黃酮類含量×單株干質(zhì)量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(CE μg)=192.31A-4.17(R2=0.999)

式中：C為黃酮類的量(μg)；V1為吸取樣品溶液的體積(mL)；V2為提取液的體積(mL)；A為樣品的吸光值；M為制備提取液材料的干質(zhì)量(g)。

1.3.3.5 總酚類化合物含量的測(cè)定 總酚類化合物含量的測(cè)定采用福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑法，參考栗孟飛等[5]和Beato等[15]的方法。其中，測(cè)定時(shí)提取液加樣量均為100 μL，以沒食子酸(gallic acid，GAE)為標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定總酚類化合物的含量，計(jì)算公式為：

單株總酚類含量(mg/株)=總酚類含量×單株干質(zhì)量

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C(GAE μg)=16.78A-0.26(R2=0.996)

式中：C為酚類的量(μg)；V1為吸取樣品溶液的體積(mL)；V2為提取液的體積(mL)；A為樣品的吸光值；M為制備提取液材料的干質(zhì)量(g)。

1.3.3.6 體外抗氧化能力的測(cè)定 采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)和鐵離子還原/氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP)2 種方法測(cè)定提取液的體外抗氧化能力。

DPPH法參考栗孟飛等[5]、Li等[16]和Nencini等[17]的方法測(cè)定。其中，測(cè)定時(shí)提取液加樣量均為200 μL，抑制率的計(jì)算公式為：

式中：A為樣品溶液吸光值；A0為不加樣品溶液的吸光值；M為材料單株干質(zhì)量(g)。

FRAP測(cè)定參考栗孟飛等[5]、Li等[16]和Benzi等[18]的方法測(cè)定。其中，測(cè)定時(shí)提取液加樣量均為100 μL，以FeSO4·7H2O(500 μmol Fe(Ⅱ)/g)為參比基礎(chǔ)計(jì)算樣品溶液的抗氧化能力，F(xiàn)RAP值計(jì)算公式為：

單株FRAP值(μmol Fe(Ⅱ)/株)=

式中：A為樣品溶液吸光值；AFeSO4·7H2O為FeSO4·7H2O溶液的吸光值；A0為不加樣品溶液的吸光值；M為材料單株干質(zhì)量(g)。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行One-Way ANOVA Duncan 數(shù)據(jù)差異顯著性分析；采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍貯藏對(duì)當(dāng)歸早薹的影響

圖1結(jié)果顯示，與0 ℃相比，-5 ℃處理下正常種苗和火藥籽苗的早薹率均呈現(xiàn)不同程度的降低，就正常種苗而言，中苗和大苗分別降低了63.6%和21.9%；同一溫度和種苗大小相同的情況下，移栽后植株早薹率均呈現(xiàn)正常種苗低于火藥籽苗；另外，早薹率均隨種苗的增大而增加。

不同小寫字母分別表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異。

2.2 冷凍貯藏對(duì)當(dāng)歸成藥根生物量的影響

圖2結(jié)果顯示，與0 ℃相比，-5 ℃處理正常種苗和火藥籽苗的成藥根單株干質(zhì)量均顯著降低，-5 ℃正常小、中和大苗分別較0 ℃降低36.7%、34.5%和20.7%；同一條件下，成藥根單株干質(zhì)量均呈現(xiàn)正常種苗高于火藥籽苗；另外，隨著種苗的增大成藥根單株干質(zhì)量均顯著增加。

不同小寫字母分別表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異。

2.3 冷凍貯藏對(duì)當(dāng)歸成藥根中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的影響

圖3結(jié)果顯示，與0 ℃相比，-5 ℃處理正常種苗和火藥籽苗成藥根中阿魏酸含量，以干質(zhì)量和單株計(jì)算有所降低，正常種苗小苗以及火藥籽苗大苗干質(zhì)量除外；而藁本內(nèi)酯含量有所增加，中苗則相反。同一條件下，阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量呈現(xiàn)正常種苗高于火藥籽苗，0 ℃處理小苗除外。

不同小寫字母分別表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異。

2.4 冷凍貯藏對(duì)當(dāng)歸成藥根可溶性糖、總黃酮類和酚類化合物含量的影響

圖4結(jié)果顯示，冷凍貯藏對(duì)成藥根可溶性糖、總黃酮類和酚類化合物含量也呈現(xiàn)不同程度的影響。與0 ℃相比，-5 ℃處理下正常種苗和火藥籽苗成藥根中可溶性糖含量，以干質(zhì)量和單株計(jì)算均有所降低(圖4-A和4-B)；總黃酮類和總酚類化合物含量也基本呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(正常種苗小苗干質(zhì)量除外)(圖4-C～4-F)。正常種苗與火藥籽苗進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)0 ℃處理下不同種苗大小之間無規(guī)律性差異變化，-5 ℃處理下呈現(xiàn)為正常種苗高于火藥籽苗。

不同小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 冷凍貯藏對(duì)當(dāng)歸成藥根抗氧化能力的影響

圖5結(jié)果顯示，與0 ℃相比，-5 ℃處理下正常種苗和火藥籽苗成藥根的DPPH清除率和FRAP值，以干質(zhì)量和單株計(jì)算均有所降低(正常種苗小苗干質(zhì)量除外)；正常種苗與火藥籽苗進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)0 ℃處理下不同種苗大小之間無規(guī)律性差異變化，-5 ℃處理下呈現(xiàn)為正常種苗高于火藥籽苗，這與可溶性糖、總黃酮類和總酚類化合物含量的變化基本一致。

不同小寫字母分別表示在P<0.05水平下達(dá)到顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

對(duì)于冬性植物而言，春化作用和光周期在誘導(dǎo)成花過程中同等重要，通常表現(xiàn)為春化作用可使分生組織獲得向花器官轉(zhuǎn)變的能力，然后給予適宜的光照才能保證開花；若植物沒有完成春化作用，即使給予適宜的光周期也會(huì)延遲開花或一直處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段；同時(shí)，植物春化速率與溫度和時(shí)長(zhǎng)存在累加效應(yīng)和函數(shù)關(guān)系，但不同植物、品種、年齡、大小和營(yíng)養(yǎng)水平等對(duì)春化作用的影響不盡相同[19-21]。研究已證實(shí)，當(dāng)歸為冬性植物，其抽薹開花受到內(nèi)因(如種源、苗齡和大小等)和外因(如溫度、光照和海拔等)的共同作用[6]。

針對(duì)種源和種苗大小影響植株早薹率和成藥根生物量，本研究發(fā)現(xiàn)，無論在春化作用溫度(0 ℃)或規(guī)避春化作用溫度(-5 ℃)，同一種苗大小相同的情況下，正常種苗移栽后不僅抽薹率均低于火藥籽苗，而且成藥根生物量顯著增加；盡管早薹率隨種苗的增大而增加，但是隨著種苗的增大成藥根生物量顯著增加，這與前人的研究報(bào)道一致[4，11，22-23]。以上結(jié)果表明，在生產(chǎn)過程中，首先，應(yīng)選擇正常種苗進(jìn)行種植栽培，以降低早薹發(fā)生；其次，應(yīng)選擇中等種苗(0.4～0.5 cm)，在保證降低早薹發(fā)生的同時(shí)，相對(duì)提高成藥根產(chǎn)量。

針對(duì)冷凍貯苗影響植株早薹率和成藥根生物量方面，本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于正常種苗而言，中苗和大苗在-5 ℃貯藏相對(duì)于0 ℃可顯著降低早薹率，而小苗影響不顯著。這與前人研究的較小的當(dāng)歸種苗(百苗質(zhì)量<20 g)對(duì)低溫的感受力較差，在一定的時(shí)間內(nèi)不能完成春化作用的結(jié)果基本一致[24]。同時(shí)，-5 ℃貯藏正常種苗移栽后的成藥根生物量顯著降低了20.7%～36.7%。這與賈貞等[11]研究發(fā)現(xiàn)-5 ℃貯藏成藥根生物量相對(duì)于0 ℃顯著降低的結(jié)果基本一致[11]。

通常而言，低于0 ℃的溫度不僅使細(xì)胞代謝活性受到抑制，而且還阻止細(xì)胞分裂和DNA復(fù)制，最終使得植物不能通過春化作用[19,25]。貯藏溫度越低，恢復(fù)生長(zhǎng)所用時(shí)間越長(zhǎng)。賈貞等[11]通過對(duì)冷凍貯藏的當(dāng)歸種苗進(jìn)行延遲栽培，發(fā)現(xiàn)成藥根的產(chǎn)量隨栽期的延后而減小。這間接佐證了-5 ℃貯藏的種苗由于恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，延遲并縮短了生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，進(jìn)而限制了光合產(chǎn)物以及代謝產(chǎn)物的積累，不僅降低了成藥根生物量，而且在一定程度上降低了主要活性物質(zhì)(阿魏酸、藁本內(nèi)酯、可溶性糖、總黃酮類和總酚類)的積累量及其抗氧化能力。

理論上而言，不同類型的當(dāng)歸種苗必然存在一個(gè)最佳的冷凍貯藏溫度，可保證最高存活率、最低抽薹率、最高成藥根生物量以及活性物質(zhì)積累量。本試驗(yàn)僅對(duì)不同類型的當(dāng)歸種苗進(jìn)行了-5 ℃冷凍貯藏的研究，因此，對(duì)于不同類型種苗的冷凍貯藏最佳溫度，以及冷凍貯藏調(diào)控抽薹開花的分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究與分析。