60種中草藥及其復(fù)方對(duì)殺魚愛德華氏菌的體外抑菌效果

胡建美，王寶屯，馮娟，許新，蘇友祿

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣東 廣州 510225；4.廣州市從化區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣東 廣州 510900)

中國是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，但在工業(yè)化養(yǎng)殖的過程中由于魚類病害頻發(fā)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。為有效防治養(yǎng)殖過程中病害的發(fā)生，水產(chǎn)疫苗[2-4]、抗生素[5]和益生菌[6]等都是常見的防治手段。在取得成效的同時(shí)，由于抗生素等化學(xué)藥品的濫用，導(dǎo)致水環(huán)境變差，動(dòng)物產(chǎn)生耐藥性，使治療成本不斷提高[7]；同時(shí)這些物質(zhì)在水產(chǎn)品體內(nèi)富集，也會(huì)危害動(dòng)物和人類健康。因此，開發(fā)能有效防治病害且對(duì)環(huán)境友好的藥物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。

中草藥作用機(jī)理復(fù)雜，病原體難以產(chǎn)生抗性；中草藥應(yīng)用在水環(huán)境中，易分解，停留時(shí)間短；中草藥價(jià)格相對(duì)低廉，可有效降低成本；中草藥除直接作用于病原體外，還可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力，達(dá)到防優(yōu)于治的效果[8]。中草藥中含有生物堿、有機(jī)酸、萜類、氨基酸和多糖等生物活性成分，可達(dá)到清熱解毒、抗菌、殺菌、促進(jìn)生長發(fā)育和提高機(jī)體免疫力等多種功效，對(duì)細(xì)菌性、病毒性、真菌性和寄生蟲等疾病有效[9]。中草藥潑灑在水體中，可達(dá)到殺菌、抗病毒和優(yōu)化菌群組成等作用；中草藥拌飼后投喂，作為飼料添加劑可促進(jìn)生長和提高機(jī)體免疫功能[10]。

花鱸(Lateolabraxmaculates)隸屬于鱸形目，又稱七星鱸、花寨、中國花鱸。據(jù)中國漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)，2020年鱸魚產(chǎn)量位居中國海水魚第3，約為18萬t，主要產(chǎn)自廣東、福建和山東等地[11]?；|的大規(guī)模、高密度工業(yè)化養(yǎng)殖，加劇了養(yǎng)殖過程中各種病害的發(fā)生，其中哈維弧菌(Vibrioharveyi)[12]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[13]和殺魚愛德華氏菌(Edwardsiellapiscicida)[14]等是花鱸的主要病原菌，給花鱸的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

殺魚愛德華氏菌為2013年通過表型和遺傳特性鑒定后從遲緩愛德華氏菌(Ewardsiellatarda)中分離出的愛德華氏菌屬(Edwardsiella)新種[15]，它廣泛存在于環(huán)境和宿主體內(nèi)，可通過皮膚、鰓、腸道等多種途徑感染經(jīng)濟(jì)魚類，引發(fā)愛德華氏菌病(Edwardsiellosis)，并最終導(dǎo)致魚類大量死亡。此病菌在世界各地均有發(fā)現(xiàn)，宿主范圍廣泛，多為海水和咸淡水魚類，包括大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、花鱸和日本鰻鱺(Anguillajaponica)等，可引起魚類系統(tǒng)性的出血性敗血癥，導(dǎo)致魚體行動(dòng)緩慢，缺氧而死，以及內(nèi)部臟器充血、出血以及發(fā)生壞死[16]。殺魚愛德華氏菌的致病性和它含有的多種毒力因子緊密相關(guān)，例如：細(xì)胞黏附素、溶血素、脂多糖、III 型分泌系統(tǒng)(Type III secretion system，T3SS)和VI 型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion system，T6SS)等，目前對(duì)T3SS和T6SS研究較為深入[17]。殺魚愛德華氏菌是胞內(nèi)病原體，該菌的致病機(jī)制、耐藥性和疫苗開發(fā)備受關(guān)注[18]。

目前治療該病的主要方法是化學(xué)藥物，四環(huán)素類和磺胺類藥物對(duì)治療殺魚愛德華氏菌病有較好的效果，但同時(shí)也導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的流行，因此，需要開發(fā)新型環(huán)境友好的治療方法。中草藥因其具易分解、不殘留和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)使其成為該病害防控的優(yōu)選。本文通過研究60種常見且價(jià)格低廉的中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的體外抑菌、殺菌作用，以期為中草藥藥物開發(fā)和殺魚愛德華氏菌病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

殺魚愛德華氏菌18BJ136，為本課題組于珠海市花鱸養(yǎng)殖場(chǎng)分離、鑒定并保存的[16]。

1.2 試驗(yàn)藥物及培養(yǎng)基

選取生活中常見且價(jià)格低廉的中草藥，分別為：分心木(Semenjuglandis)、石榴皮(Punicagranatum)、番石榴葉(Psidiumguajava)、綿茵陳(Artemisiascoparia)、半枝蓮(Scutellariabarbata)、青蒿(Artemisiaannua)、烏梅(Fructusmume)、柏子仁(Platycladusorientalis)、野菊花(Dendranthemaindicum)、蒲公英(Taraxacummongolicum)、大黃(Rheumpalmatum)、地榆(Sanguisorbaofficinalis)、五種子(Schisandrachinensis)、竹茹(Bambusatuldoides)、紫蘇葉(Perillafrutescens)、穿心蓮(Andrographispaniculata)、延胡索(Corydalisyanhusuo)、雞骨草(Abruscantoniensis)、地骨皮(Lyciumchinense)、吳茱萸(Euodiarutaecarpa)、鹿含草(Pyrolacalliantha)、決明子(Cassiasemen)、虎杖(Reynoutriajaponica)、檳榔(Arecacatechu)、荊芥(Nepetacataria)、淡竹葉(Lophatherumgracile)、麥芽(Hordeurnvulgar)、香加皮(Periplocasepium)、銀柴胡(Stellariadichotoma)、丁香(Syzygiumaromaticu)、苦地丁(Corydalisbungeana)、馬齒莧(Portulacaoleracea)、金銀花(Lonicerajaponica)、天花粉(Trichosantheskirilowii)、板藍(lán)根(RadixIsatidis)、蒼術(shù)(Atractylodeslancea)、紫花地丁(Violayedoensis)、黃芩(Sastellariabaicalensis)、魚腥草(Houttuyniacordata)、白薇(Cynanchumatratum)、絡(luò)石藤(Trachelospermumjasminoides)、蘆薈(Aloevera)、八角茴香(Illiciumverum)、金錢草(Lysimachiachristinae)、五倍子(Gallachinensis)、黃柏(Phellodendronchinense)、合歡花(Albiziajulibrissin)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、柿蒂(Diospyroskaki)、牛蒡子(Arctiumlappa)、浮萍(Lemnaminor)、谷芽(Setariaitalica)、白芍(Paeonialactiflora)、槐花(Sophorajaponica)、天冬(Asparaguscochinchinensis)、白前(Cynanchumglaucescens)、仙鶴草(Agrimoniapolosa)、黃芪(Astragalusmembranaceus)和小茴香(Nepetatenuifolia)，共60種傳統(tǒng)中草藥為研究對(duì)象，供試中草藥購自廣東省珠海市斗門區(qū)某藥房。

腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(brain heart infusion borth，BHI)和技術(shù)瓊脂粉(agar powder)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。BHI液體培養(yǎng)基的配置：37 g BHI培養(yǎng)基粉末溶于1 L 純水中，121 ℃滅菌20 min后使用。BHI瓊脂平板的配置：37 g BHI培養(yǎng)基粉末和15 g技術(shù)瓊脂粉溶于1 L 純水中，121 ℃滅菌20 min后取出，于50 ℃左右倒板。

1.3 中草藥水提液的制備

將上述中草藥置于60 ℃烘干后粉碎，分別稱取質(zhì)量為100 g的中草藥，紗布包裹，注入500 mL純水，浸泡2 h，武火煮沸后，文火熬制30 min，4層紗布過濾，重復(fù)兩次，收集濾液。提取液在水浴鍋內(nèi)95～100 ℃下常壓蒸發(fā)濃縮至100 mL，121 ℃滅菌20 min，置于4 ℃保存。得到終質(zhì)量濃度為1 000 mg/mL的中草藥水提液。

根據(jù)藥物特性及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中復(fù)方中藥治療細(xì)菌病的研究報(bào)道，復(fù)方中藥水提液按質(zhì)量比1∶1配比[19]，即分別稱取兩種中草藥各50 g，后續(xù)置備和上述一致。

1.4 殺魚愛德華氏菌菌懸液的制備

殺魚愛德華氏菌18BJ136活化于BHI瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取長勢(shì)良好的單菌落于BHI液體培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃、200 r/min，過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)菌液濃度為1×108cfu/mL，作為試驗(yàn)菌液。

1.5 抑菌圈的測(cè)定

采用平板打孔法[20]測(cè)定單方中草藥抑菌圈大小，取濃度為1×108cfu/mL的殺魚愛德華氏菌懸液涂布于BHI瓊脂平板后，使用孔徑7 mm的無菌打孔器，每個(gè)平板培養(yǎng)基內(nèi)設(shè)置4孔，其中3孔為實(shí)驗(yàn)組生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入0.1 mL中草藥水提液，保持加滿而不溢出的狀態(tài)；第4孔為陰性對(duì)照，內(nèi)為無菌水。將平板正置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)24 h。選取3個(gè)不同角度測(cè)量抑菌圈直徑大小。

最終判定標(biāo)準(zhǔn)[21]為：抑菌圈直徑>20 mm，極度敏感(++++)；抑菌圈直徑15～20 mm，高度敏感(+++)；抑菌圈直徑10～15 mm，中度敏感(++)；抑菌圈直徑<10 mm，低度敏感(+)；無抑菌圈則不敏感(-)。

1.6 單方中草藥最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測(cè)定

根據(jù)二倍稀釋法[20]，測(cè)定抑菌效果良好的中草藥水提液的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。具體操作如下：對(duì)10支12 mL的無菌試管進(jìn)行編號(hào)，依次為1～10；每支試管內(nèi)加入等量BHI液體培養(yǎng)基，隨后往第1支試管內(nèi)加入與液體培養(yǎng)基等量的中草藥水提液，編號(hào)1～8號(hào)管按順序進(jìn)行2倍稀釋，則試管內(nèi)中草藥質(zhì)量依次為原液濃度的1/2、1/4、1/8、…、1/256；1～9號(hào)管中分別加入10 μL菌懸液，其中第9管為不給藥只含培養(yǎng)基的陽性對(duì)照，第10管為不給藥不加菌液的陰性對(duì)照。設(shè)置3組生物學(xué)重復(fù)。為便于試驗(yàn)結(jié)果的比較和觀察，同時(shí)設(shè)置一組不添加菌液的藥物稀釋組。28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。其中按順序出現(xiàn)的最后一支澄清透亮試管的稀釋質(zhì)量濃度為該藥物的MIC。

根據(jù)MIC結(jié)果，取稀釋質(zhì)量濃度為MIC值及高于該濃度培養(yǎng)物各100 μL涂布于BHI瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果，無菌生長中最低質(zhì)量濃度為該藥物的MBC。

1.7 復(fù)方中草藥MIC和MBC的測(cè)定

依據(jù)單方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選取其中部分中藥進(jìn)行復(fù)方試驗(yàn)，測(cè)定不同組合下的復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的MIC和MBC，操作步驟參照1.5。判斷復(fù)方中草藥之間相互作用的關(guān)系指標(biāo)為：復(fù)方中草藥聯(lián)合抑菌指數(shù)[22](faction inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)=甲藥聯(lián)合時(shí)MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)MIC，判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5，判為協(xié)同作用；0.52，判為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 60種單方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的體外抑菌效果

殺魚愛德華氏菌對(duì)60種中草藥中的14種表現(xiàn)為敏感，其中對(duì)蘇木極度敏感(++++)，抑菌圈直徑為21.94 mm；對(duì)分心木、石榴皮和番石榴葉高度敏感(+++)，抑菌圈直徑分布在15～20 mm之間；對(duì)綿茵陳、半枝蓮、青蒿、烏梅、柏子仁、野菊花和蒲公英表現(xiàn)為中度敏感(++)，抑菌圈直徑范圍在10～15 mm；對(duì)大黃、地榆和五種子低度敏感(+)，抑菌圈直徑小于10 mm(表1)。對(duì)竹茹、紫蘇葉、穿心蓮、延胡索、紫花地丁、浮萍、天冬和小茴香等46種中草藥不敏感(-)(表1)。

表1 60種中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌體外抑菌效果

2.2 4種復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的體外抑菌效果

在復(fù)方中藥中，殺魚愛德華氏菌對(duì)蘇木+半枝蓮表現(xiàn)為極度敏感(++++)，抑菌圈直徑為20.13 mm；對(duì)地榆+烏梅表現(xiàn)為高度敏感(+++)，抑菌圈直徑在為19.13 mm；對(duì)烏梅+蘇木和半枝蓮+地榆復(fù)方中度敏感(++)，抑菌圈直徑為10～15 mm(表2)。

表2 4種復(fù)方中藥對(duì)殺魚愛德華氏菌體外抑菌效果

2.3 單方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的MIC和MBC

柏子仁的MIC和MBC均為500 mg/mL；野菊花、大黃、蘇木、地榆、五倍子和番石榴葉六種藥材的MIC為250 mg/mL，MBC在125～500 mg/mL之間不等；青蒿、分心木和綿茵陳的MIC為125 mg/mL，其中綿茵陳和分心木的MBC為250 mg/mL，青蒿的MBC為125 mg/mL；蒲公英和烏梅的MIC和MBC，分別為31.25 mg/mL和62.5 mg/mL。

表3 中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.4 4種復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的MIC和MBC

由表4可知，不同組合的復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌的體外抑菌作用差異較大。烏梅+蘇木、半枝蓮+地榆和地榆+烏梅的MIC為125 mg/mL，前2個(gè)組合的MBC為250 mg/mL，后者為125 mg/mL，4種復(fù)方組合的FICI均大于2；蘇木+半枝蓮的MIC為31.25 mg/mL，MBC為125 mg/mL。根據(jù)FICI結(jié)果顯示，所有復(fù)方組合中兩種聯(lián)合用藥的中草藥均為拮抗關(guān)系。

表4 復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 討論

中草藥作為一種天然藥物，具有安全、高效、殘留少且價(jià)格低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)；它的抑菌活性是源于體內(nèi)的有機(jī)酸、糖類、生物堿、苷類和揮發(fā)油等免疫活性物質(zhì)和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，相互結(jié)合，促進(jìn)新陳代謝和提高免疫力，最終達(dá)到促生長、抗細(xì)菌、抗病毒、消炎和防治病害的效果[23]。由試驗(yàn)結(jié)果可知，石榴皮、烏梅、蒲公英和半枝蓮的水提物對(duì)殺魚愛德華氏菌具有強(qiáng)大的殺菌作用，但吳穎瑞等[24]研究發(fā)現(xiàn)，4種藥物的乙醇提取物對(duì)羅非魚源的無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)并無抑制活性，其原因可能是由于同種中草藥在不同種細(xì)菌間的抑菌效果存在差異，或者不同的提取方法導(dǎo)致中草藥藥效有所差異所致[25]。從抑菌圈結(jié)果可知，殺魚愛德華氏菌對(duì)蘇木極度敏感，但在隨后的MIC和MBC的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)：蘇木需要在較高的濃度下，才能達(dá)到一定的抑菌、殺菌效果。推測(cè)原因，可能存在一臨界值，蘇木的濃度只有達(dá)到臨界值時(shí)，其抑菌、殺菌效果才會(huì)出現(xiàn)質(zhì)的飛躍。

石榴皮、烏梅、蒲公英和半枝蓮均具有清熱解毒、抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤，降低血糖、血脂等價(jià)值[26]。蒲公英對(duì)革蘭氏陰性和陽性菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)的抑菌效果較好，抑菌圈大于20 mm，MIC和MBC可達(dá)7.5 mg/mL[27]；其水提物對(duì)遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)抑菌效果顯著[28]。本試度驗(yàn)中，蒲公英對(duì)殺魚愛德華氏菌同樣具有明顯的抑菌作用，表明蒲公英對(duì)愛德華氏菌屬細(xì)菌具有較好的抑菌作用。蒲公英抑菌效果是黃酮、多酚及生物堿等有效活性物質(zhì)抗菌、消炎等藥理活性的體現(xiàn)，主要作用機(jī)制為抑制細(xì)胞壁合成及胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)合成[29]；此外，蒲公英內(nèi)生真菌對(duì)魚源病原菌具有體外抑菌作用，表明其抑菌成分的來源具有多樣性[30]。

烏梅和石榴皮是藥食同源的藥材，臨床功效廣泛。對(duì)不同細(xì)菌，烏梅抑菌效果存在差異，例如：烏梅對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)和沙門菌(Salmonellaspp.)抑菌效果良好，其中對(duì)沙門菌的抑菌圈直徑可達(dá)41.98 mm；但在對(duì)溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，需要較高的質(zhì)量濃度才可達(dá)到較為顯著的效果[29]。石榴皮對(duì)弧菌屬(Vibrospp.)、氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)和愛德華氏菌屬等[31]均具有較好的抑菌、殺菌效果，可見石榴皮對(duì)不同種屬的細(xì)菌都有抗菌效果，具有廣譜抗菌性。在本試驗(yàn)中，烏梅和石榴皮對(duì)殺魚愛德華氏菌表現(xiàn)出良好的抑菌作用，這與烏梅和石榴皮的抗菌機(jī)制密切相關(guān)。有研究表明，烏梅和石榴皮具相同抑菌機(jī)制，表現(xiàn)為破壞現(xiàn)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抑制胞內(nèi)重要物質(zhì)合成，阻滯細(xì)胞繁殖傳代途徑；但不同的是，石榴皮還可干預(yù)細(xì)胞的己糖磷酸途徑，對(duì)細(xì)胞的生理生化進(jìn)程具有更精準(zhǔn)的影響作用[32-33]。采用瓊脂法測(cè)定中草藥對(duì)遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，石榴皮和烏梅的抑菌效果一般[34]；與之相反，有研究發(fā)現(xiàn)石榴皮和烏梅對(duì)遲緩愛德華氏菌抑菌效果明顯[35]；也有研究發(fā)現(xiàn)烏梅對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果較強(qiáng)[36]。綜上所述，烏梅和石榴皮對(duì)殺魚愛德華氏菌具有顯著抑菌作用，但不同提取方法對(duì)中草藥抑菌效果有一定影響[25,31]；此外，同種中草藥對(duì)不同地區(qū)分離的同種細(xì)菌間的抑菌、殺菌效果也存在一定的差異。

由于復(fù)方中草藥由多種藥材構(gòu)成，化學(xué)成分復(fù)雜，抑菌效果較單方中草藥更佳，與單方相比可對(duì)不同細(xì)菌或同種細(xì)菌的不同菌株表現(xiàn)出更好的抑菌效果[37]。中草藥復(fù)方制劑在體外表現(xiàn)出抑菌、殺菌效果的同時(shí)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物也具有良好的促生長、抗病和增強(qiáng)免疫等積極作用[23]。本研究中，蘇木+半枝蓮等4種復(fù)方中草藥對(duì)殺魚愛德華氏菌高度敏感，抑菌和殺菌作用可以在較小濃度下實(shí)現(xiàn)；當(dāng)藥物質(zhì)量濃度達(dá)到250 mg/mL時(shí)，殺魚愛德華氏菌對(duì)4種復(fù)方極度敏感，無法存活；然而，在單方中草藥為500 mg/mL的濃度下，蘇木和地榆才能殺菌，以上結(jié)果表明單方和復(fù)方的抑菌效果可能存在差異[38]，兩種或多種草藥中含有的豐富的活性物質(zhì)可以更好地實(shí)現(xiàn)抑菌殺菌功效。然而，除了藥物之間成分、含量的差異外，中草藥煎煮方法，以及產(chǎn)地、儲(chǔ)存方式等因素，也會(huì)影響藥效的發(fā)揮[39]。

4 結(jié)論

60種單方中草藥中，對(duì)殺魚愛德華氏菌有體外抑菌作用的僅14種，其抑菌效果差異較大，其中烏梅、半枝蓮、石榴皮和蒲公英的抑菌作用較強(qiáng)；復(fù)方結(jié)果中，蘇木+半枝蓮、地榆+烏梅的抑菌、殺菌作用強(qiáng)，但聯(lián)和抑菌指數(shù)分析顯示它們?yōu)檗卓龟P(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)水產(chǎn)中藥開發(fā)利用提供參考依據(jù)。