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    塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞系的建立及鹽堿度對(duì)其增殖的影響

    2022-07-04 10:46:06代金彩強(qiáng)壯楊敏魏杰聶竹蘭
    關(guān)鍵詞:裂腹組織細(xì)胞塔里木

    代金彩,強(qiáng)壯,楊敏,魏杰,聶竹蘭

    (1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,省部共建塔里木盆地生物資源保護(hù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300;2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300;3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)興新職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆 鐵門關(guān) 841007)

    塔里木裂腹魚(yú)(Schizothoraxbiddulphi)俗稱“尖嘴魚(yú)”,是塔里木河水系的特有物種,曾廣泛分布于阿克蘇河、葉爾羌河、和田河、渭干河等[1-2]。近年來(lái),由于生態(tài)環(huán)境變化、人為活動(dòng)干擾、生長(zhǎng)緩慢、性成熟晚及繁殖力低等因素的影響,塔里木裂腹魚(yú)的種群數(shù)量急劇減少[3-4]。有關(guān)塔里木裂腹魚(yú)的報(bào)道主要集中在地理分布[5]、形態(tài)特征[6]、繁殖特性[7]、線粒體DNA結(jié)構(gòu)分析[8]、遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)[9]及遺傳多樣性[10]等方面。

    魚(yú)類腎臟的功能不僅具有泌尿作用,還具有造血功能和免疫調(diào)節(jié)的功能。腎是魚(yú)體維持體內(nèi)離子平衡,調(diào)節(jié)滲透壓的重要器官,水體的鹽堿度增加可使魚(yú)類體內(nèi)與外環(huán)境之間的滲透壓差值逐漸升高,迫使魚(yú)類調(diào)節(jié)滲透壓,影響魚(yú)類的腎組織等[11-12]。龍宏?duì)幍萚13]研究發(fā)現(xiàn),鹽度對(duì)星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚(yú)腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯的影響;黨云飛[14]研究發(fā)現(xiàn),大鱗鲃(Barbuscapito)幼魚(yú)的腎臟在不同濃度的鹽堿水環(huán)境中顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化;張瑩瑩[15]建立了金錢魚(yú)(Scatophagusargus)腎細(xì)胞系(SK)并從細(xì)胞水平對(duì)金錢魚(yú)腎細(xì)胞在滲透壓應(yīng)激作用下的調(diào)節(jié)機(jī)制做了進(jìn)一步分析;腎細(xì)胞可用于研究鹽堿度對(duì)魚(yú)類的生存影響,同時(shí)腎組織細(xì)胞被建立并應(yīng)用于各個(gè)方面,如徐進(jìn)[16]建立了斑點(diǎn)叉尾鮰(Lctaluruspuncatatus)腎臟細(xì)胞系(CCK)并應(yīng)用于病毒的分離鑒定;Guo等[17]建立了黑鯉魚(yú)(Procyprisrabaudi)腎細(xì)胞系(MPK)并應(yīng)用于病毒的敏感性試驗(yàn);張曉雨等[18]建立了松江鱸(Trachidermusfasciatus)腎細(xì)胞系并應(yīng)用于病毒和鎘離子敏感性試驗(yàn),得出松江鱸可作為鯉春病毒血癥病毒和鎘離子檢測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)。上述研究為魚(yú)類腎組織細(xì)胞的研究提供了積極的技術(shù)借鑒。

    本試驗(yàn)進(jìn)行塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞系的建立并研究NaCl鹽度和NaHCO3堿度對(duì)其增殖的影響。細(xì)胞系的建立將對(duì)其環(huán)境毒理學(xué)、病毒的分離、細(xì)胞遺傳學(xué)的研究提供基礎(chǔ)研究材料。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    試驗(yàn)動(dòng)物塔里木裂腹魚(yú)取自克孜勒河,飼養(yǎng)在新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)試驗(yàn)室。

    1.2 試驗(yàn)試劑

    DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司;磷酸緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Solarbio公司;臺(tái)盼藍(lán)和0.25%胰酶購(gòu)自Biotopped公司;MS-222購(gòu)自漁夫?qū)毠?;基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取健康塔里木裂腹魚(yú),置于高錳酸鉀(20 mg/L)溶液中浸泡30 min,加入0.1 μL/g的MS-222麻醉劑麻醉后,致死。用75%的酒精對(duì)魚(yú)體進(jìn)行消毒,然后置于超凈臺(tái)上的解剖盤中。再取4個(gè)培養(yǎng)皿,其中一個(gè)放75%的酒精,另外3個(gè)分別加入添加500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B的PBS。解剖取魚(yú)的腎組織放入酒精中30 s,然后依次放入另外3個(gè)培養(yǎng)皿中浸泡,之后將其放入2 mL無(wú)菌離心管中,并用無(wú)菌眼科剪將其剪成大約1~2 mm3的組織碎塊,向其中加入500 μL的DME/F12培養(yǎng)液,將組織碎塊移到25 mm2培養(yǎng)瓶中正相放入25 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中,觀察貼壁情況,4 h后反相放置,反相放置培養(yǎng)2 h后再向其中加入含20%FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B的1 mL DME/F12培養(yǎng)液正相放入25 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),12 h后加入9 mL的培養(yǎng)液繼續(xù)正相放置培養(yǎng)。每天觀察組織塊遷移情況。

    在進(jìn)行原代培養(yǎng)的過(guò)程中,更換一次培養(yǎng)液的時(shí)間為2~4 d。當(dāng)組織碎塊周圍遷出細(xì)胞,細(xì)胞濃度達(dá)106個(gè)/mL時(shí)按1∶2的比例進(jìn)行傳代。直到第5代后,青霉素、鏈霉素降低到200 IU/mL和200 μg/mL,F(xiàn)BS的濃度也降低到15%。到第8代后,培養(yǎng)液用含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。

    1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 將一定濃度的細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,分成8組,每組6孔,接種一定濃度的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7 d的常規(guī)培養(yǎng),用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),每天記一組,分析數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的縱坐標(biāo)為每天計(jì)數(shù)的細(xì)胞平均個(gè)數(shù),時(shí)間為橫坐標(biāo)。根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞的群體倍增時(shí)間。

    T=t×lg2/lg(Nt/N0)

    式中:Nt為時(shí)間t后的細(xì)胞數(shù),N0接種細(xì)胞數(shù)[19]。

    1.3.3 最佳培養(yǎng)基 檢測(cè)DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640 5種不同培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。每種培養(yǎng)基中均補(bǔ)充10% FBS和1% P/S。分別將一定濃度的細(xì)胞接種在不同的培養(yǎng)基中,在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h,在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

    1.3.4 最適培養(yǎng)溫度 檢測(cè)20、25、30和37 ℃不同溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所用培養(yǎng)液為含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h,在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

    1.3.5 最適血清濃度 在確定最適合的培養(yǎng)液及最適合的溫度條件下,其他條件一致的條件下,設(shè)置不同的FBS濃度為0、5%、10%和20%,在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng),在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

    1.3.6 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 凍存:配制含20% FBS、70% DME/F12和10%二甲基亞砜(DMSO)的細(xì)胞凍存液預(yù)冷以備用。取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞,細(xì)胞濃度2.0×106個(gè)/mL,凍存。

    復(fù)蘇:取凍存細(xì)胞快速解凍,細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,逐滴加入5倍體積的預(yù)冷培養(yǎng)液,懸浮細(xì)胞,離心棄上清,加入PBS重懸,再次離心棄上清,重復(fù)3次。加入適當(dāng)培養(yǎng)液,取適量細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率,置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞復(fù)蘇36 h后需首次換液。

    1.3.7 細(xì)胞污染鑒定 體外組織細(xì)胞培養(yǎng)很容易受到真菌、細(xì)菌、支原體的污染。真菌的種類繁多,肉眼可見(jiàn),漂浮于培養(yǎng)液面上。細(xì)菌增殖快,在短時(shí)間內(nèi)即可大量擴(kuò)增,并產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。支原體無(wú)致死毒性,可與細(xì)胞長(zhǎng)期共存,對(duì)細(xì)胞有潛在影響,但體積小,不易鑒別。選用觀察法與PCR法檢測(cè)細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌、支原體污染。所用引物見(jiàn)表1。

    表1 通用引物序列

    1.3.8 細(xì)胞來(lái)源鑒定 利用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞的基因組DNA。通過(guò)PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增提取DNA。根據(jù)塔里木裂腹魚(yú)16srRNA設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增引物為16sF和16sR(表2)。配置50 μL反應(yīng)體系,其中含有25 μL 2×TaqPCR MasterMix,引物各2.5 μL,5 μL模板DNA,15 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性,3 min;循環(huán)反應(yīng)35次,循環(huán)條件為94 ℃變性30 s,56.8 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s;72 ℃末輪延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,取1 μL PCR產(chǎn)物在核酸蛋白檢測(cè)儀上檢測(cè)DNA的濃度;取8 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物測(cè)序,比較獲得序列與GenBank已發(fā)表序列的一致率。

    表2 16srRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列引物

    1.3.9 塔里木裂腹魚(yú)細(xì)胞系的應(yīng)用(MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)) NaCl鹽度設(shè)置1‰、2‰、4‰、6‰、8‰、10‰ 6個(gè)梯度。

    NaHCO3堿度設(shè)置2、3、4、5、6、7、8、10 g/L 8個(gè)梯度。

    細(xì)胞鋪板:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BIM14用含10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)液調(diào)整密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,鋪置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每種材料鋪6孔。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液,25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,按分組分別加入不同濃度鹽堿,各孔20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后將每個(gè)含液體孔加入MTT 20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸出各孔內(nèi)液體,后每孔加入150 μL二甲基亞砜。搖床搖培養(yǎng)板20 min,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定各孔D值。通過(guò)計(jì)算得出細(xì)胞相對(duì)增殖率:

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    2 結(jié)果與分析

    2.1 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

    觀察塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞每天的生長(zhǎng)狀態(tài)。1 d后的細(xì)胞貼壁,4 d后組織塊周圍逐漸有細(xì)胞遷出,9 d后細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶70%,10 d后細(xì)胞出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象,在13 d后進(jìn)行傳代(圖1)。

    A、B、C、D分別為細(xì)胞原代培養(yǎng)1 d、4 d、9 d、10 d的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).

    傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中濃度達(dá)到106個(gè)/mL時(shí),進(jìn)行1∶2傳代,每隔2~4 d傳代1次。細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng),現(xiàn)已成功傳至60代。

    2.2 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

    繪制塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞系第10代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,細(xì)胞生長(zhǎng)呈“S”型,0~1 d為潛伏期、1~2 d為指數(shù)生長(zhǎng)期、2~5 d為平臺(tái)期、5 d之后為衰退期(圖2)。第10代腎細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為16.80 h,細(xì)胞分裂旺盛。

    圖2 塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

    2.3 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

    塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞在DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640不同培養(yǎng)基中維持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力如圖3所示,在M199、MEM及RPMI-1640培養(yǎng)基中細(xì)胞基本不生長(zhǎng),在L-15培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,在DME/F12培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)最好,因此選擇DME/F12培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

    圖3 塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

    2.4 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

    塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞在37 ℃生長(zhǎng)最慢,25 ℃生長(zhǎng)最快,20 ℃生長(zhǎng)較快,30 ℃生長(zhǎng)較慢,在20~30 ℃范圍內(nèi)細(xì)胞皆能進(jìn)行良性生長(zhǎng)(圖4),細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃。

    圖4 塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

    2.5 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞最適血清濃度

    塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞在未加血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)明顯低于添加血清的細(xì)胞生長(zhǎng),隨著血清濃度5%、10%、20%依次增大,細(xì)胞生長(zhǎng)依次加快,當(dāng)FBS濃度為20%時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)最快(圖5)。

    圖5 塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞最適血清濃度

    2.6 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

    塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞對(duì)第6代細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存40、90及180 d后復(fù)蘇,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),復(fù)蘇存活率如表3所示,40 d后存活率為(96.01±0.74)%,90 d后存活率為(91.32±0.72)%,180 d后存活率為(91.13±0.72)%,90 d和180 d存活率差異不顯著(P>0.05)(表3)。細(xì)胞具有活性,且復(fù)蘇后增殖速度快(圖6),可正常傳代(圖7)。

    表3 凍存后復(fù)蘇存活率

    圖6 MTT法測(cè)定復(fù)蘇細(xì)胞增殖

    A和B分別為細(xì)胞復(fù)蘇后1 d和3 d的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài).

    2.7 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞污染與檢測(cè)鑒定

    塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體,經(jīng)過(guò)PCR法鑒定細(xì)菌、真菌、支原體污染。如圖8所示,1、3、5泳道分別為細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照;2、4、6泳道分別為腎細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物;樣品均無(wú)與陽(yáng)性對(duì)照組一致的條帶,樣品中無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體,塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞未被污染。

    M泳道為2 000 bp Marker;1、3、5泳道分別為細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物陽(yáng)性對(duì)照;2、4、6泳道分別為腎細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物.

    2.8 塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞來(lái)源鑒定

    用基因組DNA試劑盒提取塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增,在瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè),目的條帶大小符合16srRNA的大小(圖9)。經(jīng)測(cè)序后的序列片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)。塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞同源性與GenBank中發(fā)布的來(lái)源于塔里木裂腹魚(yú)線粒體基因(JQ844133.1)的序列達(dá)到99.91%,序列在2606位有一個(gè)堿基缺失(圖10),因此塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞來(lái)自于塔里木裂腹魚(yú)。

    M泳道為2 000 bp Marker;1泳道為塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞PCR產(chǎn)物.

    灰色:不一致序列.

    2.9 MTT法檢測(cè)各組鹽堿度對(duì)細(xì)胞增殖的影響

    2.9.1 NaCl鹽度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞增殖的影響 相同NaCl濃度下,隨時(shí)間的延長(zhǎng)(24、48、72 h)BIM14相對(duì)增殖依次下降,NaCl鹽度對(duì)BIM14的相對(duì)增殖的抑制可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上,NaCl鹽度1‰、2‰、4‰、6‰依次使BIM14增殖上升,6‰、8‰、10‰依次使BIM14細(xì)胞增殖下降,6‰時(shí)BIM14增殖最高,BIM14增殖隨NaCl鹽度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(表4)。

    表4 NaCl鹽度對(duì)BIM14細(xì)胞增殖的影響

    2.9.2 NaHCO3堿度對(duì)塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞增殖的影響 NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞的相對(duì)增殖在濃度一致情況下,BIM14細(xì)胞的增殖隨時(shí)間的延長(zhǎng)(24、48、72 h)依次下降,NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞的相對(duì)增殖的抑制可隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上,NaHCO3堿度2、3、4、5、6 g/L依次使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖上升,6、7、8、10 g/L依次使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖下降,6 g/L使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖最高,BICF1和BIM14細(xì)胞增殖隨NaHCO3堿度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(表5)。

    表5 NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞增殖的影響(M±SD)

    3 討論

    本研究以塔里木裂腹魚(yú)腎組織為材料,用組織塊移植法成功啟動(dòng)了塔里木裂腹魚(yú)腎組織細(xì)胞原代培養(yǎng),命名為BIM14。BIM14在10% FBS的DME/F12培養(yǎng)液中生長(zhǎng)良好。細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液有L-15、MEM、RPMI-1640和M199,但不同的魚(yú)類對(duì)環(huán)境要求不盡相同,因此,不同魚(yú)類的最適培養(yǎng)基亦不同。金鯧魚(yú)(Trachinotusovatus)頭腎細(xì)胞系(TOHK)[23]、大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)頭腎細(xì)胞系(LYCK)[24]、云紋石斑魚(yú)(Epinephelusmoara)腎細(xì)胞系(EMK)[25]的最佳培養(yǎng)液均為L(zhǎng)-15,而圓斑星鰈(Veraspervariegates)腎臟組織細(xì)胞系(SHK)的最佳培養(yǎng)液是MEM[26],羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)腎臟組織細(xì)胞(TiK)最佳培養(yǎng)液是DMEM[27],本試驗(yàn)中使用DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培養(yǎng)基,得出DME/F12為最佳培養(yǎng)液。魚(yú)類組織細(xì)胞生長(zhǎng)溫度范圍和哺乳類組織細(xì)胞比較,范圍比較廣。BIM14在20~25 ℃均能正常生長(zhǎng),與已報(bào)道的魚(yú)類細(xì)胞的溫度適應(yīng)范圍是一致的[26],這與魚(yú)類是變溫動(dòng)物有很大的關(guān)系。在0%、5%、10%、20%的FBS中生長(zhǎng)時(shí),未加FBS的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于添加FBS的生長(zhǎng),在20%FBS時(shí)生長(zhǎng)最快,F(xiàn)BS濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的影響,與已經(jīng)報(bào)道的研究相似[23]。本研究測(cè)定了第10代BIM14生長(zhǎng)曲線,呈“S”型生長(zhǎng)曲線,1 d進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期,羅非魚(yú)腎細(xì)胞(TiK)在2~5 d為指數(shù)生長(zhǎng)期,5 d之后為平穩(wěn)期,與羅非魚(yú)腎細(xì)胞(TiK)[27]相比,BIM14進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期更快。

    塔里木裂腹魚(yú)BIM14呈懸浮生長(zhǎng)。貼壁培養(yǎng)型的細(xì)胞,細(xì)胞膜表面含有大量黏附因子。這些黏附因子可激活不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)貼壁細(xì)胞的活性和增殖,如整合素(integrins)活化黏著斑激酶(focal adhesion kinase)激活信號(hào)通路抑制細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡[28]。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般為淋巴細(xì)胞等血液系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞,這種細(xì)胞體積小,缺乏粘附分子的表達(dá)[29-30]。本課題組在對(duì)塔里木裂腹魚(yú)BIM14染色體的制備中發(fā)現(xiàn),用0.075 mol/L的KCl低滲時(shí)間達(dá)90 min。當(dāng)其他條件一致,低滲時(shí)間是45 min時(shí),染色體不分散,低滲時(shí)間達(dá)90 min時(shí)染色體才分散(圖11)。有研究報(bào)道棕點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusfuscoguttatus♀)×鞍帶石斑魚(yú)(Epinepheluslanceolatus♂)F1染色體制備中低滲時(shí)間25 min[31];鯉魚(yú)染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在35 min[32];黃顙(Pelteobagrusfulvidraco)染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在40 min[33];灰海馬(Hippocampuserectus)染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間為50 min[34];已報(bào)道的研究中低滲時(shí)間為25~50 min。因此,推測(cè)塔里木裂腹魚(yú)BIM14細(xì)胞膜不易破裂,與BIM14細(xì)胞膜的堅(jiān)韌程度有關(guān)。用物理方法進(jìn)行貼壁型細(xì)胞的懸浮訓(xùn)化時(shí)使細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡(Anoikis)[35],無(wú)血清與生物反應(yīng)器訓(xùn)化使貼壁細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡的拮抗。目前,MDCK[36],BHK-21[37],ST[38],PK15[39],Vero[40]等被訓(xùn)化。塔里木裂腹魚(yú)BIM14培養(yǎng)中可能產(chǎn)生類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)。塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)的狀態(tài),可能與其體積和細(xì)胞膜表面粘附分子的表達(dá)及細(xì)胞膜堅(jiān)韌程度有關(guān),也可能與類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān),具體原因有待于進(jìn)一步研究。

    A:KCl低滲45 min不分散染色體;B:KCl低滲90 min分散染色體.

    細(xì)胞來(lái)源的鑒定通常采用16srRNA、12srRNA和Cytb等基因片段,其中16srRNA基因?qū)儆谶M(jìn)化緩慢的保守序列,因此本試驗(yàn)選擇16srRNA進(jìn)行鑒定,序列分析結(jié)果與塔里木裂腹魚(yú)基因序列一致性為99.91%,證明細(xì)胞系來(lái)自于塔里木裂腹魚(yú)。

    塔里木裂腹魚(yú)曾是博斯騰湖主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,自20世紀(jì)70年代,由于開(kāi)荒造田,農(nóng)田鹽堿水大量的排入湖水,鹽堿度逐年升高[41]。水體中鹽堿度水平對(duì)魚(yú)類的存活有顯著的影響,鹽堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使魚(yú)類的存活率顯著的降低[42-43]。在尼羅羅非魚(yú)鹽堿度的耐受性研究中鹽度為20時(shí)僅少數(shù)個(gè)體能存活到96 h,NaHCO3堿度為12 g/L時(shí),96 h全部死亡[44];以縊蟶(Sinonovaculaconstricta)為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行急性低鹽脅迫,并檢測(cè)當(dāng)鹽度由2到0時(shí),其存活率隨著鹽度的下降而降低[45];當(dāng)碳酸鹽濃度為0~44.58 mmol/L、pH值為9.0~10.0時(shí),隨著碳酸鹽濃度的上升,縊蟶的存活率明顯下降[46]。本研究中NaCl鹽度6‰使BIM14增殖率最高;NaHCO3堿度6 g/L使BIM14增殖率最高。本研究結(jié)果顯示,鹽堿度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)使塔里木裂腹魚(yú)腎細(xì)胞的存活率降低,可應(yīng)用于塔里木裂腹魚(yú)對(duì)鹽堿脅迫適應(yīng)性的研究。

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