斑鱾dmrt1的克隆及其表達分析

溫思民，翟 毅，黃 洋，2，朱春華，2，4，李廣麗，2，3

（1.廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東湛江 524088；2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心，廣東湛江 524088；3.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室，廣東湛江 524088；4.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實驗室，廣東湛江 524088）

dmrt （doublesex and mab-3 related transcription factors）基因家族是一類與果蠅（Drosophila melanogaste）性別決定基因 dsx（doublesex）和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）性別決定基因mab-3（male abnormal-3）同源的基因［1-2］。該基因家族成員的主要特征是所編碼的蛋白質(zhì)包含一個能與DNA序列結(jié)合，且高度保守的DM 結(jié)構(gòu)域（doublesex and male aberrant-3 relative domain），這些蛋白質(zhì)可通過其鋅指結(jié)構(gòu)與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達，在性別決定與分化、胚胎發(fā)育、組織器官形成等生物學過程起著重要作用［3-4］。作為dmrt基因家族的一員，dmrt1基因編碼的蛋白質(zhì)具有典型的DM結(jié)構(gòu)域，該基因在無脊椎動物和脊椎動物中均存在，是參與性別決定的最古老的基因，具有進化保守性。dmrt1基因廣泛存在于哺乳動物、鳥類、爬行類和魚類中，參與動物性別決定與分化，在雄性性腺的表達水平高于雌性［5］。在人類中，DMRT1基因在男性胚胎的生殖嵴中特異表達，在女性中不表達，該基因在維持睪丸的細胞形態(tài)和功能方面發(fā)揮重要作用，缺失會導致發(fā)生睪丸向卵巢的轉(zhuǎn)分化［6］。在小鼠中，Dmrt1基因在XX和XY早期胚胎的生殖嵴表達，但在性別決定后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹辉诓G丸中特異表達，敲除Dmrt1基因的XY雄性小鼠會導致睪丸分化受阻，最終喪失生殖細胞［7］，而XX雌性小鼠Dmrt1基因的突變雖然會減少鼠胚卵巢中原始卵泡的形成，但不影響其生育能力［8］。在魚類中，dmrt1基因最早在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中得到鑒定，并且僅在這兩個物種的精巢中表達，表明該基因是重要的雄性相關(guān)基因［9-10］。XY雄性尼羅羅非魚dmrt1功能缺陷會導致其精巢退化，表現(xiàn)為輸精管畸形、精原細胞退化甚至完全喪失生殖細胞［11］。MATSUDA 等［12］和NANDA 等［13］在2002年分別獨立在青鳉（Oryzias latipes）中發(fā)現(xiàn)了魚類的第一個雄性性別決定基因，即Y染色體上的DM結(jié)構(gòu)域基因（DM-domain gene on the Y chromosome，dmy），也稱Y染色體性別決定區(qū)dmrt1的重復拷貝基因dmrt1bY，dmy基因的自然突變會導致XY青鳉發(fā)生由雄性向雌性的性逆轉(zhuǎn)，而在XX雌性青鳉中過表達dmy會誘導發(fā)生卵巢向精巢的轉(zhuǎn)分化。此外，敲除常染色體dmrt1基因的XY青鳉會發(fā)育為雌性并具有正常生育能力，而通過挽救實驗過表達的dmrt1，可使其發(fā)育為正常雄性［14］。與青鳉類似，敲除dmrt1的XY雄性斑馬魚（Danio rerio）大多數(shù)發(fā)育為具有生育能力的雌性，少數(shù)成為不育的雄性，表現(xiàn)為精巢發(fā)育受阻，最終喪失生殖細胞［15］。以上研究表明，dmrt1基因參與脊椎動物性別分化和精巢的功能調(diào)控。

斑鱾（Girella punctata），又稱瓜子鱲，俗名黑毛魚，隸屬于鱸形目（Perciformes），鱸亞目（Percoidei），鱾科（Girellidae），鱾屬，是近海暖水性巖礁魚類，食性為雜食性，主要以藻類和小型無脊椎動物為食，體長最長可達50 cm。斑鱾屬雌雄異體魚類，雌雄魚表型基本相同，不易分辨，但雌雄性腺發(fā)育不一致，雄魚需2年性成熟，雌魚需3年性成熟，該魚的產(chǎn)卵期在2—6月，棲息于巖礁、石礫底質(zhì)的近岸水域，主要分布于中國的東海、南海和臺灣島附近海域，以及朝鮮、日本和菲律賓沿海［16-18］。斑鱾?cè)赓|(zhì)潔白鮮嫩、營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值極高，是名貴高檔的經(jīng)濟魚類，深受消費者青睞，具有十分廣闊的市場前景。但目前斑鱾尚不能進行規(guī)?；斯し敝?，市場消費的成魚及海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑鱾苗種均主要來自海捕，這在一定程度上制約了斑鱾規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展。dmrt1基因作為魚類的重要生殖發(fā)育調(diào)控基因，在斑鱾中尚未見相關(guān)研究報道。本研究以斑鱾為研究對象，克隆其dmrt1基因，運用生物信息學技術(shù)預測其Dmrt1蛋白的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，并分析dmrt1基因在斑鱾雌雄性腺和胚胎發(fā)育過程中的表達模式，以期為斑鱾生殖發(fā)育調(diào)控及性別分化研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品采集

斑鱾來自珠海育成魚苗養(yǎng)殖有限公司，體質(zhì)量230～347 g，體長23.9～28.2 cm，3雌3雄。麻醉后取部分性腺組織液氮速凍后-80℃保存，用于提取總RNA及后續(xù)基因克??；剩余部分性腺組織用Bouin’s液固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后用于性腺組織學觀察。斑鱾胚胎樣品取自中國臺灣省臺南市屏東縣東港鎮(zhèn)的中國臺灣水產(chǎn)試驗所東港分所，受精卵在溫度為（26.0±0.5）℃、鹽度為31的海水中培育。用120目篩絹網(wǎng)撈取受精卵，用體視顯微鏡（Thermo，XTL-2400，美國）進行胚胎發(fā)育觀察及圖片采集，并取不同發(fā)育時期胚胎樣品各30顆液氮速凍后-80℃保存，用于總RNA提取。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol試劑盒（Invitrogen，15596018，美國）分別提取胚胎和性腺的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Scientific，美國）檢測RNA的濃度和質(zhì)量。RNA質(zhì)量檢測合格后，按照PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，RR047A，日本）說明書合成cDNA。

1.3 斑鱾dmrt1 ORF的克隆與序列分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得黃金鱸（Perca flavescens）和白梭吻鱸（Sander lucioperca）等鱸形目物種dmrt1 cDNA序列，在本實驗室斑鱾性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（BioProject ID：PRJNA752004）中進行生物信息學比對分析，找到斑鱾dmrt1可能轉(zhuǎn)錄本（7 204 bp），用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計特異性引物對該基因ORF進行克隆驗證，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成（表1）。采用2×PCR MIX（P2014，東盛生物科技公司）進行基因擴增。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。將得到的PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA凝膠回收試劑盒（N1072，東盛生物科技公司）對目的條帶進行切膠回收、連接、亞克隆、挑選陽性克隆送至上海生工生物有限公司測序。

使用NCBI的ORF finder（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／orffinder／）在線預測斑鱾dmrt1開放閱讀框（open reading frame，ORF）；使用在線分析軟件ExPASy Proteomics Server（http：／／ca.expasy.org）推導其氨基酸序列、分子量計算值和理論等電點等；使用SignalP 5.0 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP）預測其信號肽序列；使用TMHMM Server 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM）預測其跨膜結(jié)構(gòu)域；使用SoftBerry-Psite（http：／／linux1.softberry.com）預測其氨基酸序列中的功能位點分布；使用SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de）分析其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域；使用PSORT II Prediction（http：／／psort.hgc.jp／form2.html）預測其亞細胞定位；使用SOPMA（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html）預測Dmrt1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；運用ExPASy的SWISSMODEL（http：／／www.swissmodel.expasy.org）進行建模分析；采用NCBI在線序列比對（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進行序列同源性比對和相似性分析；運用DNAMAN 9進行蛋白序列的多重比對分析；采用MEGA X軟件以鄰位相連法（neighbor-joining）構(gòu)建各物種Dmrt1系統(tǒng)進化樹［19］。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測dmrt1在雌雄性腺和不同胚胎發(fā)育時期的表達。操作步驟參照SYBR?Green Real Time PCR Master Mix試劑盒（TOYOBO，QPK-201，日本）說明書進行。反應體系為：SYBR?Green Real Time PCR Master Mix 10μL，cDNA 2μL，10μmol·L-1上下游引物各0.8μL，再用超純水補齊至20μL。設(shè)置反應程序：95℃預變性5 min；95℃30 s，54℃20 s，72℃20 s，40個循環(huán)；72℃延伸5min。以β-actin為內(nèi)參基因，引物見表1。用2-ΔΔCT方法計算dmrt1在斑鱾雌雄性腺和不同胚胎發(fā)育時期中的相對表達量。

表1 PCR相關(guān)引物序列Tab.1 Primers used for PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 25.0對dmrt1在斑鱾雌雄性腺的表達數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗分析，對dmrt1在斑鱾不同胚胎發(fā)育時期的表達數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差（mean±SE）表示，n＝3，當P＜0.05時表示組間差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑鱾dmrt1 ORF的克隆及生物信息學分析

克隆得到的斑鱾dmrt1 ORF全長為894 bp，編碼297個氨基酸（圖1）。對斑鱾Dmrt1蛋白進行預測分析，結(jié)果表明該蛋白原子總數(shù)為4 414，分子結(jié)構(gòu)式為C1374H2154N406O457S23，理論分子量為32.41 ku，理論等電點（pI）為7.01；不穩(wěn)定系數(shù)64.19，大于閾值40，性質(zhì)不穩(wěn)定；脂溶指數(shù)為53.60，總平均親水性（GRAVY）為-0.638，屬親水性蛋白，位于細胞核，不存在信號肽與跨膜區(qū)，含有4個N-糖基化位點、1個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪蛋白激酶II磷酸化位點、6個N-肉豆蔻?；稽c、2個異戊二烯基結(jié)合位點和4個微體C末端靶信號位點（圖1）。在蛋白N端27～80位具有一個與果蠅Dxs和線蟲Mab-3蛋白相似的DM結(jié)構(gòu)域，用SOPMA軟件預測Dmrt1蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，無規(guī)則卷曲所占的比例最高，占64.65%，延 伸 鏈 占14.14%，α-螺 旋 占17.51%，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中有超過半數(shù)的氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，說明該蛋白質(zhì)整體處于一個以無規(guī)則卷曲為主的二級結(jié)構(gòu)中。將Dmrt1氨基酸序列提交至SWISS-MODEL軟件，自動搜索同源蛋白作模板，得到以人類DMRT1的DM結(jié)構(gòu)域模型（PDB ID：4yj0.1.A）為模板構(gòu)建的斑鱾Dmrt1的DM 結(jié)構(gòu)域模型（圖2），相似性為87.10%，這表明了Dmrt1的DM結(jié)構(gòu)域在進化上的保守性。

圖1 斑鱾dmrt1的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleic acid and amino acid sequences of dmrt1 gene in G.punctata

圖2 不同魚類和人類的Dmrt1／DMRT1蛋白的DM 結(jié)構(gòu)域模型Fig.2 DM domain model of Dmrt1／DMRT1 protein in different fishes and Homo sapiens

2.2 斑鱾Dmrt1的同源性及進化分析

將斑鱾Dmrt1蛋白序列與其他物種的蛋白序列進行同源比對分析，斑鱾Dmrt1與黃金鱸的同源性最高，為85.71%，與人類的同源性最低，為32.89%（表2）。多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，斑鱾和其他脊椎動物的Dmrt1均含有保守的DM結(jié)構(gòu)域（圖3），斑鱾Dmrt1的DM結(jié)構(gòu)域與黃金鱸、白梭吻鱸、橙胸鏢鱸（Etheostoma obama）和歐洲海鱸（Dicentrarchus labrax）的同源性為96.30%，與斑馬魚的為90.74%，與人類的為87.10%，DM結(jié)構(gòu)域的高度同源性表明了其在進化上的保守性。

圖3 斑鱾與其他物種的Dmrt1的蛋白序列多重比對Fig.3 Comparison pf Dmrt1 protein alignment of in G.punctata and other species

表2 斑鱾Dmrt1與其他物種的同源性Tab.2 Homology between Dmrt1 in G.punctata and other species

在斑鱾和其他脊椎動物的Dmrt1蛋白序列系統(tǒng)進化樹中，斑鱾與黃金鱸、白梭吻鱸等鱸形目魚類聚為一支，與斑馬魚、人類和小鼠等分離，這與傳統(tǒng)分類地位一致（圖4）。

圖4 不同脊椎動物的Dmrt1系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Dmrt1 in vertebrates

2.3 斑鱾雌雄性腺的組織學觀察

雌雄性腺組織切片HE染色結(jié)果表明，該時期斑鱾精巢均處于III期，精原細胞呈近圓形或橢圓形，細胞中央有一大圓核，核透亮，核仁被蘇木精染成深藍色，胞質(zhì)被伊紅染成淡紅色；精母細胞由精原細胞增殖分裂產(chǎn)生，數(shù)量較多，染色程度較精原細胞深。斑鱾卵巢均處于II期，卵母細胞的形狀不規(guī)則，呈近圓形、多邊形或梨形等，細胞核偏位，占卵母細胞的比例較大（圖5）。

圖5 斑鱾雌雄性腺的組織切片觀察Fig.5 Histological observation of male and female gonads of G.punctata

2.4 dmrt1在斑鱾成體雌雄性腺的表達

qRT-PCR數(shù)據(jù)分析顯示，dmrt1在II期卵巢有微弱表達，在III期精巢中有較高表達，雄性的表達水平顯著高于雌性（P＜0.05）（圖6）。

圖6 dmrt1在斑鱾雌雄性腺的相對表達Fig.6 Relative expression of dmrt1 in male and female gonads of G.punctata

2.5 斑鱾胚胎發(fā)育觀察

斑鱾受精卵屬端黃卵，為無色透明的圓球形，受精卵直徑為（973.92±21.46）μm（n＝36），具有1個油球，油球直徑為（221.55±11.68）μm。斑鱾受精卵在溫度為（26.0±0.5）℃、鹽度為31的海水中培育，從受精到超過50%的仔魚孵出，整個胚胎發(fā)育過程歷時24 h 36 min，胚胎發(fā)育各個階段及主要發(fā)育特征見表3和圖7。

圖7 斑鱾胚胎發(fā)育Fig.7 Embryonic development of G.punctata

表3 斑鱾胚胎發(fā)育時序Tab.3 Embryonic development of G.punctata

2.6 dmrt1在斑鱾胚胎不同發(fā)育時期的表達

qRT-PCR數(shù)據(jù)分析顯示，dmrt1表達水平在斑鱾胚胎發(fā)育過程中呈先上升后降低的趨勢，在桑葚期表達水平最高，囊胚期開始降低，原腸期后表達水平急劇下降，至初孵期幾乎不表達（圖8）。

圖8 dmrt1在斑鱾胚胎不同發(fā)育時期的相對表達Fig.8 Relative expression of dmrt1 in embryo at different development stages in G.punctata

3 討論

本研究克隆的斑鱾dmrt1基因的ORF全長為894 bp，編碼297個氨基酸。運用生物信息學方法預測分析斑鱾Dmrt1蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白無N端信號肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，位于細胞核，屬不穩(wěn)定性親水蛋白，預測結(jié)果與其結(jié)合特定DNA序列調(diào)控下游基因表達的特性相符。斑鱾Dmrt1蛋白的蛋白結(jié)構(gòu)、細胞定位、穩(wěn)定性和疏水性等多項預測結(jié)果與奧里亞羅非魚（Oreochromis aureus）、胡 子 鲇（Clarias fuscus）Dmrt1的預測結(jié)果相似［20-21］。通過與其他脊椎動物Dmrt1多重蛋白比對發(fā)現(xiàn)，斑鱾Dmrt1存在較為保守的DM結(jié)構(gòu)域序列，這預示著斑鱾Dmrt1具有與其他脊椎動物Dmrt1相似的功能。而斑鱾Dmrt1除DM結(jié)構(gòu)域外的序列與其他脊椎動物的同源性差異較大，表明Dmrt1蛋白在不同進化地位的物種間仍然具有一定差異。

dmrt1基因是dmrt基因家族中研究最廣泛的性別調(diào)控相關(guān)基因，廣泛存在于各種魚類中，但在不同物種間存在時序和組織表達差異。在魚類dmrt1基因性別相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，dmrt1是具有性別二態(tài)性的雄性高表達基因，即其在精巢中的表達量要遠遠高于在卵巢及其他組織中的表達量，有些魚類的dmrt1基因甚至只在精巢中特異性表達。如斑馬魚［22］性腺切片原位雜交表明，dmrt1在精巢和卵巢發(fā)育的生殖細胞中均有表達，且Northern印跡雜交結(jié)果顯示，其在精巢的表達遠高于卵巢；虹鱒［10］Northern印跡雜交結(jié)果顯示，dmrt1在其整個精子發(fā)生過程中持續(xù)表達，且通過RT-qPCR技術(shù)檢測到dmrt1在其卵巢中的微弱表達。銀漢魚（Odontesthes bonariensis）［23］、紅 鰭 東 方 鲀（Takifugu rubripes）［24］和 香 魚（Plecoglossus altivelis）［25］等魚類dmrt1研究結(jié)果與斑馬魚類似。此外，在成體青鳉［26］、尼羅羅非魚［27］和黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）［28］等魚類中，dmrt1僅在精巢中特異性表達，在其他組織中不表達。而在本實驗中，斑鱾dmrt1在雌雄性腺中的表達模式與前者一致，其在雄性III期精巢中有較高表達，在II期卵巢中微弱表達，這預示著其可能不僅與精巢發(fā)育有關(guān)，還可能在卵巢發(fā)育過程中起作用。

胚胎發(fā)育階段，在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）［29］、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）［30］、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）［31］、香魚［25］和河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）［32］等魚類研究中發(fā)現(xiàn)，dmrt1基因從受精卵裂到出膜孵化整個胚胎發(fā)育過程均有表達，表達水平隨著胚胎發(fā)育呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，但不同物種到達最高表達的時期有所差異，如斜帶石斑魚和稀有鮈鯽的dmrt1的表達水平在囊胚期達到最高值，而黃顙魚、黃河鯉（Cyprinus carpio）［33］、香魚和河川沙塘鱧在原腸期達到峰值。此外，有些魚類在胚胎發(fā)育階段 dmrt1 基因不表達，如大口黑鱸（Micropterus salmoides）［34］，在孵化后40 d才開始出現(xiàn)dmrt1的表達。在本研究中，斑鱾dmrt1在胚胎發(fā)育的卵裂期到原腸期有較高表達，而原始生殖細胞（PGCs）最早發(fā)現(xiàn)于原腸胚時期，推測dmrt1在胚胎發(fā)育前期的高表達與原始生殖細胞的形成有關(guān)。此外dmrt1在斑鱾初孵仔魚期幾乎不表達，這與已有研究結(jié)果不同，有可能是一種新的表達模式，仍有待進一步研究。

綜上所述，本研究克隆的斑鱾dmrt1基因的序列，其所編碼的蛋白具有典型的Dmrt1結(jié)構(gòu)特征，在進化上與鱸形目魚類的Dmrt1同源性高。在雌雄性腺和胚胎發(fā)育過程中的表達模式表明，斑鱾dmrt1基因可能參與了性腺分化和早期胚胎發(fā)育。