超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定淡水養(yǎng)殖 用水中25種抗生素

李小梅，李麗珍，何春慧，張麗姬，王河丹，吳學貴

（海南威爾檢測技術有限公司，海南澄邁 571924）

抗生素類種類繁多，在人們的防治感染性疾病和動物的抗菌促生長等方面應用較廣?？股貫E用或過度使用會導致人和動物對其產(chǎn)生耐藥性[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素的作用主要是預防和治療疾病，提高水產(chǎn)動物的存活率[2]。因此，在全球的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素被大量使用，對人體健康造成一定危害[3]。本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[4]檢測淡水養(yǎng)殖用水中的25種抗生素類殘留檢測，為檢測淡水養(yǎng)殖用水中磺胺類和喹諾酮類抗生素殘留提供可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺醋酰、磺胺多辛、磺胺甲惡唑、磺胺氯噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲二唑、磺胺二甲嘧啶和甲氧芐啶標準品（純度均≥97.00%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；鹽酸（優(yōu)級純，廣州牌化學試劑）；甲醇、乙腈（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；Oasis HLB小柱（Waters公司）。

1.2 儀器與設備

Agilent1290/G6470A超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（美國Agilent Technologies公司）；AB204-S電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；TTLDCII氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取500 mL過濾后的淡水養(yǎng)殖用水水樣用鹽酸溶液酸化后，加入乙二胺四乙酸二鈉200 mg，混勻后過HBL小柱凈化、提取，用12 mL甲醇洗脫，洗脫液吹至近干，加入1 mL流動相（0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液∶乙腈=9∶1），混勻后過濾膜，濾液供超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀分析。

1.3.2 標準工作溶液的配制

分別準確稱取25種抗生素固體標準品10.0 mg，加入適量甲醇超聲溶解，配制成質量濃度為10 mg/L的標準儲備溶液，待用。移取適量10 mg/L的標準儲備溶液，用甲醇稀釋成0.1 mg/L的標準中間液。用流動相（0.5 mmol乙酸銨 -0.1% 甲酸溶液∶乙腈 = 9 ∶ 1）稀釋標準中間液，分別配制成質量濃度為 0.1 ng/L、0.5 ng/L、1.0 ng/L、2.0 ng/L、5.0 ng/L、10.0 ng/L、25.0 ng/L和50.0 ng/L的標準工作溶液。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120 EC-C18（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相A為0.5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0 min，95%A，3.5 min時，88%A，4.0 min時，86%A，7.0 min時，63%A，7.1 min時，5%A，8.7 min時，5%A，8.8 min時，95%A；流速：0.3 mL/min。

（2）質譜條件。離子源為電噴霧離子源AJS ESI，正離子模式；毛細管電壓：4000 V；離子源溫度：300 ℃；鞘氣溫度：350 ℃；檢測方式為多反應監(jiān)測。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

參考2008年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[5]磺胺類和喹諾酮類檢測方法，本文用鹽酸溶液和氨水調節(jié)水樣pH為酸性2.5、弱酸性5.2和近中性7.7，研究水質酸堿度對回收率的影響，每個樣品在不同pH條件下平行加標6個，濃度為 10 ng/L，結果見表1。實驗表明pH為2.5時，平均回收率較高且相對穩(wěn)定。因此，本文選擇將淡水養(yǎng)殖用水pH調節(jié)為2.5進行實驗。

表1 不同pH條件下藥物的平均回收率及RSD（單位：%）

2.2 標準曲線繪制

按照優(yōu)化后的條件和方法對標準工作溶液進行分析測定，以目標化合物標準溶液濃度為橫坐標x、峰面積為縱坐標y，繪制標準曲線。25種抗生素藥物的線性關系見表2，相關系數(shù)為0.99061～0.99983。

表2 抗生素藥物的線性方程

2.3 方法檢出限

用陰性樣品加標處理，用流動相稀釋混合標準溶液，以信噪比（S/N）=3為方法檢出限。如圖1所示，淡水養(yǎng)殖用水中磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、氧氟沙星和環(huán)丙沙星5種抗生素檢出限為 0.1 ng/L，磺胺甲惡唑、恩諾沙星、丹諾沙星和氟甲喹4種抗生素檢出限為0.2 ng/L，甲氧芐啶、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺醋酰、磺胺吡啶、雙氟沙星、洛美沙星和培氟沙星8種抗生素檢出限為0.5 ng/L，磺胺二甲嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺異惡唑、諾氟沙星和沙拉沙星8種抗生素的檢出限為1.0 ng/L。因此，該方法的檢測靈敏度較高。

圖1 淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素檢出限

2.4 回收率與精密度實驗

本文選擇將淡水養(yǎng)殖用水pH調節(jié)為2.5進行實驗，采用加標回收法進行回收率和精密度實驗，分別計算出的磺胺類藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%，各項指標均符合要求。

2.5 樣品檢測

按照優(yōu)化后的實驗條件對4處淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素進行檢測。如圖2所示，淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素在8 min內全部出峰，出峰時間較快，提高了檢測效率。

圖2 淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素出峰時間

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法對淡水養(yǎng)殖用水中25種抗生素進行檢測，該方法25種抗生素出峰時間快，檢出限為0.1～1.0 ng/L，相關系數(shù)為0.99061～0.99983，磺胺類藥物平均回收率為100.7%～115.4%，RSD為1.05%～4.69%，喹諾酮類藥物平均回收率為90.1%～111.0%，RSD為2.20%～9.55%。該方法快速、穩(wěn)定、靈敏度和準確度高，適用于淡水養(yǎng)殖用水中磺胺類和喹諾酮類藥物檢測。