手性三唑類殺菌劑氟環(huán)唑?qū)ν寥牢⑸锏牧Ⅲw選擇性影響

薛鵬飛，劉瀟威 ，趙劉清，賀澤英 *

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

氟環(huán)唑是世界范圍內(nèi)最暢銷的三唑類殺菌劑之一，用于預(yù)防和治療水果、蔬菜、茶和谷物中的各種真菌病害。其作用機(jī)理是阻礙病原菌中鐵卟啉鐵氧絡(luò)合物的形成，進(jìn)而強(qiáng)烈地抑制麥角甾醇的生物合成，從而達(dá)到抑制病原菌細(xì)胞膜合成的目的。氟環(huán)唑分子具有2個手性中心，4種立體異構(gòu)體，其商業(yè)化產(chǎn)品順式-氟環(huán)唑外消旋體含有一對具有2R，3S-（+）-和2S，3R-（-）-構(gòu)型的對映體（圖1）。在提高農(nóng)作物產(chǎn)量的同時，未被有效利用的氟環(huán)唑會進(jìn)入土壤和水體，且其降解非常緩慢，降解半衰期根據(jù)不同的環(huán)境類型、特性和條件從幾周到2 a以上不等。有關(guān)氟環(huán)唑在土壤中的持久性殘留對土壤微生物的影響報(bào)道較少，其不同對映體對土壤環(huán)境的潛在威脅值得關(guān)注。

圖1 順式-氟環(huán)唑不同對映體結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structure of different enantiomers of cis-epoxiconazole

土壤微生物在維持土壤質(zhì)量和作物產(chǎn)量方面有著至關(guān)重要的作用。然而，農(nóng)藥殘留可能會對土壤微生物生物量和活性，以及非靶標(biāo)微生物的生物多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響。近年來，已有三唑類殺菌劑對土壤細(xì)菌和非靶標(biāo)真菌影響的研究報(bào)道。四氟醚唑的施用可顯著改變蘋果園土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)。戊唑醇顯著降低了研究結(jié)束時土壤中氨氧化細(xì)菌和古細(xì)菌的相對豐度，而對硫氧化細(xì)菌表現(xiàn)出試驗(yàn)期間持續(xù)減少的趨勢。對于丙環(huán)唑，土壤微生物生長和土壤酶活性表現(xiàn)出濃度依賴性反應(yīng)，即低濃度的丙環(huán)唑促進(jìn)土壤微生物的生長，而高濃度的丙環(huán)唑抑制微生物生長。以上研究都是針對農(nóng)藥外消旋體，而對于包括三唑類殺菌劑在內(nèi)的手性農(nóng)藥，其生物活性、吸附、轉(zhuǎn)移降解、對非靶標(biāo)生物的毒性等均存在較強(qiáng)的對映體選擇性。對于氟環(huán)唑，其（+）-對映體比（-）-對映體在土壤中的降解半衰期更長，生物活性更高，環(huán)境毒性（對大型蚤）也更高。同時，在蔬菜-土壤-蚯蚓系統(tǒng)中氟環(huán)唑存在較顯著的立體選擇性富集和降解。三唑類殺菌劑對非靶標(biāo)生物存在潛在的影響，然而土壤微生物對氟環(huán)唑的對映體選擇性響應(yīng)尚未見報(bào)道。

目前基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)和基于高通量測序的微生物組學(xué)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，已成為評估污染物對土壤微生物影響的有效技術(shù)手段。為了探究氟環(huán)唑及其不同對映體暴露下土壤微生物群落組成和代謝的立體選擇性響應(yīng)，本研究基于非靶向代謝組學(xué)和微生物組學(xué)兩大組學(xué)聯(lián)合技術(shù)，通過土壤代謝組、系統(tǒng)發(fā)育樹重建與PICRUSt基因功能預(yù)測來研究土壤微生物的立體選擇性響應(yīng)機(jī)制，為手性農(nóng)藥環(huán)境殘留風(fēng)險評估提供有力的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

氟環(huán)唑含量分析使用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜儀，Waters UHPLC系統(tǒng)串聯(lián)QTRAP 4500（美國Sciex公司）；非靶向代謝組學(xué)分析采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（QTOF 6600，美國Sciex公司）。其他儀器包括自動管磨機(jī)（IKA，德國），渦旋振蕩儀（Thermo，美國），高速離心機(jī)（Heal Force，中國香港）。

氟環(huán)唑[（±）-，純度99.9%]、2S，3R-氟環(huán)唑[（-）-，對映體純度>98%]和2R，3S-氟環(huán)唑[（+）-，對映體純度>98%]購自上海勤路生物技術(shù)有限公司（中國上海）。HPLC級的丙酮、甲醇、乙腈和乙酸乙酯購自Merck（德國）。甲酸和醋酸銨購自Sigma Aldrich（德國）。無水MgSO、分散固相萃取吸附劑C18和PSA購自Agilent公司（美國）。水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

農(nóng)田表層土壤（5~20 cm）取自天津市（117°27′E，38°90′N），土壤至少5 a未施用氟環(huán)唑。土壤在室溫下風(fēng)干，過2 mm篩。供試土壤為壤土（黏粒18.43%、沙粒50.04%、粉粒31.01%），pH值為7.81，總有機(jī)碳（TOC）、總氮、總磷含量分別為19 970、140.1 mg·kg和445 mg·kg。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對照（CK）和（±）-、（-）-、（+）-氟環(huán)唑染毒共4個處理組，每組6個重復(fù)。染毒采用分步添加法，以確保染毒均勻。首先，在連續(xù)攪拌下將1 mL氟環(huán)唑丙酮溶液標(biāo)品（2 mg·mL）緩慢加入到20 g土壤中，將初步染毒的土壤置于通風(fēng)櫥中過夜以揮發(fā)溶劑。然后加入80 g空白土壤徹底混合，最終氟環(huán)唑添加水平為20 mg·kg。最后，加水使土壤水分含量為18%。對照土壤使用等量的丙酮溶液，其他步驟相同。將土壤在20℃下避光培養(yǎng)4周，然后對氟環(huán)唑含量、土壤性質(zhì)、土壤微生物組成和土壤代謝物進(jìn)行取樣測定。將所有土壤分為4份：兩份在-80℃保存用于測定土壤微生物組成和土壤代謝物，第三份在-20℃保存用于測定氟環(huán)唑含量，最后一份干燥后用于測定土壤性質(zhì)。

1.3 氟環(huán)唑含量測定

氟環(huán)唑及其對映體的提取采用改進(jìn)的QuECh?ERS法。稱取5 g土壤至50 mL塑料離心管中，加入5 mL去離子水使樣品水化30 min。加入20 mL乙腈和一個陶瓷均質(zhì)子，渦旋萃取3 min。提取后，加入5 g NaCl，將離心管劇烈振蕩數(shù)次，5 000 r·min離心 5 min。取上清液6 mL轉(zhuǎn)移至裝有分散固相萃取吸附劑（900 mg MgSO、150 mg C18 和150 mg PSA）的15 mL離心管中，渦旋1 min，取上清液通過PTFE微孔濾膜（0.22 μm）裝入進(jìn)樣小瓶，用于UPLC-MS/MS分析。

氟環(huán)唑及其對映體分離使用Lux 3u Cellulose-1手性色譜柱（150 mm×2.0 mm，3 μm，Phenomenex，美國）。儀器參數(shù)為：離子噴霧電壓（ISVF）5 500 V；溫度500 ℃；霧化氣（GS1）3.45×10Pa；加熱氣（GS2）3.45 × 10Pa；氣 簾 氣（CUR）2.07 × 10Pa；碰 撞 氣（CAD）中等。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）離子對以及相應(yīng)參數(shù)見表1。

表1 氟環(huán)唑的質(zhì)譜法參數(shù)Table 1 Mass spectrometric method parameters of epoxiconazole

液相條件：柱溫40 ℃，流速0.45 mL·min，進(jìn)樣體積2 μL。流動相A為水相，含有2 mmol·L醋酸銨，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)椋?~2 min，50% B；2~3.2 min，梯度增加至65% B；3.2~4.6 min，保持65% B；4.6~6 min，梯度下降至50% B；6~8 min，保留50% B。

1.4 非靶向土壤代謝組學(xué)

土壤代謝物的提取參照先前的研究并進(jìn)行了一些修改。取液氮研磨土壤樣品2 g于塑料離心管中，加入2 mL提取溶劑（甲醇∶HO=3∶1，/）和1 mL乙酸乙酯。將離心管渦旋3 min，然后超聲（冰浴）提取5 min。樣品離心（7 012，4℃）15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，以上提取過程重復(fù)3次，將所有上清液混合后在40℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)偃芙庥?.5 mL萃取溶劑中，通過PTFE微孔濾膜（0.22 μm）進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

質(zhì)量控制（QC）樣品通過混合所有樣品制備，以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集過程中的質(zhì)量控制。每5個實(shí)際樣品進(jìn)行一針QC樣品采集，分別進(jìn)行正負(fù)源分析。高分辨篩選和定性分析在UPLC-QTOF-MS（Triple TOF 6600，SCIEX）中進(jìn)行，使用Exion LC UPLC系統(tǒng)配備HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，100 ?，Waters，美國）色譜柱對樣品進(jìn)行色譜分離。柱溫設(shè)置為50 °C，流速為0.3 mL·min，進(jìn)樣量2 μL。流動相A為水相，含5 mol·L甲酸銨和0.1%的甲酸，流動相B為甲醇。梯度洗脫程序?yàn)椋?~1.5 min，3% B；1.5~11 min，增加到80%B；11~14 min，增加到97% B；14~18 min，保持97% B；18~18.1 min，降低至3% B；18.1~21 min，保持3% B。

質(zhì)譜采集分別在ESI+和ESI?電離模式下進(jìn)行。電噴霧電離（ESI）源參數(shù)為：離子噴霧電壓（ISVF）正離子模式5 500 V，負(fù)離子模式-4 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣（GS1）3.79×10Pa；加熱氣（GS2）3.79×10Pa；氣簾氣（CUR）2.41 × 10Pa。采用 T OF - MS（70~1 000/）-IDA-MS/MS（50~1 000/）模式在單次運(yùn)行中同時獲得高分辨一級和二級全掃圖。在全掃描TOF-MS實(shí)驗(yàn)中，去簇電壓（DP）為60 V，碰撞能（CE）為10 eV。IDA-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)：采集響應(yīng)超過100 cps的離子；CE和碰撞能量擴(kuò)散（CES）分別設(shè)置為35 eV和15 eV。

1.5 高通量微生物測序

1.5.1 細(xì)菌

使 用 E .Z.N.A.TM Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Doraville，美國）提取總基因組DNA，并儲存于-80℃待進(jìn)一步分析。DNA濃度和純度使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美國）測定。使用1%瓊脂糖凝膠通過電泳評估DNA提取的質(zhì)量。使用V3~V4可變區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為：341F（5′ -CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和 8 06R（5′ - GGAC?TACHVGGGTWTCTAAT-3′）。PCR擴(kuò)增子用 A gen?court AMPure Beads（Beckman Coulter，美國）純化，并使用PicoGreen dsDNA檢測試劑盒（Invitrogen，美國）進(jìn)行定量。在單獨(dú)的定量步驟之后，將等量的擴(kuò)增子合并，并使用Illumina MiSeq平臺和MiSeq ReagentKit v3進(jìn)行雙端2×300 bp測序。

1.5.2 真菌

使用 N ucleoSpinSoil試劑盒（Macherey-Nagel）提取總DNA，并通過分光光度法（novaseq 6000 PE250，Thermo Scientific）計(jì)算DNA濃度。使用引物基因 I TS3~2024F（5′-GCATCGATGAACGCAGC-3′）和ITS4~2409R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增子用Agencourt AMPure XP試劑盒（Beckman Coulter，美國）清洗，用Qubit dsDNA HS檢測試劑盒（Life Technolo?gies）定量，等量合并后使用EZNA Cycle Pure試劑盒（Omega Bio-泰克）進(jìn)行測序。

1.6 多元統(tǒng)計(jì)分析

代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)使用SCIEX OS（SCIEX，美國）軟件處理分析，并獲取質(zhì)譜峰面積。使用MetaboAna?lyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差和熱圖分析。

擴(kuò)增子序列變體（ASV）根據(jù)原始序列信息（FASTQ格式）使用QIIME2推薦的DADA2方法進(jìn)行質(zhì)量控制、去噪和去除嵌合體后得到。一個操作分類單元（OUT）使用RDP分類器進(jìn)行注釋和分類，以獲得不同分類級別的編號。使用Kruskal-Wallis和DEseq2方法對組間和樣品間豐度進(jìn)行差異分析，使用Benjamini-Hochberg方法調(diào)整值。由R語言ggtree包繪制物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，選取豐度最高的前50個屬。利用PICRUSt2對16S rRNA基因數(shù)據(jù)功能預(yù)測，并結(jié)合MetaCyc（https：//metacyc.org/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路比對。經(jīng)注釋后的通路利用ANOVA和Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。其他不同分組間差異檢驗(yàn)用SPSS 23.0完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟環(huán)唑的立體選擇性降解

由表2可知，土壤培育4周后未觀察到氟環(huán)唑外消旋體及對映體的顯著降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時（+）-、（-）-和（±）-氟環(huán)唑的含量分別為（19.62±0.66）mg·kg、（18.63±1.43）mg·kg和（17.87±0.08）mg·kg，與原始含量無顯著差異（檢驗(yàn)）。此外，通過氟環(huán)唑的EF（對映體分?jǐn)?shù)）值，未觀察到顯著的對映體選擇性。

表2 土壤基本性質(zhì)和氟環(huán)唑含量Table 2 Basic soil properties and epoxiconazole content

三唑類殺菌劑在土壤中的高持久性增加了其環(huán)境風(fēng)險性。與氟環(huán)唑類似，其他三唑類殺菌劑在土壤中的降解半衰期也很長，如腈菌唑的半衰期為74~177 d、戊唑醇的半衰期為86~247 d、四氟醚唑的半衰期為69~87 d、苯醚甲環(huán)唑的半衰期為169~239 d，烯唑醇的半衰期為141~210 d。由于不同對映異構(gòu)體的高持久性和不同環(huán)境行為，氟環(huán)唑?qū)ν寥牢⑸锏膶τ丑w選擇性影響值得進(jìn)一步探究。

圖2A顯示了不同處理組在門水平上的相對分布情況。相對豐度排在前20的細(xì)菌物種中，變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）等是氟環(huán)唑暴露下土壤中的主要細(xì)菌。與CK相比，變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門等的相對豐度由于氟環(huán)唑及其對映體暴露而表現(xiàn)出明顯的視覺差異。對于真菌，ITS2基因測序揭示了真菌對氟環(huán)唑及其對映體的響應(yīng)，不同處理組在門水平上的相對分布情況如圖2B所示。在相對豐度排名前20的真菌物種中，子囊菌門（Ascomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomyco?ta）、Aphelidiomycota門、羅茲菌門（Rozellomycota）等是氟環(huán)唑暴露下土壤中的主要真菌。與CK相比，氟環(huán)唑外消旋體和對映體暴露引起了土壤中子囊菌門、壺菌門、擔(dān)子菌門等在視覺上的明顯豐度差異。同時，變形菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、放線菌門、子囊菌門、壺菌門、擔(dān)子菌門等也是低灌木藍(lán)莓土壤在丙硫菌唑等殺菌劑暴露下的主要菌群，其會因多效唑的處理而發(fā)生明顯變化。

圖2 不同處理組對土壤門水平群落結(jié)構(gòu)組成的影響Figure 2 Effects of different treatments on community structure at phylum level

氟環(huán)唑不同對映體暴露引起了部分細(xì)菌和真菌的相對豐度變化。研究表明，三唑類殺菌劑會引起土壤微生物的應(yīng)激反應(yīng)。多效唑可改變土壤細(xì)菌和真菌的群落組成，如綠彎菌門和壺菌門的相對豐度先增加后降低，酸桿菌門的相對豐度先降低后增加。苯醚甲環(huán)唑暴露引起了土壤細(xì)菌群落多樣性的下降，同時能顯著影響土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出濃度依賴性。不同對映體引起的微生物群落變化不同，即土壤微生物群落對氟環(huán)唑表現(xiàn)出立體選擇性。

2.2 不同對映體暴露對土壤代謝組的影響

在不同對映體環(huán)境中，生物體的代謝物組成差異在分子水平上顯示出對手性化合物的立體選擇性代謝響應(yīng)。土壤中的氟環(huán)唑可直接或間接與土壤微生物相互作用，進(jìn)而影響土壤微生物群落的代謝。土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）由溶解的細(xì)胞、植物和微生物釋放的小分子代謝物組成。土壤微生物分泌的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外代謝物構(gòu)成了SOM的代謝物庫，因此監(jiān)測土壤代謝物可以間接反映微生物代謝趨向的變化。通過使用基于LC-QTOF-MS的非靶向代謝組學(xué)，共篩查出281種代謝物。根據(jù)單因子方差分析獲取差異代謝物，相比于CK，共得到84種顯著差異代謝物（<0.05），表明氟環(huán)唑及其對映體暴露引起了土壤代謝組的顯著改變（圖3A）。圖3B為基于VIP分值的PLS-DA區(qū)分的代謝物熱圖，不同處理組熱圖聚類表現(xiàn)出明顯差異。（+）-處理引起了部分代謝物的顯著上調(diào)或下調(diào)，（-）-處理引起的變化較（+）-弱，同時（±）-也引起了不同程度的代謝物改變。不同對映體表現(xiàn)出的聚類差異反映出由（+）-驅(qū)動的立體選擇性代謝響應(yīng)。土壤代謝組的改變可能部分歸因于微生物被動釋放的細(xì)胞外化合物，以及基于SOM中的代謝物循環(huán)，氟環(huán)唑的暴露引起了土壤微生物群落組成和碳循環(huán)方式的改變。

圖3 單因素方差分析和基于VIP值的熱圖分析Figure 3 One-way ANOVA analysis and heatmap of the metabolites based on VIP values

2.3 不同對映體暴露的系統(tǒng)發(fā)育重建

2.3.1 細(xì)菌

圖4A為不同處理組細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（Faith_pd）。經(jīng)Wilcox檢驗(yàn)，相比于CK、（-）-、（+）-，（±）-暴露的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)顯著增加（<0.05），而其他組間兩兩比較的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)變化不顯著（>0.05）。如圖5所示，細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及組間豐度分布熱圖結(jié)果顯示了不同處理的細(xì)菌相對豐度差異。其中，結(jié)腸桿菌（）、繡色土生單胞菌（）、綠藻（）具有最長的分支進(jìn)化長度，結(jié)腸桿菌與屬可能同源。相比于CK處理組，硝化螺旋菌屬（）、費(fèi)氏弧菌（）、羅氏菌屬（）、噬甲基菌屬（）等在（-）-處理土壤中相對豐度明顯增加；食草酸嗜氨菌（s）、龐氏桿菌（）、甲基營養(yǎng)型菌（）、綠膿桿菌（）等在（+）-處理土壤中相對豐度明顯增加；而（±）-暴露土壤中的布魯氏菌（）、繡色土生單胞菌、屬等相對豐度明顯增加。相比于CK處理，氟環(huán)唑外消旋體及對映體暴露顯著降低了鏈霉菌屬（）、甲基黃桿菌（）、羅爾斯通氏菌屬（）、固氮弧菌屬（）等的相對豐度。不同處理組的細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化物種組成明顯不同，表明土壤細(xì)菌功能基因?qū)Ψh(huán)唑的立體選擇性具有差異。這些被影響的細(xì)菌在門水平上主要為酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門等，這與陳麗君等的研究結(jié)果相同。殺菌劑和殺真菌劑可抑制大多數(shù)微生物生長，但它們對呼吸和氮循環(huán)有混合影響，其中戊唑醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的負(fù)面作用。這可能與顯著改變的細(xì)菌，如與氮循環(huán)有關(guān)的硝化螺旋菌屬、食草酸嗜氨菌、固氮弧菌屬等通過呼吸和氮循環(huán)來減弱氧化脅迫過程有直接聯(lián)系。

圖4 Faith_pd指數(shù)的箱型圖Figure 4 Box plot of Faith_pd index

圖5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及組間豐度分布熱圖（細(xì)菌）Figure 5 Phylogenetic tree and heatmap of abundance distribution between groups（bacteria）

2.3.2 真菌

圖6系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及組間豐度分布熱圖（真菌）Figure 6 Phylogenetic tree and heatmap of abundance distribution between groups（fungi）

圖4B為不同處理組真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（Faith_pd）。經(jīng)Wilcox檢驗(yàn)，相比于CK和（-）-，（±）-處理的真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)顯著減?。?0.01），而其他處理兩兩比較的真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)變化不顯著（>0.05）。如圖 6所示，鱗球菌（）、屬、交鏈孢霉屬（）具有較長的分支進(jìn)化長度，枝頂孢霉屬（）與鱗球菌（）可能同源，出芽短梗霉（）與屬可能同源。與CK處理組相比，氟環(huán)唑外消旋體及對映體處理中的高豐度物種表現(xiàn)出明顯差異，如屬、毛殼屬（）、馬爾尼菲籃狀菌（）、油壺菌屬（）等僅在（-）-處理土壤中相對豐度明顯增加；白僵菌屬（）、孢霉屬（）、樹粉孢屬（）、絲膜菌屬（）等僅在（+）-處理土壤中相對豐度明顯增加；而（±）-處理土壤中，屬、疣彎孢霉（）、鏈格孢（）、被孢霉屬（）等相對豐度明顯增加。同時相比于CK處理，氟環(huán)唑處理顯著降低了互生頂孢霉（）、屬、念珠菌（）、玫瑰根霉菌（）等真菌的相對豐度。氟環(huán)唑外消旋體及對映體暴露的真菌系統(tǒng)進(jìn)化物種組成明顯不同，并且存在立體選擇性差異。在門水平上，這些被影響的真菌主要為子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門等，多效唑也引起了這些真菌的顯著變化。土壤真菌，包括前面豐度顯著增加的細(xì)菌，對氟環(huán)唑在土壤中的降解起到了重要作用，部分微生物可將氟環(huán)唑作為碳源來維持自身生長，從而為土壤中微生物組成和數(shù)量的改變提供了可能。

2.4 不同對映體暴露下PICRUSt基因預(yù)測

2.4.1 細(xì)菌

PICRUSt基因預(yù)測分析應(yīng)用于土壤細(xì)菌能較為準(zhǔn)確地預(yù)測功能基因的存在與否及其豐度變化。通過PICRUSt預(yù)測和列舉不同處理組中顯著變化的細(xì)菌代謝通路，表現(xiàn)出功能上的豐富性，并基于Meta?Cyc數(shù)據(jù)庫比對出10條不同處理組間具有顯著生物學(xué)差異的代謝途徑（圖7）。在所列舉的代謝途徑中，氟環(huán)唑及其對映體暴露顯著增加了L-精氨酸降解Ⅱ（L-arginine degradationⅡ）、甲基萘醌-8生物合成超級通道Ⅱ（Superpathway of menaquinol-8 biosynthesisⅡ）、GDP-D-甘油-α-D-甘露庚糖生物合成（GDPD-glycero-α-D-manno-heptose biosynthesis）通路的功能基因豐度，顯著減少了甲基赤蘚糖醇磷酸途徑Ⅰ（Methylerythritol phosphate pathwayⅠ）、嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成Ⅲ（Pyrimidine deoxyribonucle?otides de novo biosynthesisⅢ）、聚（甘油磷酸）壁磷壁酸生物合成[Poly（glycerol phosphate）wall teichoic acid biosynthesis]等通路的功能基因豐度。另外，除去甲亞精胺生物合成（Norspermidine biosynthesis）和聚（甘油磷酸）壁磷壁酸生物合成通路在兩對映體處理中的功能基因豐度差異不顯著外，其他途徑兩對映體均表現(xiàn)出顯著差異，并且（+）-氟環(huán)唑影響整體大于（-）-氟環(huán)唑。多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物的PICRUSt功能預(yù)測分析結(jié)果表明，多效唑處理會降低土壤細(xì)菌的整體代謝能力。氟環(huán)唑處理引起了農(nóng)田土壤中細(xì)菌代謝功能的改變，并且（±）-和（+）-引起的差異水平大于（-）-，這種由（+）-驅(qū)動的對細(xì)菌功能基因的影響可能是（+）-毒性大于（-）-毒性的直接結(jié)果。

圖7 豐度顯著差異的MetaCyc通路（細(xì)菌）Figure 7 MetaCyc pathways with significant differences in abundance（bacteria）

2.4.2 真菌

根據(jù)PICRUSt預(yù)測結(jié)果，基于MetaCyc比對出22條不同處理組間具有顯著生物學(xué)差異的真菌功能基因代謝途徑（圖8），表現(xiàn)出了功能上的豐富性。三唑類殺菌劑的作用靶標(biāo)是基于稻瘟病等植物疾病的病原真菌，因此被影響的真菌功能代謝途徑多于細(xì)菌。在所列舉的代謝途徑中，氟環(huán)唑及其對映體暴露增加了15條代謝途徑的功能基因豐度，降低了7條途徑的功能基因豐度。同時，氟環(huán)唑外消旋體能最大程度地引起功能基因豐度的增加或降低，如：L-蛋氨酸生物合成Ⅲ（L-methionine biosynthesisⅢ）、有氧呼吸Ⅰ（細(xì)胞色素c）（[Aerobic respirationⅠ（cytochrome c）]、蔗糖降解Ⅲ（Sucrose degradationⅢ）等途徑只在（±）-處理中被顯著影響（<0.05）。而嘧啶脫氧核糖核苷酸從頭生物合成Ⅰ（Pyrimidine deoxyribonucleo?tides de novo biosynthesisⅠ）、甲基酮生物合成（Meth?yl ketone biosynthesis）、腺苷核苷酸從頭生物合成的超通路Ⅱ（Superpathway of adenosine nucleotides de novo biosynthesisⅡ）等途徑在兩對映體處理中表現(xiàn)出顯著差異。表明氟環(huán)唑影響了土壤真菌的代謝功能，并且（±）-和（+）-引起的差異水平大于（-）-，這與在細(xì)菌中觀察到的結(jié)果相同。

圖8 豐度顯著差異的MetaCyc通路（真菌）Figure 8 MetaCyc pathways with significant differences in abundance（fungi）

基于PICRUSt的細(xì)菌和真菌功能基因的代謝途徑預(yù)測結(jié)果表明，氟環(huán)唑及其對映體處理均引起了細(xì)菌和真菌相關(guān)功能基因代謝水平的改變。（+）-驅(qū)動的立體選擇性響應(yīng)表明微生物對氟環(huán)唑脅迫執(zhí)行了一定的氧化應(yīng)激（ROS）措施。有氧呼吸途徑在氟環(huán)唑及其對映體處理土壤中顯著增強(qiáng)，是由于土壤細(xì)菌和真菌通過增強(qiáng)呼吸強(qiáng)度促進(jìn)了脅迫反應(yīng)。與核糖核酸合成代謝有關(guān)的嘧啶、嘌呤、核苷和鳥苷等路徑是被影響最多的一類功能途徑。嘌呤和嘧啶代謝是控制細(xì)胞生化反應(yīng)各個方面的重要因子，其發(fā)生改變可能與氟環(huán)唑處理有直接關(guān)系。這些功能的變化可能是因?yàn)槲⑸飳?shí)施了與其他壓力相關(guān)功能過程重新分配能量和資源的策略。與能量循環(huán)（TCA）有關(guān)的糖代謝和氨基酸代謝過程也被影響，這可能與和跨膜運(yùn)輸相關(guān)的蛋白質(zhì)通道中的持續(xù)氧化應(yīng)激有關(guān)。同時，聚（甘油磷酸）壁磷壁酸、脂肪酸β氧化和磷脂重塑過程是微生物為維持細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞功能而對環(huán)境條件做出的直接反應(yīng)。這些過程預(yù)示著磷脂脂肪酸（PLFA）的改變，這可能是由于氟環(huán)唑誘導(dǎo)了ROS的過度生成，ROS可以氧化微生物細(xì)胞膜上的脂肪酸；或者，微生物群落內(nèi)的群體可能會主動調(diào)整其膜的PLFA組成，以響應(yīng)氟環(huán)唑誘導(dǎo)的壓力?？傊h(huán)唑的暴露影響了農(nóng)田土壤微生物群落相關(guān)功能基因的豐度，進(jìn)而影響了微生物群落的生長代謝、信息傳遞等過程。

氟環(huán)唑及其對映體暴露后的農(nóng)田土壤，在微生物群落的氧化應(yīng)激過程中增強(qiáng)或減弱的代謝途徑加劇了土壤代謝組向著氟環(huán)唑不同單體環(huán)境改變，從而表現(xiàn)出立體選擇性，并且由（+）-驅(qū)動。值得注意的是，真菌群落比細(xì)菌群落對氟環(huán)唑的暴露更加敏感，氟環(huán)唑外消旋體更能引起土壤真菌代謝功能的改變?；诜前邢虼x組學(xué)、高通量測序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹重建和PICRUSt基因預(yù)測的聯(lián)合分析，為三唑類殺菌劑氟環(huán)唑在農(nóng)業(yè)土壤環(huán)境中的環(huán)境風(fēng)險評估提供了有力的理論依據(jù)。

3 結(jié)論

（1）氟環(huán)唑在農(nóng)田土壤中的降解不顯著，該暴露過程可引起土壤代謝組的改變，細(xì)菌和真菌群落組成的改變，以及PICRUSt基因預(yù)測代謝途徑的改變。

（2）PICRUSt基因功能預(yù)測結(jié)果表明，被影響的真菌功能代謝途徑多于細(xì)菌，氟環(huán)唑外消旋體及對映體對土壤細(xì)菌和真菌功能基因的影響表現(xiàn)為外消旋體和（+）-對映體引起的差異水平大于（-）-對映體。

（3）三唑類殺菌劑氟環(huán)唑在土壤微生物群落中的立體選擇性響應(yīng)被揭示，并且在土壤代謝組、系統(tǒng)發(fā)育樹重建及其組間豐度分布和PICRUSt基因預(yù)測代謝通路中表現(xiàn)出由（+）-對映體引起的一致性差異。