黑果枸杞花青素提取物對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用

閆淑萍 王 碩 陳 濤 申 誠 趙景陽 丁永淵 孔令繁 楊 麗 李玉林

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所, 青海 西寧 810001；2.中國科學(xué)院大學(xué) 存濟(jì)醫(yī)學(xué)院, 北京 100049；3.青海金麥杞生物科技有限公司, 青海 西寧 810003)

由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來的生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的變化,痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年增長且呈現(xiàn)年輕化趨勢,全球痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患病率約達(dá)10%[1-2]。 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎分為急性期、間歇期和慢性痛風(fēng)石期,其中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis, AGA)是由于機(jī)體嘌呤代謝紊亂、血清尿酸水平升高,尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨和其他組織中,從而刺激關(guān)節(jié)引起的關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織的病損或炎癥反應(yīng)的急性發(fā)作[3-4],早期發(fā)病隱匿,一旦發(fā)作難以根治且易反復(fù),臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫灼熱、劇烈疼痛、行動不便,常伴隨著腎臟疾病和關(guān)節(jié)的不可逆損傷,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[5]。 目前,治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎以消炎鎮(zhèn)痛和降低血清尿酸為主[6],臨床常用秋水仙堿聯(lián)合非布司他、溴苯馬龍以及非甾體類藥物等西藥治療,雖然效果明顯,但停藥后易復(fù)發(fā),長期服用還會出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)及肝腎功能損傷[7]。 中醫(yī)藥治療痛風(fēng)歷史悠久,具有多途徑、多層次的優(yōu)勢,且安全性更高[8-9],因此,在天然產(chǎn)物中尋找具有防治痛風(fēng)和降尿酸的功能性成分以及以此為基礎(chǔ)開發(fā)相關(guān)功能性食品成為發(fā)展大健康產(chǎn)業(yè)新的熱點(diǎn)。

黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)是茄科枸杞屬多棘刺落葉灌木,其果實(shí)富含花青素、多糖等活性成分,是目前發(fā)現(xiàn)的花青素含量最高的植物[10]。 黑果枸杞花青素屬于類黃酮物質(zhì),具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂等多種生物活性[11-13]。近年來,花青素的抗炎活性受到廣泛關(guān)注,并且有研究報道紫甘薯中的花青素具有降尿酸作用[14-15],但關(guān)于黑果枸杞花青素抗炎和降尿酸的研究鮮有報道。 微晶型尿酸鈉(microcrystalline sodium urate, MSU)誘發(fā)的急性關(guān)節(jié)炎,因表現(xiàn)出早期急性發(fā)作,迅速出現(xiàn)高峰和隨后緩解的特點(diǎn),符合人體急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀,且操作簡單、成功率高而成為國際上常用的AGA 模型,被廣泛用于篩選具有改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用的天然產(chǎn)物；氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑,能在短時間內(nèi)快速升高血清尿酸。 因此,本研究采用MSU 誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型和氧嗪酸鉀飼料誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥模型,分析黑果枸杞花青素提取物(anthocyanin extract ofLycium ruthenicum,AEL)對模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹、跛行步態(tài)、血清尿酸水平等指標(biāo)的影響,從抗炎和降尿酸方面評價AEL 對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用,以期為黑果枸杞資源的多元化開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 大鼠60 只,雄性,實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SYXK(津)2016-0009,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供,動物飼養(yǎng)符合國家實(shí)驗(yàn)動物福利指南及實(shí)驗(yàn)動物倫理規(guī)范。 飼養(yǎng)條件:標(biāo)準(zhǔn)屏障系統(tǒng)動物房,溫度(22 ±2) ℃,濕度40% ～60%,12 h 光照晝夜交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)原料與試劑

黑果枸杞,由青海金麥杞生物科技有限公司提供,中國科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥標(biāo)準(zhǔn)化與新藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室鑒定為黑果枸杞(Lycium ruthenicumMurr.)的干燥果實(shí)；秋水仙堿片,西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司；生理鹽水,河北天成藥業(yè)股份有限公司；尿酸檢測試劑盒(C012-2),南京建成生物工程研究所；微晶型尿酸鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%氧嗪酸鉀飼料,天津藥物研究院新藥評價有限公司；LESINURAD,上海再啟生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Multiskan FC 型酶標(biāo)儀,美國賽默飛世爾科技有限公司；PV-200 型足趾容積測量儀,成都泰盟科技有限公司；ECA522 型電子天平、ECC2201 型電子天平,南京伯尼塔科學(xué)儀器有限公司；CTXNW-110B 型循環(huán)超聲提取機(jī),北京宏祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；GQ105B 型管式離心機(jī),上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；GLZ-1B 型冷凍干燥機(jī),上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司；SJN-150-00 型雙效濃縮器,浙江溫兄機(jī)械閥業(yè)有限公司；BM-40 型純水機(jī),北京中盛茂源科技發(fā)展有限公司。

1.4 黑果枸杞花青素樣品的制備

稱取10 kg 黑果枸杞干果去梗、破碎,過60 目篩,置于超聲提取機(jī)中,加150 L 去離子水超聲提取30 min,超聲功率500 W,提取完成后放出提取液,再加150 L 去離子水,重復(fù)上述提取過程。 合并兩次水提液約280 L,20000 r/min 離心5 min,收集上清液。 上清液以100 L/h 流速泵入大孔樹脂柱(樹脂柱規(guī)格:100L,樹脂型號:AB-8,樹脂量:35 kg),用100 L 去離子水洗脫后,再用300 L 體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇洗脫,收集洗脫組分,在45 ℃、 -0.07 MPa條件下用雙效濃縮器減壓濃縮得到濃縮液10 L,置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥得到黑果枸杞花青素提取物595.2 g,經(jīng)鑒定該組分花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.1%。

1.5 動物分組與處理

選用健康SD 大鼠60 只,雄性,體重185 ～210 g,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分組。 分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、AEL 高劑量組(238 mg/kg)和AEL 低劑量組(59.5 mg/kg),每組12 只,分兩批(6 只/批)。 按上述分組灌胃,其中正常對照組及模型對照組灌胃給予等量蒸餾水,陽性對照組在造模5 天前灌胃給予秋水仙堿(1 mg/kg),灌胃容積均為10 mL/kg,每天一次。 第一批灌胃2周,第二批灌胃4 周。

1.6 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的檢測

取1.5 節(jié)的第一批大鼠進(jìn)行踝關(guān)節(jié)腫脹測定實(shí)驗(yàn)。 參考文獻(xiàn)方法[16-17],正常對照組大鼠右踝關(guān)節(jié)背側(cè)注射生理鹽水0.2 mL(關(guān)節(jié)伸直45°進(jìn)針),其余各組在右踝關(guān)節(jié)背側(cè)注射50 mg/mL MSU 混懸液0.2 mL 造模。 用足趾容積測量儀分別測定造模前和造模后6 h、24 h 大鼠右踝關(guān)節(jié)容積。

取1.5 節(jié)的第二批大鼠按照相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測定造模前和造模后6、24、48 h 大鼠踝關(guān)節(jié)容積。

1.7 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠步態(tài)的檢測

觀察并記錄1.6 節(jié)的各組大鼠造模前后的步態(tài)變化。 第一批大鼠記錄造模前和造模后6 h、24 h 步態(tài),第二批大鼠記錄造模前和造模后6、24、48 h 步態(tài)。 參照文獻(xiàn)分級標(biāo)準(zhǔn)[17],0 級,正常行走,記為0分；1 級,輕微跛行,受試下肢略有彎曲,記為1 分；2級,中度跛行,受試下肢剛觸及地面,記為2 分；3級,重度跛行,受試下肢離開地面,三足著地行走,記為3 分。 統(tǒng)計(jì)各組大鼠得分。

1.8 大鼠血清尿酸濃度的檢測

將造模后的兩批大鼠按1.5 節(jié)方法持續(xù)灌胃至5周,陽性對照組改用LESINURAD(尿酸重吸收抑制劑,由FDA 在2015年批準(zhǔn)與黃嘌呤氧化酶抑制劑聯(lián)用,用于治療與痛風(fēng)相關(guān)的高尿酸血癥[18-19]),在測定前3 d連續(xù)灌胃,劑量為40 mg/kg。 參考文獻(xiàn)方法[20-21],末次灌胃后,各組大鼠喂食質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%氧嗪酸鉀飼料,分別于2 h、3 h 尾靜脈采血,3500 r/min 離心10 min 取血清,按照試劑盒方法測定大鼠血清尿酸水平。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,以SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用t 檢驗(yàn)及進(jìn)行組間比較,有等級關(guān)系的采用等級序值法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 黑果枸杞花青素提取物對大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

AEL 灌胃2 周后,對AGA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響見表1。 由表1 可知,與正常對照組比較,模型對照組踝關(guān)節(jié)容積明顯增加(P＜0.01),表明模型建立成功。 與模型對照組比較,秋水仙堿能夠明顯減輕造模后6、24 h 的踝關(guān)節(jié)腫脹(P＜0.01,P＜0.05)；AEL 高劑量能明顯減輕造模6 h 后的踝關(guān)節(jié)腫脹(P＜0.05),對減輕造模24 h 后踝關(guān)節(jié)腫脹效果不明顯；AEL 低劑量對造模后6 h、24 h 的踝關(guān)節(jié)腫脹無顯著影響。

表1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周對MSU 誘導(dǎo)的AGA 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響Tab.1 Effect of AEL gavage for 2 weeks on ankle joint swelling in rats with AGA induced by MSU

大鼠AGA 模型中,造模4 h 后大鼠踝關(guān)節(jié)開始腫脹,6 ～8 h 達(dá)到高峰,一般可維持至24 h。 本研究中發(fā)現(xiàn)AEL 灌胃4 周后,大鼠體重增加,造模后腫脹度明顯升高,踝關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹,故灌胃4 周后增加了48 h 的測定時間點(diǎn),見表2。 由表2 可知,與正常對照組比較,造模后6 ～48 h,模型對照組大鼠踝關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹(P＜0.01)。 秋水仙堿在6、24、48 h 的踝關(guān)節(jié)腫脹均顯著低于模型組(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.05)；AEL 高、低劑量均能顯著減輕大鼠造模后6 h、24 h 踝關(guān)節(jié)腫脹(P＜0.01、P＜0.05),造模后48 h 的關(guān)節(jié)腫脹度有減小趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周對MSU 誘導(dǎo)的AGA 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響Tab.2 Effect of AEL gavage for 4 weeks on ankle joint swelling in rats with AGA induced by MSU

研究表明,AEL 能夠顯著減輕MSU 誘導(dǎo)的大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹,并與攝入時間和劑量成正比。

2.2 黑果枸杞花青素提取物對大鼠步態(tài)的影響

AEL 灌胃2 周對大鼠步態(tài)的影響見圖1。 與正常對照組比較,模型對照組大鼠右后肢彎曲,活動減少,受試下肢離開地面,呈三足著地行走步態(tài)。 與模型對照組比較,AEL 灌胃2 周后,AEL 高劑量能緩解造模6 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05),AEL 低劑量對改善大鼠跛行步態(tài)效果不顯著,秋水仙堿能顯著改善造模6、24 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.01)。

圖1 黑果枸杞花青素提取物灌胃2 周對MSU 誘導(dǎo)的AGA 大鼠跛行步態(tài)的影響Fig.1 Effect of AEL gavage for 2 weeks on claudication gait in rats with AGA induced by MSU

AEL 灌胃4 周對大鼠步態(tài)的影響見圖2。 與模型對照組比較,AEL 灌胃4 周后,AEL 高、低劑量均能顯著改善造模6 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05),AEL 高劑量能持續(xù)改善模24 h 后大鼠跛行步態(tài)(P＜0.05)。

圖2 黑果枸杞花青素提取物灌胃4 周對MSU 誘導(dǎo)的AGA 大鼠跛行步態(tài)的影響Fig.2 Effect of AEL gavage for 4 weeks on claudication gait in rats with AGA induced by MSU

2.3 黑果枸杞花青素提取物對大鼠血清尿酸的影響

AEL 灌胃5 周對大鼠血清尿酸水平的影響見表3。與正常對照組比較,模型對照組大鼠喂食質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%氧嗪酸鉀飼料后2 h、3 h 血清尿酸顯著升高(P＜0.01),模型制備成功；與模型對照組比較,AEL 高、低劑量均能明顯抑制血清尿酸升高(P＜0.05),且3 h 后AEL 高、低劑量組大鼠血清尿酸水平顯著低于模型對照組,AEL 高、低劑量組抑制血清尿酸升高的作用相當(dāng)。 結(jié)果表明,AEL 對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的大鼠血清尿酸水平升高有明顯抑制作用。

表3 黑枸杞花青素提取物灌胃5 周對大鼠血清尿酸的影響Tab.3 Effect of AEL gavage for 5 weeks on levels ofserum uric acid in rats

3 結(jié)論

尿酸排泄減少或尿酸生成過多使得機(jī)體尿酸持續(xù)在較高水平,導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔尿酸鹽晶體析出而誘發(fā)炎癥,被認(rèn)為是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的關(guān)鍵病理過程[22]。 本研究發(fā)現(xiàn)AEL 能改善AGA 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度和跛行步態(tài),同時具有降尿酸的作用,并呈時間劑量依賴性,提示AEL 能從抗炎和降尿酸兩個方面緩解大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作時的癥狀。 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,后續(xù)將對黑果枸杞花青素提取物在防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究,為黑果枸杞花青素防治痛風(fēng)的功能性食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。