α-螺旋抗菌肽YHX-1 的從頭設(shè)計(jì)及抑菌活性研究

李劍勛 步雨珊 劉銀雪 劉伊索 印伯星 周 煒 易華西

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266003；2.揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司, 江蘇 揚(yáng)州 225000)

食品安全是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的重大問(wèn)題,其中微生物安全是食品安全中的主要問(wèn)題。 多年來(lái)抗生素在食品產(chǎn)業(yè)鏈不同環(huán)節(jié)的過(guò)度使用和濫用,導(dǎo)致致病菌或食品腐敗菌的耐藥性不斷提高[1]。 因此,尋求安全、高效且不易引起耐藥的新型抗生素替代品是目前食品安全和生物替抗領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。 抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),是一類具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒等多種生物活性的小分子多肽,其憑借獨(dú)特的膜穿孔機(jī)制發(fā)揮抗菌作用[2]。 由于具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制,不易使致病菌產(chǎn)生耐藥性,AMPs 在食品安全和生物替抗領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景；但大部分AMPs 存在抑菌譜窄、抑菌活性低、生物相容性差和生產(chǎn)成本高等問(wèn)題,限制了其應(yīng)用。因此,亟需開發(fā)抑菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、安全性高且成本低廉的AMPs。

盡管AMPs 的作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議,但普遍認(rèn)為AMPs 的活性發(fā)揮依賴于肽序列中疏水性和陽(yáng)離子殘基排列而成的兩親性結(jié)構(gòu)[3]。 研究表明,提高疏水性和疏水力矩可以同時(shí)提高抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的穿透力和溶血活性[4]。 因此,通過(guò)改變AMPs的疏水性和兩親性分布,使抑菌活性和生物相容性達(dá)到理想的平衡狀態(tài)是AMPs 理性設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。Jiang 等[5]在α-螺旋肽的非極性表面引入帶有正電荷的賴氨酸,改造后的肽在保留了抑菌活性的同時(shí)溶血活性降低,細(xì)胞選擇性提高。 Misawa 等[6]將賴氨酸殘基設(shè)計(jì)在螺旋結(jié)構(gòu)的一側(cè),將亮氨酸和丙氨酸殘基置于螺旋的另一側(cè),得到的肽抑菌活性良好且細(xì)胞毒性較低。 由于α-螺旋在序列排列上具有周期性,因此易于對(duì)其兩親性特征進(jìn)行設(shè)計(jì)。 隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展,使得基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、預(yù)測(cè)及分析工具獲得新型AMPs 的方法越來(lái)越具有可行性和科學(xué)性[7]。 本研究結(jié)合Database filtering 方法[8]、合理設(shè)計(jì)思路以及生物信息學(xué)工具進(jìn)行新型AMPs 的從頭設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)方法便捷高效,避免了傳統(tǒng)序列優(yōu)化方法的盲目性和不確定性,得到了一條具有廣譜、高效抑菌活性,高細(xì)胞選擇性的YHX-1,旨在為解決AMPs 的應(yīng)用瓶頸提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐,為開發(fā)新一代高效、安全的AMPs 提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coliATCC 25922)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimuriumATCC 14028)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 8095)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenesATCC 19115)、變異鏈球菌(Streptococcus mutansATCC 25175),中國(guó)海洋大學(xué)功能性乳品與益生菌工程研究室。 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；LB 肉湯培養(yǎng)基、BHI 肉湯培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、瓊脂粉,青島海博生物技術(shù)有限公司；三氟乙醇TFE、十二烷基硫酸鈉SDS、MTT 噻唑藍(lán)、TritonX-100,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC 型酶標(biāo)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司；TGL-16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；SHP-250 型生化培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；THZ-98A 型恒溫振蕩器,上海一恒科技有限公司；BHC-1300IIA 型二級(jí)生物安全柜,蘇州凈化設(shè)備有限公司；LCI-270型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；J-815 型圓二色(CD)光譜儀,日本分光株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 AMPs 的從頭設(shè)計(jì)

從抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)APD[9]中篩選出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性的AMPs 序列組成序列子集,對(duì)序列長(zhǎng)度、帶電荷數(shù)、疏水氨基酸比例和氨基酸組成等序列參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,按照優(yōu)勢(shì)參數(shù)的選取原則確定新設(shè)計(jì)AMPs 的序列特征參數(shù)。 采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及分析工具,使用數(shù)據(jù)庫(kù)CAMPR3、DRAMP 及DBAASP[10-12]對(duì)不同氨基酸排列順序的肽序列成為AMPs 的概率進(jìn)行預(yù)測(cè),使用軟件Heliquest、Expasy[13-14]對(duì)序列相對(duì)分子質(zhì)量、平均疏水值、平均疏水力矩、不穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪族指數(shù)、半衰期、螺旋輪圖等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,使用I-TASSER、Pep-fold[15-16]對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),并利用PyMOL 軟件可視化,進(jìn)而篩選出最優(yōu)的AMPs序列。

1.3.2 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性

抗菌肽由強(qiáng)耀生物科技(上海)有限公司合成,單次制備量為10 mg,純度高于95%,冷凍干燥后分裝規(guī)格為1 mg/管。 抗菌肽凍干粉保存于-20 ℃環(huán)境中,現(xiàn)用現(xiàn)配,溶液可短期保存至4 ℃冰箱中。 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門氏菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基,單增李斯特菌和變異鏈球菌接種于BHI 肉湯培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。配置LB 和BHI 半固體培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%),待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃后以每皿20 mL 的體積量,加入7 μL 菌液振蕩混勻后倒入擺放好牛津杯的培養(yǎng)皿中,待培養(yǎng)基凝固后拔除牛津杯完成打孔。 每孔中加入160 μL AMPs 溶液(配置使用1 mg 抗菌肽溶于3 mL 超純水),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后測(cè)量抑菌圈直徑[17],測(cè)量3 次取平均值。

1.3.3 最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測(cè)定

參考Tang 等[18]的方法,向96 孔板中加入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期稀釋至1 × 106CFU/mL 的菌液50 μL,同時(shí)采用二倍稀釋法在孔中加入各濃度梯度AMPs 溶液(4 ～512 μg/mL)50 μL,并以未加AMPs的菌液作為陰性對(duì)照組,空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。 在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h 后測(cè)量各孔的OD600nm,取菌株生長(zhǎng)被完全抑制的最低濃度作為AMPs 的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。 從所有菌株生長(zhǎng)被完全抑制的孔中吸取50 μL 樣液,涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后計(jì)算菌落數(shù),以殺死99.9%細(xì)菌的最低藥物濃度作為AMPs 的最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。

1.3.4 殺菌動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

以單增李斯特菌為指示菌,將其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并調(diào)整菌落數(shù)至1 ×105CFU/mL,同最小殺菌濃度的AMPs 溶液混合后,分別于0、5、10、20、30、60、120、240、300 min 取樣,用生理鹽水(質(zhì)量濃度為0.009 g/mL 的NaCl 溶液)稀釋至合適倍數(shù)后涂布于BHI 固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后統(tǒng)計(jì)細(xì)菌存活情況。

1.3.5 AMPs 穩(wěn)定性測(cè)定

參考Mishra 等[8]的方法,以單增李斯特菌作為指示菌,探究不同環(huán)境條件對(duì)AMPs 抗菌活性的影響。 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單增李斯特菌分別在含有200 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、10% ～25%人血漿,以及微酸性(pH 值5.4、6.8、7.4)培養(yǎng)環(huán)境中與AMPs 共孵育,按照1.3.3 節(jié)的方法測(cè)定MIC 的變化。

1.3.6 溶血活性測(cè)定

在簽訂知情同意書的前提下,用采血針抽取1 mL 來(lái)自健康志愿者的新鮮血液置于肝素鈉抗凝管中,4000 r/min 離心10 min 后取沉淀,將紅細(xì)胞用PBS 緩沖液沖洗3 次并重懸。 在96 孔板中加入終濃度為4 ～512 μg/mL AMPs 溶液與紅細(xì)胞懸液共孵育,以PBS 緩沖液作為陰性對(duì)照,以TritonX-100(質(zhì)量濃度為0.001 g/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照。 在37 ℃恒溫孵育1 h 后,離心取上清液并使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm[19]。 溶血活性計(jì)算如式(1)。

式(1)中,AT為實(shí)驗(yàn)組的吸光度；AC為陽(yáng)性對(duì)照組的吸光度；AO為陰性對(duì)照組的吸光度。

1.3.7 細(xì)胞毒性測(cè)定

參考Khara 等[20]的方法,測(cè)定了YHX-1 對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7 的細(xì)胞毒性。 將凍存于液氮中的RAW264.7 細(xì)胞復(fù)蘇后在含有胎牛血清(體積分?jǐn)?shù)為10%)和雙抗(質(zhì)量濃度為0.01 g/mL)的DMEM 培養(yǎng)基中,37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。 以1 ×104細(xì)胞/mL 的密度將細(xì)胞接種于96 孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 待細(xì)胞貼壁后,吸去舊培養(yǎng)基,加入200 μL 使用二倍稀釋法得到的不同質(zhì)量濃度 YHX - 1 溶液(4 ～512 μg/mL)處理24 h。 隨后,用200 μL 新鮮DMEM和40 μL MTT(5 mg/mL)溶液取代培養(yǎng)基,并在37 ℃下再孵育4 h。使用150 μL 的DMSO 溶解得到的甲瓚晶體,并在595 nm 下測(cè)量吸光度。 以未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對(duì)照組并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.8 圓二色光譜分析

使用CD 光譜法測(cè)定YHX-1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。將YHX-1 分別溶于10 mmol/L PBS(pH =7.4)溶液、體積分?jǐn)?shù)50% 的三氟乙醇(TFE) 溶液和30 mmol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中,使肽的終濃度為200 μmol/mL。 配置好的多肽溶液加入光徑為1 mm 的比色皿中,在室溫條件下用CD 光譜儀測(cè)定YHX-1 在190 ～250 nm 的橢圓率,掃描速度為100 nm/min,重復(fù)3 次取平均值,并根據(jù)式(2)計(jì)算多肽的平均殘基橢圓率。

式(2)中,θM為平均殘基橢圓率,deg·cm2·dmol-1；θobs為實(shí)測(cè)橢圓率,mdeg；c為多肽濃度,mmol/L；l為光徑,mm；n為多肽中的氨基酸殘基個(gè)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,方差分析采用SPSS 23.0 軟件中One-way ANOVA 分析,P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMPs 的設(shè)計(jì)結(jié)果

將從AMPs 數(shù)據(jù)庫(kù)APD 中篩選得到的843 條AMPs 序列組成序列子集,該序列子集包括了已被證實(shí)對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌有抗菌活性的天然及人工合成AMPs。 對(duì)AMPs 序列參數(shù)進(jìn)行分析,包括序列長(zhǎng)度、帶電荷數(shù)、疏水氨基酸比例和氨基酸組成等。 依據(jù)Database filtering 方法中的優(yōu)勢(shì)參數(shù)選取原則同時(shí)結(jié)合合理設(shè)計(jì)思路,確定了新型AMPs 的各項(xiàng)序列參數(shù)(見表1)。

為降低合成成本,同時(shí)降低細(xì)胞毒性,序列長(zhǎng)度選擇參數(shù)頻率第一位的13。 選取在數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)頻率最高的甘氨酸Gly、賴氨酸Lys、絲氨酸Ser、亮氨酸Leu 組成AMPs 序列,其中帶正電氨基酸Lys 和極性不帶電荷氨基酸Ser 組成抗菌肽的極性面,選取疏水性氨基酸Leu 形成疏水面,來(lái)保證AMPs 的兩親性結(jié)構(gòu)。 電荷數(shù)確定為+ 5,保證AMPs 對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的親和力。 在此基礎(chǔ)上使用Expasy 和Heliquest 對(duì)不同氨基酸排列順序肽序列的螺旋輪圖及物化性質(zhì)進(jìn)行分析,使用I-TASSER等對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),篩選得到的最優(yōu)肽序列YHX-1 及物化性質(zhì)如表1,螺旋輪圖及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1。

表1 YHX-1 的序列參數(shù)及物化性質(zhì)Tab.1 Sequence parameters and physicochemical properties of YHX-1

圖1 YHX-1 的螺旋輪圖及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Helical wheel and predicted secondary structure of YHX-1

通過(guò)GRAVY(總平均疏水值)和疏水力矩可以看出預(yù)測(cè)的肽序列具有適中的疏水性和較好的兩親性,在對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜具有較好親和力的同時(shí)有利于深入細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,進(jìn)而破壞細(xì)胞膜的完整性。 脂肪族指數(shù)(aliphatic index)和不穩(wěn)定性指數(shù)(instability index)均被認(rèn)為與肽的穩(wěn)定性相關(guān),其中不穩(wěn)定性指數(shù)低于40 表明了序列較好的穩(wěn)定性,通過(guò)預(yù)測(cè)結(jié)果可知YHX-1 具有較好的穩(wěn)定性。 基于3 種不同算法(SVM、Random Forest、ANN) 使用CAMPR3 對(duì)AMPs 的成肽可能性進(jìn)行預(yù)測(cè),肽序列YHX-1 的成肽可能性均在0.94 以上。

2.2 YHX-1 的抑菌活性分析

通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度的測(cè)定以及殺菌動(dòng)力學(xué)曲線對(duì)YHX-1 的體外抑菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),見表2。 結(jié)果表明,YHX-1 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、變異鏈球菌)和革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌)均有明顯的抑菌活性。 其中,對(duì)單增李斯特菌的抑菌圈直徑最大,達(dá)到了20.56 mm。最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測(cè)定結(jié)果表明, YHX - 1 對(duì)不同致病菌的 MIC 在4 ～128 μg/mL,其中對(duì)單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果最好,MIC 均為4 μg/mL。 YHX-1 對(duì)各株致病菌的MBC 為MIC 的1 ～4 倍,與朱潔[22]的結(jié)果一致。 YHX-1 在1 ×MBC(8 μg/mL)對(duì)單增李斯特菌的殺菌動(dòng)力學(xué)曲線如圖2。 由圖2 可知,YHX-1 在2 h 內(nèi)可殺死99.99%以上的菌體,具有很高的殺菌效率。

圖2 YHX-1 對(duì)單增李斯特菌的殺菌動(dòng)力曲線Fig.2 Time-killing curve of L. monocytogenes treated with YHX-1

表2 YHX-1 對(duì)致病菌的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activity of YHX-1 against pathogenic bacteria

2.3 YHX-1 的穩(wěn)定性分析

在鹽離子和血漿環(huán)境中的活性降低一直是AMPs 開發(fā)中不可忽視的問(wèn)題。 血漿中的高密度脂蛋白和清蛋白與LL-37 結(jié)合后可使其失活[23],鹽離子可能通過(guò)降低陽(yáng)離子AMPs 對(duì)細(xì)胞膜表面的靜電吸附力或降低AMPs 與細(xì)菌外膜的相互作用降低抗菌肽的抑菌活性[24]。 本研究探究了在不同體積分?jǐn)?shù)血漿、不同鹽離子濃度以及不同pH 值下YHX-1 的MIC 變化情況(表3)。 結(jié)果表明,隨著培養(yǎng)環(huán)境中血漿體積分?jǐn)?shù)的增大, YHX-1 對(duì)單增李斯特菌的抑菌活性不斷降低。 在體積分?jǐn)?shù)25%的血漿環(huán)境下,MIC 增大到32 μg/mL,為原來(lái)的8 倍。 在Na+和Ca2+環(huán)境中YHX-1 對(duì)單增李斯特菌的MIC 會(huì)提高2 ～4 倍,說(shuō)明YHX-1 對(duì)鹽離子具有一定的敏感性,但仍然會(huì)保持良好的抗菌活性。 比較研究了5.4、6.8 和7.4 這3 個(gè)pH 梯度對(duì)肽抑菌活性的影響,結(jié)果表明,不同的微酸性環(huán)境對(duì)YHX-1 的MIC不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。

表3 不同環(huán)境條件下YHX-1 對(duì) 單 增 李斯特菌的MICTab.3 MIC of YHX-1 against L. monocytogenes at different environmental conditions

2.4 YHX-1 的溶血活性分析

由于AMPs 通過(guò)與膜直接作用發(fā)揮抗菌活性,當(dāng)多肽中各項(xiàng)序列參數(shù)失衡時(shí),AMPs 不僅可以殺滅致病微生物,對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞同樣會(huì)存在裂解毒性。 天然及人工合成的AMPs 往往具有溶血活性,如天然線性陽(yáng)離子肽蜂毒肽(melittin) 在2.219 μg/mL時(shí)即會(huì)引起10%以上的人血紅細(xì)胞溶血[25]。 因此缺乏足夠的細(xì)胞選擇性是當(dāng)前AMPs廣泛應(yīng)用的主要瓶頸之一。 本研究測(cè)定了YHX-1對(duì)人血紅細(xì)胞的溶血活性(圖3)。 結(jié)果表明,在測(cè)試質(zhì)量濃度下(2 ～256 μg/mL),YHX-1 的溶血率均低于10%；256 μg/mL 的溶血率為4.71%,8 μg/mL 僅會(huì)引起0.57%的人紅細(xì)胞溶血。 Zhang 等[26]以蜂毒肽為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)當(dāng)將疏水表面的丙氨酸和異亮氨酸替換為帶正電荷的極性氨基酸賴氨酸或精氨酸后,肽A(A1R、A8R、I17R)的最小溶血濃度增至200 μmol/L,同時(shí)抗菌活性與原肽相似。 因此,本研究設(shè)計(jì)的YHX-1 細(xì)胞選擇性高,具有很好的生物相容性。

圖3 YHX-1 對(duì)人紅細(xì)胞的溶血活性Fig.3 Hemolytic activity of YHX-1 on human erythrocytes

2.5 YHX-1 的細(xì)胞毒性分析

使用MTT 法測(cè)定了不同質(zhì)量濃度的YHX-1 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)胞毒性,結(jié)果如圖4。 YHX-1對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的毒性作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,且與溶血活性表現(xiàn)出相同的作用趨勢(shì)。 在低于16 μg/mL 時(shí),YHX-1 作用24 h 后的細(xì)胞存活率均在90.00% 以上；而當(dāng)肽質(zhì)量濃度增大到256 μg/mL時(shí),YHX-1 對(duì)RAW 264.7 的細(xì)胞毒性較明顯,細(xì)胞存活率降低至66.55%。 因此,YHX-1質(zhì)量濃度在MIC 時(shí)表現(xiàn)出了較好的生物相容性。

圖4 YHX-1 對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.4 Cytotoxicity of YHX-1 on RAW 264.7 cells

2.6 YHX-1 的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

CD 光譜用于研究各種環(huán)境中多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究使用50% TFE 模擬疏水性環(huán)境,用于評(píng)估多肽的固有螺旋傾向,30 mmol/L SDS 模擬磷脂雙分子層的陰離子環(huán)境,10 mmol/L PBS(pH=7.4)模擬親水環(huán)境,結(jié)果如圖5。 YHX-1 在30 mmol/L SDS和50% TFE 環(huán)境中,在192 nm 附近出現(xiàn)正峰,在208、222 nm 附近出現(xiàn)2 個(gè)特征性的負(fù)峰,說(shuō)明在細(xì)胞膜模擬環(huán)境中均呈現(xiàn)α-螺旋構(gòu)象。 而YHX-1 在PBS 模擬的水相環(huán)境中呈現(xiàn)無(wú)規(guī)卷曲的狀態(tài)。

圖5 YHX-1 在不同環(huán)境中的圓二色光譜Fig.5 CD spectra of YHX-1 in different environments

3 結(jié)論

結(jié)合Database filtering 方法、合理設(shè)計(jì)及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及分析工具設(shè)計(jì)得到了對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有良好抑菌活性的肽YHX-1。YHX-1 對(duì)單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌的MIC為4 μg/mL,在2 h 內(nèi)可殺死99.99%以上的菌體,256 μg/mL 時(shí)的溶血率為4.71%,同時(shí)具有良好的鹽離子及血漿穩(wěn)定性和生物相容性。 圓二色光譜分析表明,YHX-1 在細(xì)胞膜模擬環(huán)境中呈現(xiàn)典型的α-螺旋構(gòu)象。 YHX-1 具有抑菌譜廣、抑菌活性高、細(xì)胞選擇性好、序列短及合成成本低等優(yōu)點(diǎn),有望作為一種生物抗菌劑應(yīng)用于食品防腐保鮮和生物替抗領(lǐng)域。 同時(shí),本研究應(yīng)用的AMPs 從頭設(shè)計(jì)方法較為便捷高效,可為開發(fā)新一代高效、安全的AMPs 提供參考。