不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群和短鏈脂肪酸的影響

陳博睿 付永霞 侯殿志 王 晗 薛 勇 王顯瑞 沈 群

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/國(guó)家糧食產(chǎn)業(yè)(青稞深加工)技術(shù)創(chuàng)新中心/植物蛋白與谷物加工北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心, 北京 100083；2.赤峰市農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院, 內(nèi)蒙古 赤峰 024029)

近年來(lái),雜糧因其良好的健康功效受到廣泛關(guān)注。 目前關(guān)于雜糧的研究多集中在對(duì)肥胖、糖尿病等慢性疾病的緩解作用方面,如許陽(yáng)等[1]用不同添加量的燕麥飼料喂養(yǎng)肥胖小鼠,發(fā)現(xiàn)20%攝入量的燕麥降血脂效果最好；陳新宇等[2]用不同添加量的小米飼料干預(yù)高血脂小鼠,發(fā)現(xiàn)40%攝入量的小米降體重的效果最好。 盡管《中國(guó)居民膳食指南(2021)》中推薦每日攝入一定量谷薯類(lèi)食物,但針對(duì)雜糧攝入量還未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。 小米是我國(guó)產(chǎn)量最高的雜糧之一,許多研究已經(jīng)表明小米有良好的健康功效[3],但小米存在蛋白質(zhì)消化率低、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量高等問(wèn)題[4],高攝入量的小米可能會(huì)對(duì)正常小鼠的健康產(chǎn)生負(fù)面作用,所以有必要評(píng)價(jià)不同小米攝入量對(duì)機(jī)體的影響。

腸道菌群被稱(chēng)為人類(lèi)的“第二基因組”,影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收和能量平衡,是目前研究人類(lèi)健康的熱點(diǎn)。 飲食是影響腸道菌群的關(guān)鍵因素,不同的飲食模式對(duì)應(yīng)著不同的腸道菌群結(jié)構(gòu)[5]。 不同雜糧攝入量與腸道菌群之間的關(guān)系尚缺乏研究,尤其是高攝入量下腸道菌群的變化。 此外,小米中富含抗性淀粉等膳食纖維[6],能夠被腸道菌群利用產(chǎn)生短鏈脂肪酸[7](short-chain fatty acids, SCFAs),而目前小米攝入量與腸道短鏈脂肪酸水平之間的關(guān)系還不明確。 本研究擬用小米添加量為20%、40%、60%、80%的飼料喂養(yǎng)3 周齡初斷乳的C57BL/6J小鼠,采用自動(dòng)血生化分析儀、16S rRNA 高通量基因測(cè)序和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),探究飼喂不同添加量的小米對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育、腸道菌群和短鏈脂肪酸的影響,希望為闡明雜糧攝入量與腸道菌群以及機(jī)體健康之間的關(guān)系提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料及試劑

3 周齡雄性C57BL/6J 小鼠60 只(初始體重11 ～15 g),購(gòu)于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司；小米(“東方亮”),購(gòu)于山西東方物華農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司；AIN-93G 純化飼料及小米特種飼料,購(gòu)于北京譯成科技有限公司。 硫酸(優(yōu)級(jí)純),西隴科學(xué)股份有限公司；無(wú)水乙醚(分析純),天津富宇精細(xì)化工有限公司；環(huán)己酮(分析純),上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、丙醇(色譜純),德國(guó)Fisher 公司。 乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%),德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Miseq PE300 型DNA 測(cè)序分析儀,美國(guó)Illumina公司；QP2010-Ultra 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,日本島津有限公司；3100 型自動(dòng)血生化分析儀,日本日立公司；Centrifuge 5430R 型高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf 公司；Eclipse E100 型顯微鏡,日本Nikon公司；Wonbio-96c 型高通量組織破碎儀,上海萬(wàn)柏生物科技有限公司；SBL-10TD 型超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司；XH-C 型旋渦混合器,常州越新儀器制造有限公司；JXDC-20 型氮?dú)獯祾邇x,上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；LNG-T88 型快速離心濃縮干燥器,江蘇太倉(cāng)華美生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

小米經(jīng)碾米后用磨粉機(jī)打粉(不過(guò)篩)得到小米粉,將小米粉與超純水按質(zhì)量比1∶1混合蒸熟,在40 ℃烘箱烘干后再磨粉得到熟化小米粉,其基本營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。 蛋白質(zhì)根據(jù)GB 5009.5—2016 測(cè)定,脂肪根據(jù)GB 5009.6—2016 測(cè)定,膳食纖維根據(jù)GB 5009.88—2014 測(cè)定,灰分根據(jù)GB 5009.4—2016 測(cè)定,水分根據(jù)GB 5009.3—2016 測(cè)定,碳水化合物利用差減法計(jì)算。

表1 小米的基本營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 Basic nutrients of foxtail millet %

小米干預(yù)組的飼料與對(duì)照組的純化飼料營(yíng)養(yǎng)素保持一致。 為了保證營(yíng)養(yǎng)素的平衡,添加20%、40%、60%、80%小米粉后,相應(yīng)減少純化飼料中玉米淀粉、酪蛋白、麥芽糊精、大豆油、蔗糖的含量,進(jìn)行配比加工,得到不同添加量的小米組:M20、M40、M60 和M80,飼料配方和能量密度見(jiàn)表2。

表2 飼料配方Tab.2 Feed formula

動(dòng)物在SPF 級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l件》進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)方案得到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號(hào)為AW71302202-5-2。 所有小鼠用純化飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,按體重隨機(jī)分成5 組,每組12 只。 對(duì)照組(NC)繼續(xù)用純化飼料喂養(yǎng),其余4 組分別用小米質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% (M20)、40%(M40)、60%(M60)、80%(M80)的飼料喂養(yǎng)。 飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水,每周稱(chēng)重、記錄攝食量一次,共飼養(yǎng)12 周。 飼養(yǎng)結(jié)束后,對(duì)所有小鼠實(shí)施安樂(lè)死,解剖后收集小鼠的血液、肝臟、回腸、結(jié)腸等組織進(jìn)行后續(xù)分析檢測(cè)。

1.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

語(yǔ)言是教師提問(wèn)活動(dòng)的主要交流載體，因此，教師應(yīng)善于組織自己的提問(wèn)用語(yǔ)，盡量做到語(yǔ)句簡(jiǎn)潔明確，明確問(wèn)題的中心，為學(xué)生指出清晰的關(guān)注點(diǎn)，強(qiáng)調(diào)問(wèn)題的核心內(nèi)容。同時(shí)，教師的表達(dá)還要做到通俗易懂，且具有趣味性。詼諧幽默的課堂提問(wèn)方式可以有效提高教師的親和力，激發(fā)學(xué)生對(duì)問(wèn)題的回答欲望，通俗易懂的語(yǔ)言也便于學(xué)生理解。在教學(xué)中，要將學(xué)生視為教學(xué)主體去進(jìn)行提問(wèn)，一方面緩解了學(xué)生對(duì)問(wèn)題的思考難度，另一方面也將枯燥的語(yǔ)文課堂變得輕松快樂(lè)起來(lái)。

將采集的小鼠血液離心(3000 r/min、15 min、4 ℃)后獲得上清液即血清,使用自動(dòng)血生化分析儀測(cè)定小鼠血清中的總甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量,上樣量100 μL。

1.3.3 病理切片分析

將回腸、結(jié)腸用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定48 h 后,清洗組織中的殘留固定液,用體積分?jǐn)?shù)為75% ～100%的酒精梯度脫去組織水分,放入二甲苯透明,而后在石蠟中包埋。 將包埋好的組織在切片機(jī)上制成5 μm 的切片,再用二甲苯脫蠟,100%、95%、85%酒精清洗,蒸餾水復(fù)水。 將得到的切片用顯微鏡鏡檢,采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.4 腸道菌群分析

將小鼠飼養(yǎng)至第12 周,采用無(wú)菌操作收集其糞便,置液氮中冷凍,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待用。每組選取8 只小鼠(共40 只)糞便樣本進(jìn)行16S rRNA 高通量基因測(cè)序,利用Illumina 公司的NovaSeq PE250 平臺(tái)進(jìn)行分析。 對(duì)樣本進(jìn)行物種注釋與評(píng)估,在OTU 水平上計(jì)算Shannon、Simpson、Shannoneven、Simpsoneven 指數(shù),評(píng)估α-多樣性,利用PCoA 分析和NMDS 分析評(píng)估β-多樣性,距離算法為bray-curtis、組間差異檢驗(yàn)方法為ANOSIM。 用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)分析各組在門(mén)、科、屬水平上的顯著性差異,用fdr 多重檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正。

1.3.5 SCFAs 分析

收集小鼠盲腸內(nèi)容物,迅速用液氮凍存,轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。 稱(chēng)取10 mg 樣品,加入提取液(1 mL水和200 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50% 的硫酸)、100 μL 1 mg/mL 環(huán)己酮和2 mL 乙醚超聲萃取20 min,隨后在4000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。 色譜條件:Agilent DB - WAX 毛 細(xì) 管 柱(30 m × 0.25 mm,0.25 μm)；升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min,以30 ℃/min升至210 ℃,保持5 min；載氣(He)流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣,溶劑延遲時(shí)間3.5 min。 質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源,離子源溫度230 ℃,接口溫度220 ℃,乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸的目標(biāo)離子m/z設(shè)置為60、74、88、73、87、60,以SIM 模式采集數(shù)據(jù),采集間隔為0.3 s。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean ± SD)表示。用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,One-way ANOVA分析組間差異顯著性(P＜0.05 為差異顯著),用Graphpad Prism 8.0.1 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同攝入量小米對(duì)小鼠生理指標(biāo)的影響

以不同添加量小米飼料喂養(yǎng)3 周齡初斷乳小鼠12 周,記錄了5 組小鼠的體重、進(jìn)食量、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、肝臟質(zhì)量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。 如圖1(a)至圖1(d)所示,不同攝入量小米對(duì)小鼠體重、進(jìn)食量、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均沒(méi)有顯著影響。 如圖1(e)所示,M20、M40、M60 組的肝臟質(zhì)量與NC 組相比沒(méi)有顯著差異,但是M80 組小鼠的肝臟質(zhì)量顯著增加(P＜0.05)?？傮w來(lái)說(shuō),不同攝入量的小米對(duì)小鼠的表型沒(méi)有影響。

圖1 不同攝入量小米對(duì)小鼠生理指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of different foxtail millet intake on physiological indexes of mice

2.2 不同攝入量小米對(duì)小鼠血脂水平的影響

不同攝入量小米對(duì)小鼠血脂水平影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。 由圖2 可知,NC、M20、M40、M60 組的TC、TG、HDL-C、LDL-C 之間沒(méi)有顯著性差異,而M80 組與其余4 組相比,小鼠血清中的TG 沒(méi)有變化,TC、HDL-C、LDL-C 顯著增加(P＜0.05),這說(shuō)明小鼠的膽固醇水平較高,可能出現(xiàn)了脂代謝紊亂。

圖2 不同攝入量小米對(duì)小鼠血脂水平的影響Fig.2 Effect of different foxtail millet intake on blood lipid level of mice

2.3 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

在不同添加量小米飼料干預(yù)下,對(duì)小鼠的結(jié)腸、回腸的組織切片進(jìn)行了H&E 染色病理分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知,各組小鼠的回腸、結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)致密,黏膜層形態(tài)完整,腸絨毛清晰可見(jiàn),沒(méi)有受損跡象,說(shuō)明不同攝入量的小米對(duì)小鼠腸道組織形態(tài)和黏膜屏障的健康沒(méi)有影響。

圖3 小鼠回腸、結(jié)腸組織的H&E 染色結(jié)果Fig.3 H&E staining results of mice ileum and colon tissues

2.4 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 腸道菌群多樣性分析

對(duì)40 只小鼠糞便DNA 的16S rRNA 基因的V3 -V4 可變區(qū)測(cè)序,共得到了2132967 個(gè)有效序列,平均序列讀數(shù)為53324,按最小樣本序列(34185)抽平后的OTU 表進(jìn)行后續(xù)分析。 稀釋曲線是以隨機(jī)抽取的序列數(shù)為橫坐標(biāo),以α-多樣性指數(shù)值為縱坐標(biāo),根據(jù)曲線的平緩程度判斷測(cè)序量是否足夠。 以Sobs 指數(shù)和Shannon 指數(shù)兩個(gè)α-多樣性指數(shù)繪制了稀釋曲線,結(jié)果如圖4。 由圖4(a)和圖4(b)可知,Shannon 指數(shù)值和Sobs 指數(shù)值隨抽取的序列數(shù)的增加逐漸趨于平緩,說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,足以代表所有樣本的生物學(xué)信息。

圖4 腸道菌群的稀釋性曲線Fig.4 Rarefaction curve of gut microbiota

進(jìn)一步對(duì)小鼠腸道菌群的α-多樣性進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖5。 α-多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性,與Shannon 指數(shù)值成正比,與Simpson 指數(shù)值成反比。 由圖5(a)和圖5(b)可知,相比于NC、M20 和M40 組,M80 組的Shannon 指數(shù)顯著降低(P＜0.05),Simpson 指數(shù)顯著增大(P＜0.05),說(shuō)明80%攝入量的小米使小鼠腸道菌群α-多樣性下降,而M60 組的Shannon 指數(shù)有下降的趨勢(shì),與M80 組之間沒(méi)有顯著性差異。總體來(lái)說(shuō),過(guò)量(80%)的小米攝入導(dǎo)致小鼠腸道菌群多樣性下降,而60%攝入量可能是下降的拐點(diǎn)。 腸道菌群的均勻度與Shannoneven 指數(shù)和Simpsoneven 指數(shù)成正比,由圖5(c)和5(d)可知,M60 組和M80 組的Shannoneven 指數(shù)和Simpsoneven 指 數(shù) 相比 于NC、M20、M40 組 皆 顯 著 降 低(P＜0.05),這說(shuō)明60%和80%的攝入量使小鼠腸道菌群均勻度下降。

圖5 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群α-多樣性的影響Fig.5 Effect of different foxtail millet intake on α-diversity of gut microbiota in mice

利用PCoA 分析和NMDS 分析評(píng)價(jià)腸道菌群OTU 水平上的β-多樣性,來(lái)探究小鼠在不同攝入量的小米干預(yù)下,微生物群落組成之間的差異程度,坐標(biāo)圖上樣本點(diǎn)的距離越遠(yuǎn),表明樣本物種組成結(jié)構(gòu)差異越大,結(jié)果如圖6。 由圖6 可知,與NC 組相比,不同攝入量的小米皆引起了分組橢圓的偏移,說(shuō)明小米的干預(yù)改變了腸道菌群的組成,且攝入量越大,偏移程度越大,尤其是PCoA 分析中的M80,以及NMDS 分析中M60、M80 與NC 組完全分離,沒(méi)有任何重疊,說(shuō)明小米對(duì)腸道菌群的影響程度隨攝入量的增大而增大。

圖6 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群β-多樣性的影響Fig.6 Effect of different foxtail millet intake on β-diversity of gut microbiota in mice

2.4.2 腸道菌群的門(mén)、科、屬水平分析

2.4.2.1 腸道菌群門(mén)水平分析

進(jìn)一步比較了腸道菌群組成在門(mén)、科、屬水平上的差異,門(mén)水平組成結(jié)果見(jiàn)圖7。 圖7(a)顯示了門(mén)水平上相對(duì)豐度大于1%的菌群,擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)共占據(jù)相對(duì)豐度的92% 以上。由圖7(b)可知,與NC 組相比,M20、M40、M60、M80 組擬桿菌門(mén)豐度皆顯著升高(P＜0.05),厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)豐度皆顯著下降(P＜0.05),而且隨著小米攝入量的增加,變化趨勢(shì)越明顯,說(shuō)明小米干預(yù)有利于擬桿菌門(mén)的生長(zhǎng),不利于厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)生長(zhǎng)。 此外,相比于NC 組的擬桿菌門(mén)(29.25%)、 厚 壁 菌 門(mén)(46.76%)、 放 線 菌 門(mén)(18.64%),M80 組的3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)((67.81%、26.82%、1.83%)之間的相對(duì)豐度比例出現(xiàn)了明顯的失調(diào),這與M80 組腸道菌群多樣性和均勻度的下降結(jié)果是一致的。

圖7 不同攝入量小米對(duì)腸道菌群門(mén)水平組成的影響Fig.7 Effect of different foxtail millet intake on gut microbiota at phylum level

2.4.2.2 腸道菌群科水平分析

小鼠腸道菌群科水平組成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8(a)可得,Muribaculaceae 的相對(duì)豐度隨小米攝入量的增加而提高,尤其是在M80 組出現(xiàn)了極顯著的上升(P＜0.05),這與擬桿菌門(mén)的變化趨勢(shì)一致。 由圖8(c)可得,相比于對(duì)照組(NC),乳桿菌科(Lactobacillaceae)和雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)在M20、M40、M60、M80 組都出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05),顫螺旋菌科(Oscillospiraceae)在M60、M80 組出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05)。 由圖8(b)可得,理研菌科(Rikenellaceae)在M80 組出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05),擬桿菌科(Bacteroidaceae)在M40、M60、M80組出現(xiàn)了顯著下降(P＜0.05)。 小鼠腸道菌群科水平上的變化表明了過(guò)量(60%、80%)攝入小米不利于小鼠腸道內(nèi)乳桿菌科、雙歧桿菌科、顫螺旋菌科、擬桿菌科和理研菌科的定殖。

圖8 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群科水平組成的影響Fig.8 Effect of different foxtail millet intake on gut microbiota at famliy level in mice

2.4.2.3 腸道菌群屬水平分析

小鼠腸道菌群屬水平組成的分析結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9(a)的熱圖分析可知,norank_f_Muribaculaceae、Ileibacterium、乳酸菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和糞桿菌屬(Faecalibaculum)是屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌屬,且不同小米攝入量對(duì)菌群的影響不同。 由圖9(b)的組間差異判別分析可知,與NC 組相比,M20 組顯著增加了norank_f_Muribaculaceae、另枝菌屬(Alistipes)、腸桿菌屬(Enterorhabdus)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、Romboutsia的相對(duì)豐度(P＜0.05)。 由圖9(c)的組間差異判別分析可知,與M20 組相比,M80 組顯著降低了雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、另枝菌屬、布勞特氏菌屬(Blautia)、Colidextribacter、腸桿菌屬、副擬桿菌屬的相對(duì)豐度(P＜0.05)。 由圖9(d)的組間差異判別分析可知,與M40 組相比,M80 組顯著降低了糞桿菌屬、Colidextribacter、腸桿菌屬、布勞特氏菌屬、Parvibacter、副擬桿菌屬、羅氏菌屬(Roseburia)的相對(duì)豐度(P＜0.05)。 總體來(lái)說(shuō),相比于低攝入量(M20、M40)組,過(guò)量(M80)小米的攝入不利于小鼠腸道中糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、Colidextribacter、腸桿菌屬、副擬桿菌屬、羅氏菌屬的生長(zhǎng)。

圖9 不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群屬水平組成的影響Fig.9 Effect of different foxtail millet intake on gut microbiota at genus level

2.5 高低攝入量小米對(duì)小鼠SCFAs 的影響

小鼠腸道SCFAs 的分析結(jié)果見(jiàn)圖10。 由2.4分析結(jié)果可知,攝入20%、40% 小米與高攝入量(80%)的小米,小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異顯著,故僅選取M20、M40、M80 組的小鼠腸道短鏈脂肪酸含量進(jìn)行分析。 由圖10 可知,各組的乙酸、異戊酸、己酸、總短鏈脂肪酸含量之間無(wú)顯著性差異,這說(shuō)明不同攝入量的小米對(duì)小鼠腸道中乙酸、異戊酸和己酸3 種短鏈脂肪酸含量均沒(méi)有顯著影響。 NC、M20、M40 之間的丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸含量沒(méi)有差異,但M80 組的丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸含量顯著升高(P＜0.05),這說(shuō)明了20%、40%攝入量的小米對(duì)小鼠的SCFAs 含量沒(méi)有顯著影響,只有80%攝入量的小米能夠升高小鼠腸道中丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的含量。

圖10 高低攝入量小米對(duì)小鼠腸道SCFAs 的影響Fig.10 Effect of high and low foxtail millet intake on SCFAs of mice

2.6 腸道菌群與SCFAs 相關(guān)性分析

短鏈脂肪酸是腸道菌群的主要代謝物,為了探究M80 組短鏈脂肪酸升高的原因,明確與短鏈脂肪酸相關(guān)的菌群,對(duì)丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸4 種顯著增加的SCFAs 與腸道菌群豐度屬水平前50 名的菌屬進(jìn)行了斯皮爾曼相關(guān)性分析,結(jié)果如圖11。由圖11 可知,丙酸的增加與norank_f_Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001、Romboutsia、瘤胃球菌(Ruminococcus)顯著正相關(guān),丁酸的增加與norank_f_Muribaculaceae顯著正相關(guān),異丁酸的增加與norank_f_Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001 顯著正相關(guān),戊酸的增加與norank_f_Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001、Romboutsia、瘤胃球菌呈顯著正相關(guān),這表明norank_f_Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001、Romboutsia和瘤胃球菌可能參與了代謝小米產(chǎn)生短鏈脂肪酸的過(guò)程。

圖11 SCFAs 與腸道菌群屬水平的相關(guān)性分析Fig.11 Correlationship of SCFAs and gut microbiota at genus level

3 討 論

3.1 不同攝入量的小米對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

通過(guò)對(duì)3 周齡初斷乳小鼠進(jìn)行12 周的小米飼料干預(yù),發(fā)現(xiàn)不同小米攝入量對(duì)小鼠的正常生理狀態(tài)以及腸道組織病理狀態(tài)均沒(méi)有明顯的影響；然而,80%小米攝入量使小鼠肝臟質(zhì)量、血清TC、HDLC、LDL-C 水平顯著升高,這可能是因?yàn)樾∶紫啾扔谄渌任镉椭?、脂肪酸、甾醇含量較高[8],先前的研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食喂養(yǎng)會(huì)使小鼠TC、LDL-C、HDL-C同時(shí)升高[9]。 本研究表明,過(guò)量(80%)攝入小米可能會(huì)使小鼠的血液膽固醇循環(huán)水平處于較高的狀態(tài),造成脂代謝紊亂。

3.2 不同攝入量的小米對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響

不同攝入量小米對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響差別顯著。 維持腸道菌群多樣性對(duì)于宿主健康起著重要作用[10],多樣性下降是腸道菌群失調(diào)的重要標(biāo)志。 80%小米攝入量使小鼠腸道菌群多樣性和均勻度顯著下降,群落組成結(jié)構(gòu)趨于單一化,這與高脂飲食、素食飲食和生酮飲食的極端飲食模式導(dǎo)致菌群多樣性降低的結(jié)果是一致的[11-13],而菌群多樣性和均勻度的下降可能是導(dǎo)致脂代謝紊亂的原因之一[9]。 從門(mén)水平組成上看,80%攝入量的小米使小鼠腸道中擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)的相對(duì)比例顯著失調(diào),這可能是因?yàn)檫^(guò)量(80%)攝入小米使某些營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入過(guò)量導(dǎo)致特定菌群損失以及菌群間的相對(duì)豐度失衡。

在科水平上,80% 攝入量的小米使Muribaculaceae 在小鼠腸道菌群過(guò)度定殖,而乳酸桿菌科、雙歧桿菌科、顫螺旋菌科、理研菌科和擬桿菌科皆顯著下降。 黏液層的黏液蛋白是腸道微生物重要的附著點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,微生物與黏液蛋白的結(jié)合能力,決定了其在黏液層中的定殖能力[14]。 有研究表明,Muribaculaceae 是結(jié)腸壁上高度活躍的黏蛋白聚糖降解菌[15],毛螺菌科、理研菌科和擬桿菌科也具備利用黏蛋白聚糖的能力[16],而雙歧桿菌科與顫螺旋菌科在黏液層中顯著富集[17-18],因此我們推測(cè)Muribaculaceae 與黏液蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng),在生態(tài)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)中處于優(yōu)勢(shì),導(dǎo)致了其他菌科豐度的下降。 此外,降解黏蛋白聚糖的細(xì)菌包括腸道共生菌和致病菌[14],共生菌如著名的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila),該菌被認(rèn)為參與了肥胖、糖尿病的緩解[19],而致病菌會(huì)降解黏液層而引發(fā)炎癥[14],所以80%攝入量小米組中Muribaculaceae 的過(guò)度定殖對(duì)機(jī)體是否會(huì)產(chǎn)生不利影響,尚需進(jìn)一步的評(píng)價(jià)和研究。

在屬水平上,80%攝入量的小米使雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬和羅氏菌屬等潛在益生菌下降。 雙歧桿菌屬是腸道重要的益生菌,它的定殖能夠增強(qiáng)腸道屏障,抑制致病細(xì)菌的定殖并降低毒素水平[20]。 雙歧桿菌豐度的降低可能與小米飼料中酪蛋白的減少有關(guān)[21]。 此外,布勞特氏菌屬具有調(diào)節(jié)宿主健康和緩解代謝綜合征的能力[22],羅氏菌屬能夠?yàn)樗拗魈峁┌被岷虰 族維生素,有利于機(jī)體健康[23]。 本研究還發(fā)現(xiàn)腸道重要的共生菌另枝菌屬、副擬桿菌屬、腸桿菌屬在20%小米攝入量時(shí)顯著上升,在80%攝入量時(shí)顯著下降,其中副擬桿菌屬被發(fā)現(xiàn)能夠減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)揮抗炎作用[24],這表明20%攝入量的小米有利于腸道菌群多樣性增加和益生菌富集,而80%攝入量的小米喂養(yǎng)使小鼠腸道微生物的群落多樣性和均勻度下降,有益菌屬豐度下降,引起菌群失調(diào)。

3.3 不同攝入量的小米對(duì)小鼠短鏈脂肪酸的影響

20%、40%攝入量小米對(duì)SCFAs 的含量沒(méi)有影響,只有高攝入量(80%)小米增加了小鼠腸道中丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的含量,這可能是因?yàn)樾∶字械目剐缘矸酆枯^高[6],不能被小腸的淀粉酶分解,進(jìn)入結(jié)腸后被微生物發(fā)酵利用,產(chǎn)生次級(jí)代謝物短鏈脂肪酸。 通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001、瘤胃球菌屬與SCFAs的升高呈正相關(guān)。 Muribaculaceae 能夠產(chǎn)生乙酸、丙酸和琥珀酸[25],普雷沃氏菌是一種高效的丙酸產(chǎn)生菌[26],而瘤胃球菌能夠分解抗性淀粉產(chǎn)生丁酸[27],本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前的結(jié)論是一致的,這表明Muribaculaceae、普雷沃氏菌科_UCG-001 和瘤胃球菌屬很可能是80%小米攝入量干預(yù)下產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要菌群。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)分析了不同小米攝入量對(duì)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)、腸道菌群組成和短鏈脂肪酸水平的影響,發(fā)現(xiàn)20%小米攝入量就能有效調(diào)節(jié)腸道菌群,增加有益菌的定殖,而過(guò)高的小米攝入量(80%)則會(huì)使腸道菌群多樣性和均勻度降低,引起Muribaculaceae 的過(guò)度定殖,有益菌豐度下降。 研究結(jié)果表明,需要理性看待雜糧的營(yíng)養(yǎng)與健康價(jià)值,避免過(guò)量攝入。 目前關(guān)于過(guò)量攝入雜糧與機(jī)體健康的研究仍較少,需要更多后續(xù)的研究,尤其針對(duì)老人、幼兒等有特殊營(yíng)養(yǎng)需求的人群。 本研究尚存在許多科學(xué)問(wèn)題需要進(jìn)一步研究,如80%攝入量小米引起血脂水平上升的原因,以及高攝入量小米是否會(huì)導(dǎo)致血糖、血蛋白的異常,小米中的何種成分引起腸道菌群和短鏈脂肪酸的變化等。