幾種葡萄酒色素抗氧化活性的密度泛函理論分析

張 恒 煒， 李 子 賢， 劉 佳 瑞， 王 一， 侯 英 敏

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

葡萄酒的顏色是評價其質(zhì)量好壞的指標(biāo)之一，葡萄酒中最主要的呈色物質(zhì)為花色素類化合物[1-2]?；ㄉ貙儆邳S酮化合物，是一種天然的水溶性色素，在葡萄的轉(zhuǎn)色期主要以游離形式出現(xiàn)，隨著葡萄的成熟，花色素在葡萄中的含量不斷增加，花色素主要有五類：矢車菊素、飛燕草素、芍藥素、矮牽牛素、錦葵素[3]。

花色素在自然界中通常是以與葡萄糖結(jié)合而形成的花色苷形式存在，花色苷是有效的抗氧化劑[4-6]，當(dāng)被轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的芳香基時，會快速減少氧化物質(zhì)，達到抗氧化作用?；ㄉ罩杏袃翰璺雍?，可以螯合過度的金屬離子(阻止羥基的產(chǎn)生)，潛在地參與氧化應(yīng)激。在年輕的葡萄酒中，最主要的花色苷是錦葵色素葡萄糖苷，在弱酸性環(huán)境下，由于酸堿平衡和水化異構(gòu)，每個花色苷實際上都是有色和無色的混合物。在葡萄酒陳釀過程中，有色和無色的花色苷可以與包括乙醛(乙醇的氧化產(chǎn)物)、原花青素、4-羥基苯乙烯在內(nèi)的其他葡萄酒成分發(fā)生反應(yīng)，生成一些新的葡萄酒色素[7]。

本實驗采用密度泛函理論，對錦葵色素葡萄糖苷(色素A)、兒茶酸(色素B)、錦葵色素葡萄糖苷通過CH3—CH橋與兒茶酸連接而形成的兩個手性異構(gòu)體(色素C和C′)及錦葵色素葡萄糖苷與兒茶酸直接相連而形成的色素(色素D)分子抗氧化活性進行了研究。5個葡萄酒色素分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

(a)色素A

1 計算方法

采用Gaussian 16程序包、B3LYP泛函[8]和TZVP基組[9]對5個色素分子的幾何構(gòu)型進行優(yōu)化，確保優(yōu)化構(gòu)型無虛頻。使用pop=full對物質(zhì)的電子結(jié)構(gòu)進行了計算。并用Multiwfn軟件[10-11]對葡萄酒色素分子幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)、電子布局、HOMO和LUMO的能級、結(jié)構(gòu)、片段貢獻率進行了分析，并用VMD軟件繪制圖像[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子的幾何構(gòu)型與結(jié)構(gòu)參數(shù)

運用B3LYP/TZVP方法優(yōu)化得到的色素A、B、C、C′、D的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，主要結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示。

(a)色素A

葡萄酒色素屬于花青素類化合物，對于花青素類化合物來說，其抗氧化活性取決于苯環(huán)上的酚羥基與自由基發(fā)生H轉(zhuǎn)移的難易程度以及發(fā)生H轉(zhuǎn)移后所形成的自由基的穩(wěn)定性。若酚羥基易與自由基發(fā)生H轉(zhuǎn)移，則說明其抗氧化活性較高。反之則表示抗氧化活性較弱。由此可見，判斷葡萄酒色素抗氧化活性的強弱的一個重要指標(biāo)就是其酚羥基的數(shù)量和位置[13]。

在5種葡萄酒色素中，均是A環(huán)上的C5和C7處有酚羥基取代，而B環(huán)和C環(huán)上的取代基因為物質(zhì)不同而存在差異。色素A、C、C′、D的C環(huán)C3位連接的是葡萄糖苷，B環(huán)C13、C15位連接的是氧甲基，而色素B的C3位連接的是羥基，B環(huán)C13、C15位連接的是酚羥基。如表1所示，5種色素在A環(huán)C5位、B環(huán)C14位連接羥基的鍵長近似相等，由色素A、B反應(yīng)得到色素C、C′、D，在A′、B′環(huán)上的酚羥基鍵長也都近似相等。而C7位連接的羥基鍵長則各不同，通過CH3—CH橋?qū)⑸谹和B連接形成的色素C、C′在此處的鍵長比色素A、B和直接相連形成的色素D的鍵長都長，所以通過CH3—CH橋?qū)⑸谹和B連接后，可以提高此處抗氧化活性。

表1 5種葡萄酒色素的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)

從整體來看，5種葡萄酒色素中A環(huán)C7位和B環(huán)C14位的酚羥基活性最強，而A環(huán)和C環(huán)的其他酚羥基都具有一定的活性。將色素A和色素B通過兩種方式連接而形成的色素C、C′、D在B’環(huán)C15’處的酚羥基活性相對較強。

2.2 自然鍵軌道(NPA)電荷分子

生物體內(nèi)的含氧自由基都在氧原子端帶有較多的負(fù)電荷，根據(jù)“異性相吸，同性相斥”的原理，帶負(fù)電荷的基團容易進攻正電荷多的原子，所以生物體內(nèi)的含氧自由基就更會更容易進攻正電荷多的原子。由于花青素類化合物消除自由基主要通過與自由基發(fā)生H轉(zhuǎn)移反應(yīng)的，所以葡萄酒色素分子上酚羥基H原子所帶的正電荷越多，則越易與含氧自由基發(fā)生H轉(zhuǎn)移反應(yīng)，能夠清除的體內(nèi)自由基也就越多，其抗氧化活性也就越強[14]。

利用Guassian軟件對5種葡萄酒色素進行電荷計算，得到酚羥基上H原子的NPA電荷數(shù)，如表2所示。從表2中可以看出，5種葡萄酒色素在C7和C14位的酚羥基的電荷數(shù)都比較大，所以此處的抗氧化活性較高，這也與其結(jié)構(gòu)參數(shù)得出的結(jié)論一致。色素B的NPA電荷數(shù)顯著低于其他4種色素，推測色素B的抗氧化活性是5個葡萄酒色素中最弱的。將色素A和色素B連接后，B′環(huán)上C7、C14′、C15′處的酚羥基電荷數(shù)較多，推測這些地方可能是葡萄酒色素發(fā)生抗氧化反應(yīng)的活性位點。通過CH3—CH橋連接而形成的兩個手性異構(gòu)的色素C和C′在各個酚羥基處電荷數(shù)大體相同，所以構(gòu)型的不同對抗氧化活性幾乎沒有影響。

表2 5種葡萄酒色素羥基H原子上的NPA電荷數(shù)

2.3 前線分子軌道能級分析

前線軌道理論揭示了參與化學(xué)反應(yīng)的主要的軌道是前線分子軌道中的最高的電子占據(jù)軌道(HOMO)和最低的電子非占據(jù)軌道(LUMO)。E(HOMO)越高，表示電子越不穩(wěn)定。反之，E(LUMO)越低，表示更易接收電子。而最低的電子非占據(jù)軌道(LUMO)和最高的電子占據(jù)軌道(HOMO)的能級差(ΔE)越小，意味著分子越活潑、反應(yīng)活性也就更強。

ΔE可以作為葡萄酒色素分子抗氧化活性強弱的依據(jù)之一[15]，葡萄酒色素的ΔE越小，表示它的抗氧化活性越強。表3為在B3LYP/TZYP計算水平下優(yōu)化的5種葡萄酒色素分子LUMO、HOMO的能級和ΔE。由表3可知，色素A、C、C′、D的E(HOMO)和ΔE接近，ΔE均在0.09 a.u.左右。表明將色素A和B無論是通過CH3—CH橋相連還是直接相連，都不能明顯提高其抗氧化活性，且R和S構(gòu)型的抗氧化活性也大致相同。而色素B的抗氧化活性則顯著地低于其他4種色素，推測與其C環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表3 5種葡萄酒色素的E(HOMO)、E(LUMO)及ΔE

2.4 各片段對前線分子軌道的貢獻

利用Multiwfn軟件和VMD軟件對5種葡萄酒色素的前線分子軌道(HOMO、LUMO)進行繪制，如圖3所示。前線分子軌道圖可以直觀地對分子中參與反應(yīng)的活性部位的分布情況進行定性分析。一個分子HOMO軌道電子云密度越大，則表示其易與自由基發(fā)生反應(yīng)，是發(fā)生抗氧化反應(yīng)的主要位點。

由5種葡萄酒色素分子的HOMO圖可以看出，電子云主要分布在色素A分子的B環(huán)上，色素B分子的電A環(huán)上，由色素A和B經(jīng)不同連接方式生成色素C、C′、D的電子云主要分布在B′環(huán)上。除了色素B沒有糖苷外，其他色素分子在糖苷處都很少有電子云分布。

5種葡萄酒色素分子的LUMO軌道差別不大，電子云主要分布在A、B、C環(huán)上，色素C、C′、D的A′、B′、C′環(huán)均無明顯電子云分布。與HOMO軌道一樣，4種葡萄酒色素分子的糖苷處也沒有LUMO軌道分布。

前線軌道結(jié)構(gòu)圖只能對HOMO、LUMO軌道進行定性分析，并不能進行定量分析，不能精確地得出每個片段對軌道的貢獻度，所以在得到前線軌道結(jié)構(gòu)圖的基礎(chǔ)上，又通過Multiwfn軟件對5種葡萄酒色素的酚羥基對前線分子軌道的貢獻率進行計算，結(jié)果如表4所示。

由圖3和表4可以看出，色素A的C14位羥基占據(jù)HOMO軌道較多，即反應(yīng)活性也較強；色素B的C7位酚羥基所占比例較大，可以推測對于色素B而言，A環(huán)C7位的酚羥基反應(yīng)活性較大，這也與H原子NPA電荷分析的結(jié)果一致。其他3種色素在將色素A和B相連后，活性位點由原來的B環(huán)轉(zhuǎn)移到了B′環(huán)，在C14′、C15′處的HOMO軌道比例較大。綜合對HOMO軌道的貢獻率和NPA電荷數(shù)可以得出，此處的反應(yīng)活性較大，具有較大的抗氧化能力，是自由基與其發(fā)生抗氧化反應(yīng)的主要作用位點。

(a)色素A HOMO

表4 5種葡萄酒色素的酚羥基占據(jù)前線分子軌道比例

3 結(jié) 論

本文主要運用密度泛函理論，對葡萄酒中的5種色素進行計算，分析得到其抗氧化活性的強弱和抗氧化反應(yīng)的活性位點結(jié)果表明，5種色素在C7和C14處均有較強的反應(yīng)活性，將色素A和B通過CH3—CH橋連接形成的色素C，C′和直接相連形成的色素D在B′環(huán)的C14′，C15′處有著較強的反應(yīng)活性，這些位置的羥基可能是發(fā)生抗氧化反應(yīng)的主要作用位點。色素B的抗氧化能力明顯低于其他4種色素，通過CH3—CH橋連接形成的兩個手性異構(gòu)的葡萄酒色素C和C′的ΔE差別不大，所以手性異構(gòu)對其抗氧化能力的強弱沒有影響。CH3—CH橋的引入也對葡萄酒色素的抗氧化能力沒有較大影響。