核桃黑斑病病原菌的生物學(xué)特性研究

席軍強(qiáng)　呂娥娥　李建龍　劉文強(qiáng)　馮華

摘要 核桃黑斑病是由黃單孢桿菌屬的核桃黃極毛桿菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）復(fù)合侵染發(fā)生的病害。為控制該病害的危害，以核桃黑斑病葉分離的主要病原物鏈格孢菌為研究對(duì)象，采用菌絲生長速率法和培養(yǎng)皿玻片法，研究了不同環(huán)境條件對(duì)鏈格孢菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明：鏈格孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)的適宜溫度均為25～30? ℃;全光照下利于菌絲生長，全黑暗和光暗交替可促進(jìn)孢子萌發(fā);孢子萌發(fā)的適宜pH為7～9，pH為9時(shí)最適宜菌絲的生長。

關(guān)鍵詞 環(huán)境因素;鏈格孢菌;菌絲生長;孢子萌發(fā)

中圖分類號(hào)：S792.13 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2022.04.016

Study on Biological Characteristics of Walnut Black Spot Pathogen

Xi Junqiang Lv Ee Li Jianlong Liu Wenqiang Feng Hua

（1. Guanshan Forestry Administration of Pingliang City，Pingliang 744000，Gansu;2. People's Government of Jingning Hongsi Town，Pingliang 743400，Gansu;3. People's Government of Jingning Weirong Town，Pingliang 743400，Gansu）

AbstractWalnut black spot disease is caused by the compound infection of Xanthomonas campestris pv.? juglandis and Alternaria alternata. In order to provide the theoretical basis for control the disease，the characteristics of main pathogen? A. alternata isolated from walnut leaf black spot was studied using the mycelium growth rate method and petri dish slide method to clarify the effects of different environmental conditions on pathogen mycelial growth and spore germination. The results showed that the optimum temperature for mycelial growth and spore germination was 25-30℃;full sunlight was beneficial to mycelial growth，alternating light and dark promoted spore germination;the optimum pH value for spore germination was pH7-9，the most suitable pH for mycelial growth was pH=9.

Key wordsEnvironmental factors;Alternaria alternata;mycelial growth;spore germination

核桃是我國栽培面積較為廣泛的經(jīng)濟(jì)樹種之一，栽培歷史悠久，除黑龍江、上海、廣東、海南外，其他各省均有栽培，栽培面積60余萬hm。我國核桃產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的27%，僅次于美國。但近年來，由于受病蟲害的影響，導(dǎo)致核桃產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低，嚴(yán)重制約了我國核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

核桃黑斑病是一種氣傳病害，主要危害核桃葉片和果實(shí)，該病由黃單孢桿菌屬的核桃黃極毛桿菌（Xanthomonas campestris pv. juglandis）與鏈格孢菌共同復(fù)合侵染引起[1，2]。本文對(duì)其主要病原——鏈格孢菌（Alternaria alternata）的菌絲和孢子在不同環(huán)境條件下的生長和萌發(fā)狀況進(jìn)行了研究。鏈格孢菌，屬半知菌綱（Imperficti）鏈孢霉目（Moniliales）黑霉科（Dematiaceae）鏈格孢屬（Alternaria）。其菌落培養(yǎng)特征圓形，初為灰白色，后變?yōu)樯罨疑渲虚g稍有隆起，背面灰黑色，外部青褐色，邊緣色淺。菌絲疏松有隔，氣生菌絲旺盛，較短。當(dāng)鏈格孢菌長滿培養(yǎng)皿后，在產(chǎn)孢處理下產(chǎn)生大量分生孢子。顯微鏡檢下的分生孢子梗淡褐色至褐色，部分黑色，單枝，短或長，彎曲或屈膝狀[3，4]，分生孢子鏈細(xì)長，稀疏分枝，側(cè)枝較少。分生孢子單生或串生，形狀不一，褐色，多分隔，倒梨形近卵狀，也見狹棒狀或倒棒狀，具橫隔1～5或3～7個(gè)，縱、斜隔膜0～4個(gè)[5-8]。

目前，針對(duì)鏈格孢菌的研究主要集中在分離與鑒定等方面[9，10]，本文就溫度、光照、pH 3種環(huán)境因素對(duì)鏈格孢菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株及培養(yǎng)基供試菌株采自甘肅天水核桃黑斑病葉，通過常規(guī)組織分離法分離純化后，保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL，經(jīng)121 ℃高溫濕熱滅菌20 min。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與用品儀器及用品為超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、人工氣候培養(yǎng)箱、顯微鏡、酒精燈、培養(yǎng)皿、錐形瓶、載玻片、接種針和打孔器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離與純化采用常規(guī)組織分離法[11]分離病菌，純化后于PDA平板培養(yǎng)基培養(yǎng)待用。

1.2.2 環(huán)境因素對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響 采用菌絲生長速率法[11]。（1）光照對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響研究。用直徑5 mm的打孔器切取鏈格孢菌菌餅，呈“品”字形移接于PDA平板培養(yǎng)基上。光照條件分別設(shè)置為全黑暗、光暗交替（黑暗12 h，光照12 h）和全光照3個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。每24 h十字交叉法測(cè)量菌落直徑，待菌落生長邊緣接連時(shí)停止測(cè)量 [11]。（2）溫度對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響研究。當(dāng)活化后的供試菌株長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，用直徑為5 mm的打孔器切取菌餅，移接于PDA平板培養(yǎng)基。分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8個(gè)溫度梯度下恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。每24 h十字交叉法測(cè)量菌落直徑，待菌落生長邊緣接連時(shí)停止測(cè)量 [11]。（3）pH對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響研究。用濃度均為1 mol·L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別為5、6、7、8、9共5個(gè)酸度處理。用直徑為5 mm的打孔器切取菌餅，移接于PDA平板培養(yǎng)基，室溫下恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。每24 h十字交叉法測(cè)量菌落直徑，待菌落生長邊緣接連時(shí)停止測(cè)量 [11]。

1.2.3 環(huán)境因素對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響孢子萌發(fā)采用培養(yǎng)皿玻片法[11]。通過對(duì)鏈格孢菌進(jìn)行產(chǎn)孢處理，配置孢子懸浮液，40倍鏡檢，每視野下20～50個(gè)孢子。

此濃度孢子液均用于以下研究：

（1）不同光照條件對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響。將供試孢子懸浮液分別在全光照、光暗交替（光照、黑暗每6 h交換一次）和全黑暗條件下室溫恒溫培養(yǎng)。孢子懸浮液濃度調(diào)整至40倍顯微鏡下每視野20～50個(gè)孢子，每次計(jì)數(shù)200個(gè)孢子以上，每處理重復(fù)3次，于36 h后觀察孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率[12，13]。

（2）不同溫度條件對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響。將供試孢子懸浮液濃度調(diào)整至40倍顯微鏡下每視野20～50個(gè)孢子，每次計(jì)數(shù)200個(gè)孢子以上，分別置于5、10、15、20、25、30、35和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。于36 h后觀察孢子萌發(fā)個(gè)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率[12，13]。

（3）不同pH對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響。用1 mol·L NaOH 溶液和1 mol·L HCl無菌蒸餾水溶液調(diào)節(jié)pH值，設(shè)定pH為5、6、7、8、9共5個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。置于室溫條件下培養(yǎng)36 h后，取各pH溶液中的孢子液鏡檢觀察，每處理檢查15個(gè)視野，每視野20～50個(gè)孢子，觀察并計(jì)算孢子萌發(fā)率[12，13]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel2012對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境條件對(duì)菌絲生長的影響

2.1.1 光照對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響

由圖1可知，鏈格孢菌在全光照、全黑暗及光暗交替下菌絲均能正常生長，在全光照下菌絲生長最好，全黑暗條件下菌絲生長速率較前2種光照處理相對(duì)較差。因此，鏈格孢菌在全光照條件下更適宜其菌絲生長。

2.1.2 不同溫度對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響由圖2可知，在低于5 ℃或高于40 ℃下，鏈格孢菌菌絲不能生長，在30 ℃下菌絲生長速度最快，20～30? ℃是其菌絲生長的適宜溫度。

2.1.3 不同pH對(duì)鏈格孢菌菌絲生長的影響由圖3可知，鏈格孢菌菌絲在pH為5.0～9.0均可生長。pH為8～9適宜菌絲生長，在pH為9.0處理下菌絲生長速度最快，菌落直徑最大。

2.2 光照、溫度、pH對(duì)孢子萌發(fā)的影響

2.2.1 不同光照對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響由圖4可知，鏈格孢菌在全光照、光暗交替、全黑暗3 種光照處理下，其孢子均能萌發(fā);在全黑暗和光暗交替條件下鏈格孢菌的孢子萌發(fā)率均較高，且差異不顯著;全光照下的孢子萌發(fā)相對(duì)較差。

2.2.2 不同溫度對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響由圖5可知，鏈格孢菌在5～40? ℃溫度條件下孢子均能萌發(fā)，其孢子萌發(fā)適宜溫度為20～30? ℃。最適萌發(fā)溫度為25? ℃，當(dāng)溫度低于10? ℃或高于35? ℃時(shí)，孢子萌發(fā)率急劇下降。

2.2.3 不同pH對(duì)鏈格孢菌孢子萌發(fā)的影響由圖6可知，在pH為5～9時(shí)鏈格孢菌的孢子均能萌發(fā)，且萌發(fā)率均在80%以上，pH為9的處理孢子萌發(fā)率最高，達(dá)92.96%，是鏈格孢菌的最適孢子萌發(fā)酸堿度環(huán)境。pH為7～9是孢子萌發(fā)的適宜酸度范圍，且偏堿性環(huán)境更有利于其孢子的萌發(fā)，隨著pH的降低，其孢子萌發(fā)率減小。

3 結(jié)論與討論

鏈格孢菌在全光照條件下較全黑暗與光暗交替，更適宜其菌絲生長;而孢子萌發(fā)的最適光照條件與菌絲生長所需的最適光照條件則相反，其孢子萌發(fā)在全黑暗和光暗交替條件下，孢子萌發(fā)率較高，全光照條件下不利于其孢子萌發(fā)。孢子萌發(fā)的溫度范圍較菌絲生長溫度范圍更為寬泛，在5～40 ℃下孢子均可萌發(fā)，而當(dāng)溫度超過35 ℃或低于5 ℃時(shí)，菌絲則生長停止。其孢子萌發(fā)的最適溫度范圍與菌絲最適生長溫度范圍相一致，均在25～30 ℃。在偏堿性條件下，更有利于鏈格孢菌的菌絲生長與孢子萌發(fā)，且隨pH的降低，其孢子萌發(fā)率下降。這與葛妍等[14]的研究結(jié)果相一致。

本研究以核桃病變?nèi)~片分離鏈格孢菌為研究對(duì)象，初步摸清環(huán)境因素對(duì)鏈格孢菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響。了解鏈格孢菌的生物學(xué)特性可為病害防治提供理論依據(jù)，以減輕該病對(duì)核桃的枝、葉、花和果實(shí)的危害，提高核桃產(chǎn)量及品質(zhì)。

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