沒食子酸對(duì)人食管癌TE-1細(xì)胞的體外抑制作用及其機(jī)制

吳昊 努蘭·拜都拉 劉琳玉 任艷利

關(guān)鍵詞沒食子酸;食管癌;凋亡;活性氧;TE-1 細(xì)胞

食管癌作為全世界發(fā)病率和病死率前10 位的癌癥，其治療情況和患者預(yù)后情況均較差[1-2];特別是在中國(guó)，食管癌的發(fā)病率和病死率分列第4 位和第6 位，均超過世界平均水平的2 倍[3]。根據(jù)全球癌癥觀察站的預(yù)測(cè)結(jié)果，我國(guó)男性食管癌新發(fā)病例數(shù)占比將超過全球新發(fā)食管癌病例數(shù)的一半[4]。食管癌患者的早期癥狀并不明顯，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的吞咽梗阻、聲音沙啞或淋巴結(jié)腫大則提示其病情已進(jìn)入晚期[5]。目前，食管癌的治療以手術(shù)切除、放化療為主，其中手術(shù)切除常伴隨著出血、穿孔、食管狹窄和感染等多種并發(fā)癥，而放化療會(huì)引發(fā)營(yíng)養(yǎng)不良、骨髓抑制、肝腎功能損害和神經(jīng)系統(tǒng)毒性等明顯的毒副作用[6]?？梢姡瑢ふ倚碌闹委煼桨负托滦退幬飦砀纳剖彻馨┗颊叩闹委熜Ч@得尤為重要。

沒食子酸（gallic acid，GA）的分子式為C7H6O5，是一種多酚類化合物，通常為白色或淡黃色的針狀結(jié)晶，易溶于水和乙醇，具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等廣泛生理活性[7]。該成分在自然界中分布廣泛，是五倍子、大葉桉、紅景天等多種傳統(tǒng)中藥的主要活性成分之一[8]。已有研究表明，GA 能夠抑制人肺癌A549 細(xì)胞的增殖和遷移，并可通過調(diào)節(jié)Janus 激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription3，JAK/STAT3）信號(hào)通路及下游凋亡分子來增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用[9]。另有研究表明，GA能夠提高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，從而可誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞以及黑色素瘤細(xì)胞的凋亡[10-12]?；诖耍狙芯繑M以人食管癌TE-1 細(xì)胞為對(duì)象，首先考察GA對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和集落形成能力的影響，其次探究該成分對(duì)TE-1 細(xì)胞ROS水平的影響，最后根據(jù)GA處理后TE-1 細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)因子B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9 以及細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）、cyclin D3 的表達(dá)水平來探索GA治療食管癌的潛在機(jī)制，以期為該成分抗腫瘤作用的闡釋以及食管癌的治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），Cyto-FLEX 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司），Galaxy 170S 型恒溫二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱、5430 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Mini-PROTEANTetra 型蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀、GS-900 型校準(zhǔn)型密度計(jì)（美國(guó)Bio-Rad 公司），Ti-s 型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），HH-2 型電熱恒溫水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司），BSA124S 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司），SX-500 型高壓滅菌鍋[天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

GA 對(duì)照品（批號(hào)63262，純度≥98%）購(gòu)自美國(guó)MCE公司;胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（批號(hào)分別為RB35941、AF29531042、J180022）均購(gòu)自美國(guó)HyClone 公司;Annexin Ⅴ/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)0315976）購(gòu)自美國(guó)BD公司;MTT試劑（批號(hào)0793）購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered solution，PBS，pH7.4，批號(hào)69092500）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)（cell fluorescencecounting kit-F，CCK-F）試劑盒、ROS 熒光探針（DCFH-DA）試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)分別為122920210601、S0033S、082020201106），兔源Bcl-2、caspase-3、cyclin D1 單克隆抗體（批號(hào)分別為090220210406、121520210422、020321210405），鼠源Bax、caspase-9、cyclin D3、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（ 批號(hào)分別為090920210311、090820210407、021219210413、120319201012），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗（批號(hào)分別為020821210409、121020210409），以及RIPA 裂解液等Western blot 相關(guān)試劑均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜等其余試劑均購(gòu)自天津北聯(lián)試劑廠;水為雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

人食管癌細(xì)胞TE-1 購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司，批號(hào)為CL-0231。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人食管癌TE-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100u/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37.5 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)

采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組（每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔），并另設(shè)空白調(diào)零孔（不加細(xì)胞和藥物，只加培養(yǎng)基）。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基（無雙抗）100 μL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT試劑20μL，孵育2 h;棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜200 μL，振蕩10 min 使充分溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（A）值，通過以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（給藥組A值-空白調(diào)零孔A值）/（對(duì)照組A值-空白調(diào)零孔A 值）×100%。采用SPSS 26.0 軟件計(jì)算GA作用不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（medianinhibitory concentration，IC50）。

2.3 細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性的檢測(cè)

采用CCK-F 法和倒置熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)、觀察。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105 個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、300、500 μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，采用倒置熒光顯微鏡觀察TE-1 細(xì)胞的形態(tài)變化;同時(shí)，采用CCK-F法檢測(cè)TE-1 細(xì)胞數(shù)量變化，按其試劑盒說明書方法進(jìn)行操作。

2.4 細(xì)胞遷移情況的檢測(cè)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，按每孔2 mL接種于6孔板中，培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿時(shí)，使用10 μL白槍頭在皿底作筆直的劃痕，用PBS 沖洗細(xì)胞2 次。將細(xì)胞分為給藥組和對(duì)照組，給藥組加入含GA 100、300、500μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基1mL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)0、4、12、24 h 時(shí)觀察并拍照，用Image J 軟件分析劃痕面積并按以下公式計(jì)算24 h 時(shí)的相對(duì)劃痕愈合率：相對(duì)劃痕愈合率（%）=（0 h 時(shí)劃痕面積-培養(yǎng)24h 時(shí)劃痕面積）/0 h 時(shí)劃痕面積×100%。

2.5 細(xì)胞集落形成的檢測(cè)

采用平板集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×103個(gè)/mL，按每孔1 mL接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入含GA 5、10、15、20、25 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基2 mL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)10 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS沖洗3 次;以10%甲醛溶液室溫固定15 min，用PBS沖洗3 次，再以結(jié)晶紫染色3 min，用PBS洗去浮色，采用Image J 1.8.0 軟件分析集落數(shù)量（肉眼可見的集落也計(jì)算在內(nèi)）并按下列公式計(jì)算集落形成相對(duì)數(shù)量：集落形成相對(duì)數(shù)量（%）=（給藥組集落數(shù)量/對(duì)照組集落數(shù)量）×100%。

2.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，按每孔2 mL接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，給藥組加入含GA 100、300、500 μmol/L（濃度依據(jù)“2.2”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基2 mL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI 染料，室溫避光染色15 min，過濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的檢測(cè)

采用DCFH-DA 法進(jìn)行檢測(cè)。DCFH-DA 能夠自由進(jìn)入細(xì)胞膜并在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解為DCFH，細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH使其變?yōu)橛袩晒獾腄CF，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度即可反應(yīng)ROS水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，于稀釋好的DCFH-DA中吹散，37 ℃避光孵育30min，每隔5 min取出混勻。孵育完成后，用無血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，利用FITC通道檢測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度，通過ModfitLT 5 軟件分析其平均熒光強(qiáng)度，再按以下公式計(jì)算ROS水平：ROS水平（%）=給藥組的平均熒光強(qiáng)度/對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度×100%。

2.8 細(xì)胞中caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、cyclinD1、cyclin D3 蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分為給藥組和對(duì)照組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。給藥組加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（濃度依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）的培養(yǎng)基100 μL，對(duì)照組加入同體積的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液及苯甲基磺酰氟提取總蛋白，以BCA法檢測(cè)蛋白濃度，參照最低濃度對(duì)所有蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理后，在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴中放置3 min 使變性。取變性蛋白適量，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（分離膠電壓70 V，濃縮膠電壓110 V，電泳時(shí)間120 min）后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（電流300 mA;轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白大小決定，一般1 kDa 轉(zhuǎn)膜1 min）上;用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別按1 ∶1 000的稀釋比例加入各目的蛋白和內(nèi)參蛋白（β-actin）一抗，4 ℃孵育過夜;用TBST緩沖液洗膜3次，按1 ∶1 000 的稀釋比例加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h;用TBST緩沖液洗膜3次，加入ECL發(fā)光液適量，于暗室內(nèi)曝光，使用Image J 1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為目的蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。計(jì)量資料用x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 GA對(duì)細(xì)胞存活率的影響

不同濃度（100、200、300、400、500 μmol/L）的GA處理24 h 和48 h 對(duì)TE-1 細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度和時(shí)間依賴趨勢(shì)。24 h 和48h 時(shí)，GA 的IC50 分別為（281.22 ± 26.81）μ mol/L 和（220.90±31.15）μmol/L。結(jié)果見圖1。

3.2 GA對(duì)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性的影響

CCK-F 結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，TE-1 細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化;當(dāng)GA濃度為500 μmol/L 時(shí)，TE-1 細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞體積縮小、變圓，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集。結(jié)果見圖2。

3.3 GA對(duì)細(xì)胞遷移的影響

對(duì)照組細(xì)胞的劃痕面積隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷縮小，在24 h 時(shí)其相對(duì)劃痕愈合率可達(dá)（62.31±2.41）%。隨著GA濃度的增加，各給藥組細(xì)胞的相對(duì)劃痕愈合率均顯著下降（P<0.01或P<0.05）;當(dāng)GA濃度為500 μmol/L時(shí)，相對(duì)劃痕愈合率為（6.71±1.33）%，且GA的抑制遷移作用有濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖3、圖4。

3.4 GA對(duì)細(xì)胞集落形成的影響

在培養(yǎng)10 d 后，對(duì)照組存在大量肉眼可見的細(xì)胞集落;與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞集落形成相對(duì)數(shù)量均顯著減少（P<0.01 或P<0.05），且有隨GA濃度增加而減少的趨勢(shì)。結(jié)果見圖5、圖6。

3.5 GA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

當(dāng)TE-1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（100、300、500 μmol/L）的GA 作用24 h 后，其凋亡率分別為（6.21 ± 0.32）% 、（12.59±0.58）%和（15.41±0.41）%，對(duì)照組TE-1 細(xì)胞的凋亡率為（5.29±0.28）%。與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），且有隨著GA濃度增加而升高的趨勢(shì)。結(jié)果見圖7、圖8。

3.6 GA對(duì)細(xì)胞ROS水平的影響

經(jīng)DCFH-DA染色后，與對(duì)照組比較，除100 μmol/L的GA外，其余給藥組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度和ROS水平均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），且均有隨著GA濃度增加而升高的趨勢(shì)。結(jié)果見表1、圖9。

3.7 GA 對(duì)細(xì)胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cyclin D3 和cyclin D1 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，各給藥組細(xì)胞中Bcl-2（僅GA 200μmol/L 組）、Bax（GA 100 μmol/L 組除外）、caspase-3、caspase-9（GA 100 μmol/L組除外）的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01 或P<0.05），Bcl-2（GA 100、200 μmol/L 組除外）、cyclinD1、cyclin D3 蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01 或P<0.05），且均有一定的濃度依賴趨勢(shì)。結(jié)果見圖10、圖11。

4 討論

在我國(guó)，食管癌是較為高發(fā)的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病位置特殊、誘發(fā)因素較多、早期癥狀不明顯、傳統(tǒng)手術(shù)和化療藥物對(duì)患者傷害較大等諸多原因，使得其整體治療水平尚未令人滿意[13]。

ROS 形式多樣，如超氧陰離子（O2 -）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（HO·）等。在正常的代謝過程中，機(jī)體會(huì)不斷產(chǎn)生ROS，后者會(huì)被一些抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）和一些具有還原作用的小分子（如維生素C和還原型谷胱甘肽）所消耗，從而維持機(jī)體氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡[14]。不同濃度的ROS 對(duì)細(xì)胞有著不同的作用：高濃度的ROS 會(huì)破壞質(zhì)膜的完整性，影響actin 骨架的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，造成DNA損傷，并導(dǎo)致正常的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制受損;而低濃度的ROS可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，并可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[15]。有研究指出，與正常組織細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞處于較高的氧化還原狀態(tài)，可通過提高腫瘤細(xì)胞的ROS水平來使其先于正常細(xì)胞達(dá)到ROS的死亡閾值;換言之，腫瘤細(xì)胞對(duì)ROS的敏感性高于正常細(xì)胞。這一特點(diǎn)使ROS 對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的選擇性殺傷能力[16]。范桂娟[17]的研究也證實(shí)，在由白藜蘆醇衍生物和Cu（Ⅱ）構(gòu)建的促氧化體系中，ROS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2 的毒性顯著高于正常細(xì)胞L02。

本研究發(fā)現(xiàn)，GA能明顯抑制食管癌TE-1 細(xì)胞的活力，并且呈一定的時(shí)間和劑量依賴趨勢(shì);劃痕實(shí)驗(yàn)和集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GA能夠顯著抑制TE-1細(xì)胞的集落形成能力和遷移能力，且其在較低濃度（5～25 μmol/L）就能體現(xiàn)較強(qiáng)的集落形成抑制能力。凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，GA處理24 h 能明顯提高TE-1 細(xì)胞的凋亡水平，且有隨著藥物濃度增加而升高的趨勢(shì)。

為了進(jìn)一步探究GA誘導(dǎo)食管癌TE-1 細(xì)胞的凋亡機(jī)制，本研究檢測(cè)了經(jīng)不同濃度GA處理后細(xì)胞中ROS水平的變化，結(jié)果顯示，隨著GA濃度的增加，TE-1 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平也隨之提高。隨后的Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，300～500 μmol/L的GA能使抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平顯著降低，200～500 μmol/L 的GA能使促凋亡蛋白Bax 蛋白的表達(dá)水平顯著上升;同時(shí)，GA能夠提高caspase-3、caspase-9 的表達(dá)水平，降低cyclin D1、cyclin D3 的表達(dá)水平，且有濃度依賴趨勢(shì)。caspase 家族是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的全稱，其中caspase-9 可與細(xì)胞色素、凋亡酶激活因子形成復(fù)合物，從而激活caspase-9;激活的caspase-9 可再激活細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵啟動(dòng)者caspase-3，從而誘導(dǎo)后續(xù)的細(xì)胞凋亡[18]。cyclin D1 和cyclin D3 均為cyclin 家族成員，其主要作用是對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行正調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞增殖，其中cyclin D1 是細(xì)胞進(jìn)入G1期的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致G1/S 期檢測(cè)點(diǎn)失效，從而造成細(xì)胞越過此檢測(cè)點(diǎn)而直接進(jìn)入S 期，允許未經(jīng)修復(fù)的突變DNA進(jìn)行復(fù)制，最終增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[19]。cyclin D1 和cyclin D3 在不同組織中有著明顯的表達(dá)差異，Yu 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，cyclinD1 的過量表達(dá)和胃癌的病理程度沒有明顯的相關(guān)性，但cyclin D3 的表達(dá)卻與胃癌惡性程度存在明顯關(guān)聯(lián)。

綜上所述，GA能夠抑制TE-1 細(xì)胞的增殖、遷移和集落形成，其機(jī)制可能是通過提高食管癌TE-1 細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生水平來啟動(dòng)凋亡，并通過上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9 的表達(dá)和下調(diào)Bcl-2、cyclin D1、cyclinD3 的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)凋亡。本研究結(jié)果為闡明GA抑制食管癌的作用機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，然而將GA作為抗食管癌的特效藥物并應(yīng)用于臨床，還需要大量深入研究以完善其具體的作用機(jī)制。