高效液相色譜法在食品檢測中的應用研究

俞凱龍

食品安全直接關系到人民的身體健康和生命安全，食品檢測在食品安全監(jiān)管中發(fā)揮了至關重要的作用。高效液相色譜法是食品檢測的常規(guī)手段之一，發(fā)展于20世紀60年代末。它是在經典液相色譜基礎上引入了氣相色譜的理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，具有速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化等特點。本文介紹了高效液相色譜法的原理、基本構件，并把它與氣相色譜法進行了比較，最后討論了其在食品檢測中的應用。

一、高效液相色譜法相關概述

1.高效液相色譜法的原理。高效液相色譜的分離原理是：在高壓條件下，利用樣品中的不同組分在固定相和流動相之間吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等作用的差異，在固定相和流動相相對運動時，使各組分在兩相中反復受到上述各作用力的作用而達到相互分離。

2.高效液相色譜儀的組成部分。高效液相色譜儀由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測器、數據處理系統(tǒng)構成。輸液系統(tǒng)將流動相輸入色譜柱，經進樣閥注入的樣品被流動相帶入色譜柱內，進行分離后依次進入檢測器，由數據處理系統(tǒng)記錄色譜信號再進行數據處理，最終得到分析結果。

輸液系統(tǒng)主要由儲液器、高壓輸液泵、脫氣機組成。儲液器用來存儲流動相及清洗液，需要有耐腐蝕的特性，體積一般為1-2L，同時配有溶劑過濾器，防止固體微粒進入儀器。高壓泵將流動相持續(xù)輸入色譜柱，需要滿足流量穩(wěn)定、壓力高、耐腐蝕、密封性好等條件。脫氣機的目的是去除流動相中的氣泡，保持基線平穩(wěn)。

進樣系統(tǒng)的作用是將待分析的樣品輸送到色譜柱。目前，一般的液相色譜儀采用六通閥進樣，利用樣品注射器吸入樣品溶液，通過定量環(huán)固定樣品溶液的吸入體積，具有進樣準確、重復性好、操作便捷等優(yōu)勢。

分離系統(tǒng)由色譜柱、柱溫箱、保護柱構成。色譜柱的柱管材料一般由內部拋光的不銹鋼管制成，柱長一般為5-30cm，內徑為2-5mm。柱溫箱用來維持色譜柱溫度的恒定，保持其被測組分保留時間的一致，也可選擇適宜的溫度縮短分析時間和提高分離度。保護柱為可選消耗品，填充物與色譜柱一致，安裝在色譜柱之前，用來收集來自樣品、流動相的污染物，延長色譜柱的使用期限。

檢測器用于反映組分經色譜柱分離后濃度的變化，形成的色譜峰用以定性或定量，具有高靈敏度、重復性好、線性范圍寬、噪音低等特點。常用的檢測器包括紫外檢測器（UVD）、二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器（FD）、示差折光檢測器（RID）。

數據處理系統(tǒng)的功能是處理色譜數據及控制儀器，它將檢測器輸出的電信號轉化成可處理的數字信號，通過處理色譜峰從而對目標物進行定性和定量分析。同時，它還可以控制儀器的運行，如儀器方法的設置、系統(tǒng)的平衡、管路的清洗等，提升儀器的使用效率。

二、高效液相色譜法與氣相色譜法的比較

高效液相色譜法的相關術語、理論基礎與氣相色譜基本一致（如保留時間、分離度、塔板理論等），同樣具有高選擇性、高靈敏度、分析速度快等特點。二者的差別主要體現在以下三個方面。

1.流動相不同。高效液相色譜法采用液體為流動相，流動相與樣品分子存在相互作用。流動相的種類有很多，包括水、有機溶液、鹽溶液等，同時可以選擇不同比例的多種溶液混合作為流動相，增加了分離的選擇性。氣相色譜法采用氮氣、氦氣等氣體為流動相，流動相與樣品分子之間不存在相互作用，流動相的種類少，對分離的效果影響不大。

2.分析對象不同。高效液相色譜法的分析對象范圍較大，適于分離沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大的有機物，占有機物總量的70%-80%。氣相色譜法進樣時樣品需加熱氣化，因此不適用于高沸點的化合物及熱穩(wěn)定性差的化合物。目前氣相色譜法能分析的有機物約占15%。

3.檢測器不同。高效液相色譜法目前還沒有高靈敏度、通用型的檢測器，分析時需要根據被測物質的性質選擇適宜的檢測器。紫外檢測器是應用最廣泛的檢測器，適用于對紫外可見光有吸收的化合物;熒光檢測器適用于能產生熒光的化合物;示差折光檢測器雖然是濃度型通用檢測器，但靈敏度較低且對溫度和流動相的變化敏感，適用于糖類、高分子化合物。氣相色譜法則存在高靈敏度、通用型的檢測器，如熱導檢測器（TCD）、氫火焰離子檢測器（FID）。

三、高效液相色譜法在食品檢測中的應用

1.食品中添加劑的檢測。食品添加劑是指為改善食品品質和色、香、味，以及防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質。如果食品生產者為了自身利益，超范圍或超限量使用食品添加劑，可能會危害人們的身體健康，因此國家對食品添加劑的種類、使用范圍及用量進行了嚴格的規(guī)定。

（1）防腐劑。防腐劑是防止食品腐爛變質，抑制食品中微生物的繁殖，延長食品儲存期的物質，經常使用的防腐劑有苯甲酸、山梨酸、納他霉素、脫氫乙酸等。楊紅梅等利用高效液相色譜法測定醬油中10種防腐劑，樣品經90%甲醇溶液提取，固相萃取柱凈化富集，C18色譜柱分離，結果表明該方法的檢出限在1.0-2.0mg/L，線性范圍在1.0-100.0mg/L，加標回收率在72.8%-100.9%。

（2）甜味劑。甜味劑顧名思義是賦予食品甜味的物質，常見的甜味劑包括糖精鈉、阿斯巴甜、環(huán)已基氨基磺酸鈉、安賽蜜等。包懿等以乙腈和硫酸銨溶液為流動相，樣品組分經過C18色譜柱分離、紫外檢測器檢測，最終結果顯示，5種甜味劑均能基線分離，加標回收率為95.2%-103.2%，線性范圍為4-200mg/L，相關系數均大于0.999。

（3）著色劑。著色劑又被稱為食用色素，是賦予和改善食品色澤的物質，常見的著色劑有檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅等。其中人工合成色素具有色澤鮮艷、著色能力強、化學性質穩(wěn)定、價格便宜等優(yōu)點，被廣泛應用于食品中，但過量食用會對人體健康造成危害。王婷等采用高效液相色譜法對食品中檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅等9種著色劑進行檢測，樣品經超聲提取及聚酰胺凈化，結果顯示，9種色素回收率達到76.2%-107.1%，方法檢出限為0.5mg/kg。

2.食品中營養(yǎng)成分的檢測。食品中的營養(yǎng)成分包括蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、無機鹽和水等六大類。不同食品中所含營養(yǎng)成分的種類、含量各有不同，通過對食品中的營養(yǎng)成分進行檢測，可以方便人們更合理地進行飲食搭配，科學地選擇適合自身的食品，有利于人們的身體健康。

（1）蛋白質。蛋白質為人體提供所需要的能量，是構成細胞、組織的重要組成部分，其基本組成部分是氨基酸，是由20種氨基酸組成的高分子化合物。與其他測定蛋白質方法不同的是，高效液相色譜法是通過前處理將蛋白質水解之后，再對氨基酸的具體構成及含量進行檢測。許永等采用高效液相色譜法測定新鮮煙葉中18種游離氨基酸，樣品經超純水提取，以異硫氰酸苯酯（PITC）衍生，利用C18色譜柱分離，18種氨基酸在2-50μg/mL范圍內線性關系良好，定量限為0.03-0.10mg/mL，回收率在84.6%-105%。

（2）維生素。維生素是維持身體健康所必需的一類有機化合物，人體自身不能合成或合成量不足，必須從食物中攝取。黃偉志等利用高效液相色譜法測定了功能性飲料中維生素B1、維生素B2，方法檢出限分別為0.0028μg/mL、0.00060μg/mL，回收率達到94.12%-98.53%，該方法操作簡單，適用于飲料中維生素B1、B2的測定。

（3）碳水化合物。碳水化合物由碳、氫、氧三種元素構成，由于所含氫、氧元素比例為二比一，與水的比例相同，所以稱為碳水化合物。食品中碳水化合物主要有兩種類型，一種是人體可以吸收的單糖、雙糖、多糖等，另一種是人體無法消化的纖維素等。毛善巧等利用高效液相色譜法測定車厘子中果糖、葡萄糖及蔗糖的含量，樣品經過80%乙醇溶液提取，通過納型色譜柱分離，平均加標回收率為99.96%、100.30%、99.26%，RSD分別為1.54%、0.49%、0.48%。

3.食品中有毒有害成分的檢測。在動植物的生長過程中大量使用農藥和獸藥，會引起動植物農獸藥殘留，再通過食物鏈進入人體，對人體身體健康造成危害。近年來還發(fā)生了一系列在食品中加入非法添加物的事件，比如將蘇丹紅用于辣椒、番茄醬等食物的著色，在奶粉中加入三聚氰胺從而提高產品的含氮量，這些食品都對人們的身體健康造成了巨大的威脅。利用高效液相色譜法檢測食品中的有毒有害成分，對保障食品安全有著十分重要的的作用。

（1）真菌毒素。真菌在生長繁殖過程中會產生次生有毒代謝產物，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素、展青霉素、赭曲霉毒素A等，其中黃曲霉毒素具有高毒性和致癌性。黎瑞等建立了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法同時測定糧食中黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2等8種真菌毒素的檢測方法。結果表明，8種真菌毒素的檢出限為0.152-100ng/mL，回收率達到80%-104.5%，方法精密度為2.6%-10.2%，是簡便、快速、高靈敏度的真毒毒素檢測方法。

（2）農獸藥殘留。農藥根據化學結構通常分為以下幾類：有機氯農藥、有機磷農藥、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等;常見獸藥主要有抗生素類、鎮(zhèn)靜劑類和激素類藥物。劉靖靖等采用高效液相色譜法同時測定食品中吡哌酸、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹8種喹諾酮類獸藥殘留的含量。結果顯示，回收率達到70.0%-99.5%，RSD為1.0%-8.5%，定量限為30μg/kg。余朝旭等利用氨基固相萃取柱對草莓中的7種氨基酸酯類農藥殘留進行了凈化富集，并結合熒光檢測器分析定量。結果顯示，7種農藥定量限達到0.005-0.008mg/kg，加標回收率達到81%以上，方法簡單且效果顯著。

（3）非法添加物。非法添加物指的是國家食品安全標準允許范圍之外的物質，由于其未經過科學驗證和風險評估，對人們的身體健康威脅較大，常見的非法添加物有三聚氰胺、蘇丹紅、吊白塊、罌粟殼等。曹美萍等采用固相萃取-高效液相色譜法測定辣椒制品中4種蘇丹紅染料，樣品經正己烷超聲提取，蘇丹紅專用柱富集凈化，目標物在0.1-5.0μg/mL的范圍內有良好的線性關系，檢出限為8-15μg/kg。

隨著經濟水平的日益提高，消費者對食品的要求從吃得飽轉向吃得健康，這對食品檢測提出了越來越嚴格的要求。目前，高效液相色譜法已經被廣泛應用于食品檢測領域，因其具有高靈敏度、分析效率快、高選擇性等特點，提供了準確、可靠的數據結果，在食品檢測領域發(fā)揮著越來越重要的作用。