鹽分對不同種植年限水稻土氮轉(zhuǎn)化功能基因的影響

肖錨，俞永祥，姚槐應(yīng)，*

(1. 武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢 430205；2. 中國科學(xué)院 城市環(huán)境研究所，福建 廈門 361021)

土壤鹽漬化引起的土壤退化是全球典型的生態(tài)問題。目前，中國鹽堿地總面積約3.6×107hm2，其中超過 1.3×106hm2位于濱海區(qū)域[1]。將濱海鹽堿灘涂圍墾成農(nóng)田，實現(xiàn)了從鹽堿地到可利用耕地的轉(zhuǎn)變，緩解了耕地不足的現(xiàn)狀。然而，鹽分也是限制濱海稻田土壤養(yǎng)分循環(huán)與利用的關(guān)鍵制約性因子。鹽分升高會改變土壤理化性質(zhì)和微生物群落的功能[2-3]，進而改變了土壤氮素循環(huán)過程。在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，氮素是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，土壤微生物驅(qū)動下有機氮的分解作用、銨態(tài)氮的硝化作用和硝態(tài)氮的反硝化作用是決定農(nóng)作物氮素利用效率的關(guān)鍵[4]。鹽分增加通常會抑制土壤硝化和反硝化微生物活性[5]，進而限制了土壤氮素供應(yīng)和轉(zhuǎn)化過程。當(dāng)前關(guān)于鹽分對土壤氮素轉(zhuǎn)化及其微生物調(diào)控機制的研究開展較多[6-7]，但鹽分對土壤氮轉(zhuǎn)化的微生物功能基因的研究較少。Zhou等[8]基于meta分析方法，發(fā)現(xiàn)鹽漬化顯著增加了土壤銨態(tài)氮含量，降低了土壤硝態(tài)氮含量，但對土壤硝化和反硝化過程的影響存在較大差異。微生物是驅(qū)動土壤氮素轉(zhuǎn)化的引擎，不同土壤中氮循環(huán)相關(guān)微生物群落的差異，可能是導(dǎo)致鹽漬化對土壤氮素轉(zhuǎn)化過程的影響存在較大差異的原因。將濱海灘涂圍墾成稻田是一種常見的土地利用方式，形成了具有不同種植年限的水稻土。圍墾早期的稻田土壤普遍存在含鹽量高、養(yǎng)分貧瘠和滲透性差等問題，土壤氮素周轉(zhuǎn)速率慢，農(nóng)作物利用氮素效率低[9]。但隨著水稻種植年限的增加，水稻土中驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)的微生物豐度和多樣性逐漸穩(wěn)定，而且土壤中氮素積累和消耗也達到動態(tài)平衡[10-11]。因此，稻田耕作年限增加可能會降低鹽分對土壤氮素轉(zhuǎn)化以及硝化和反硝化微生物的影響程度。然而，關(guān)于鹽分對不同種植年限水稻土氮素轉(zhuǎn)化微生物功能基因影響的研究較少。本研究以濱海稻田土壤為研究對象，探究鹽分對不同種植年限稻田土壤礦質(zhì)氮及氮素轉(zhuǎn)化功能基因的影響，以期為“防止土壤鹽漬化，提高土壤生產(chǎn)力”提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤采集自江蘇省鹽城市不同種植年限(3年、15年和40年)的水稻田(32°50′3″N～32°56′51″ N，120°28′28″ E～120°56′39″ E)，該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，多年平均氣溫為14.8℃，多年平均降水量為1 015.0 mm。采用棋盤法采集土壤表層土(0～20 cm)并充分混勻。挑出土壤中根、莖和石頭等雜物后過2 mm篩，在4℃下儲藏備用。試驗前測定的土壤基本理化性質(zhì)見表1。供試土壤長期冷藏保存后土壤硝態(tài)氮含量較高，主要歸因于低溫保存雖然抑制了土壤凈氮礦化和銨態(tài)氮消耗，但會增加土壤凈硝化和硝酸鹽固持速率[12]。不過，本試驗中冷藏保存的土壤經(jīng)過兩周的預(yù)培養(yǎng)后，硝態(tài)氮含量會接近新鮮土壤樣品[13]，最大限度保證了試驗結(jié)果的可靠性。

1.2 試驗設(shè)計

為探究水稻種植年限和鹽分的交互作用對礦質(zhì)氮及氮素轉(zhuǎn)化微生物功能基因的影響，試驗處理如下：(1)供試水稻土種植年限分別為3年、15年和40年；鹽堿化水稻土種植15年后，土壤微生物多樣性逐漸穩(wěn)定，氮素轉(zhuǎn)化過程也達到動態(tài)平衡[10]。(2)0.2%和0.6%和鹽分，分別代表中度鹽漬化與重度鹽漬化[9]。試驗共6個處理，每個處理3個重復(fù)。

試驗開始前，稱取干重為15 g的水稻土置于120 mL血清瓶中進行兩周的培養(yǎng)。對于0.2%含鹽量處理，對不同耕作年限水稻土中加入相應(yīng)的超純水，使得土壤水含量達到飽和狀態(tài)。對于0.6%含鹽量處理，按照Kester人工海水配方比例[14]，向土壤加入NaCl∶Na2SO4∶KCl∶NaHCO3比為23.93∶4.01∶0.68∶0.20的鹽分溶液。本試驗中，供試3年、15年和40年種植年限的水稻土中添加的鹽分總量分別為55.5、61.5和59.25 mg，并調(diào)節(jié)土壤含水量至飽和狀態(tài)。最后，將裝有供試水稻土的血清瓶放在25℃培養(yǎng)箱中，并加入0.15 g(1%)的水稻秸稈(碳、氮和碳氮比分別為38.59%、0.92%和41.91%)，充分混勻，用于提高微生物活性。培養(yǎng)期間按照稱重法補充土壤水分，并在第48天進行破壞性取樣，用于測土壤礦質(zhì)氮含量及土壤氮轉(zhuǎn)化的微生物功能基因。

1.3 土壤礦質(zhì)氮含量及氮轉(zhuǎn)化微生物功能基因的測定

將3 g鮮土加入15 mL的2 M KCl溶液中振蕩1 h后，通過濾紙過濾獲取浸提液，采用流動分析儀(Skalar SAN++ System, Skalar Analytical B.V., Breda, Netherlands)測定土壤銨態(tài)氮(NH4+)和硝態(tài)氮(NO3-)含量。

將部分土樣置于-80℃下冷凍干燥處理后，按照土壤DNA提取試劑盒(FastDNATMSPIN Kit for soil)提供的方法提取500 mg土壤樣品中的DNA。以16S rRNA基因(F515/R907)作為參考基因，使用高通量定量PCR方法測定編碼氮礦化(gdhA)、硝化(AOAamoA、AOBamoA、amoB、hao和nxrA)和反硝化(narG、nirK1、nirK2、nirS1、nirS2、nosZ1和nosZ2)有關(guān)的微生物功能基因相對豐度。PCR條件是：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共擴增40個循環(huán)，PCR擴增的引物及其序列詳見表2[15]。SmartChip qPCR軟件自動剔除有多個WaferGen自動生成的溶解曲線以及擴增效率>120%或<80%的結(jié)果，選擇小于31的結(jié)果閾值(CT)計算基因相對豐度(GR)[16]：

表2 本研究中用于PCR擴增的引物及其序列Table 2 Primers and their sequences for PCR amplification in this study

基因相對拷貝數(shù)GR=(31-CT)/(10/3)

(1)

為計算氮轉(zhuǎn)化功能基因的絕對豐度(GAfun)，按照Zheng等[16]采用的方法計算：

基因絕對拷貝數(shù)GAfun=GA16s·GRfun/GR16S

(2)

式(2)中：GA16s和GR16S分別表示16S rRNA基因的絕對豐度和相對豐度，GAfun和GRfun分別表示不同氮轉(zhuǎn)化功能基因的絕對豐度和相對豐度。16S rRNA絕對豐度采用qPCR測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用Excel 2019統(tǒng)計并處理數(shù)據(jù)，用SPSS 26軟件對數(shù)據(jù)進行單因素及雙因素方差分析，用Origin 2021軟件做圖，圖中的誤差棒均為標準誤差。不同處理之間的多重比較采用最小顯著法(LSD)，用不同小寫字母表示不同處理間存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽分對不同種植年限水稻土礦質(zhì)氮的影響

鹽分以及鹽分與水稻種植年限的交互作用顯著(P<0.05)影響了土壤NH4+含量(圖1a)。對于種植3年的水稻土，鹽分對土壤NH4+沒有顯著(P>0.05)影響，0.2%和0.6%含鹽量的土壤NH4+含量分別為0.69和0.74 mg·kg-1。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加顯著(P<0.05)提升了土壤NH4+含量。0.2%和0.6%含鹽量下，種植15年水稻土NH4+含量分別為0.26和1.51 mg·kg-1，種植40年的水稻土NH4+含量分別為0.21和0.32 mg·kg-1。

鹽分以及鹽分與水稻種植年限的交互作用對土壤NO3-沒有顯著影響(P>0.05)(圖1b)。對于種植3年和15年的水稻土，鹽分對土壤NO3-沒有顯著(P>0.05)影響。0.2%含鹽量下，3年和15年水稻土NO3-含量分別為1.53和1.66 mg·kg-1；而0.6%含鹽量下，3年和15年水稻土NO3-含量分別為1.38和1.46 mg·kg-1。鹽分增加顯著(P<0.05)降低了種植40年水稻土NO3-含量，0.2%和0.6%含鹽量土壤NO3-含量分別為1.12和0.85 mg·kg-1。

2.2 鹽分對不同種植年限水稻土氮轉(zhuǎn)化功能基因的影響

基于高通量定量PCR技術(shù)，共檢測到編碼氮礦化(gdhA)、硝化(AOBamoA和amoB)和反硝化(narG、nirK、nirS和nosZ)轉(zhuǎn)化酶的微生物功能基因。不同水稻土中，編碼亞硝酸鹽還原酶的nirS基因豐度相對較高(1.42×107～4.38×107)，其次為編碼氮礦化酶的gdhA(1.99×106～5.66×106)、氧化亞氮還原酶的nosZ基因(1.43×106～5.24×107)和氨氧化細菌硝化的amoA(1.63×105～1.71×106)；而編碼硝酸鹽還原酶的narG(3.25×104～5.32×104)和亞硝酸鹽還原酶的nirK(2.55×104～1.43×105)基因豐度相對較低(圖2)。

鹽分、水稻土種植年限及其交互作用顯著(P<0.05)影響了gdhA、amoA和amoB基因豐度(表3，圖2)。對于水稻土有機氮礦化過程，鹽分增加對種植3年的水稻土gdhA基因沒有顯著影響，但使得種植15年和40年水稻土gdhA基因豐度顯著增加。對于水稻土硝化過程，鹽分對不同種植年限的amoA和amoB基因的影響存在差異。鹽分增加使得種植3年和15年的水稻土amoA基因豐度顯著降低，但對種植40年水稻土amoA基因豐度沒有顯著影響。鹽分增加分別使得種植3年、15年和40年水稻土amoB基因豐度顯著降低、無顯著影響和顯著增加。

表3 鹽分、水稻種植年限及其交互作用對氮循環(huán)功能基因的影響Table 3 Salinity，cultivated years and their interaction effects on microbial functional genes involved in nitrogen transformation

反硝化過程中，鹽分及其與水稻土種植年限的交互作用對narG和nirS基因沒有(P>0.05)顯著影響(表3，圖2)，鹽分增加僅使得種植40年的水稻土narG基因豐度顯著(P<0.05)增加。鹽分、水稻種植年限及其交互作用對nirK和nosZ基因均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。對于亞硝酸鹽還原過程，鹽分增加使得種植15年和40年水稻土nirK基因豐度顯著增加，對種植3年的水稻土nirK基因沒有顯著影響。對于N2O還原過程，鹽分增加使得不同種植年限水稻土的nosZ基因豐度均顯著增加。

2.3 土壤理化性質(zhì)與氮轉(zhuǎn)化功能基因的相關(guān)性分析

土壤理化性質(zhì)(鹽分、有機碳、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)可解釋土壤氮轉(zhuǎn)化微生物功能基因74.2%的變異(圖3)。NH4+與gdhA基因和amoB基因呈正相關(guān)關(guān)系，與AOBamoA基因相關(guān)性不大，而NO3-與amoB存在正相關(guān)關(guān)系，與其他硝化和反硝化功能基因相關(guān)性不大。鹽分含量與nosZ基因呈正相關(guān)關(guān)系，與AOBamoA呈負相關(guān)關(guān)系。土壤有機碳含量與nirK、nirS和gdhA呈正相關(guān)關(guān)系，與AOBamoA呈負相關(guān)關(guān)系。

3 討論

鹽漬化通常會抑制土壤微生物的生長和活性，進而降低了微生物驅(qū)動下的土壤有機氮礦化速率[8,17]。但Zhou等[8]基于meta分析發(fā)現(xiàn)，鹽分增加提升了土壤有機氮的凈礦化速率，但抑制了NH4+的生物固持，進而顯著增加了土壤NH4+含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水稻土熟化程度可能控制了鹽分對土壤有機氮礦化及NH4+含量的影響。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加使得編碼土壤有機氮礦化酶的gdhA基因豐度增加，進而通過促進土壤有機氮礦化增加了土壤NH4+含量。但對于種植3年的水稻土，鹽分增加對土壤NH4+含量和gdhA基因豐度均沒有顯著影響。究其原因，可能是種植水稻15年后，土壤氮素累積和消耗的動態(tài)平衡以及微生物群落演化均達到穩(wěn)定狀態(tài)[10]，使得鹽分對土壤有機氮礦化存在顯著影響。但種植3年的水稻土微生物豐富度和多樣性可能較低[10]，鹽分對微生物驅(qū)動下土壤礦化過程的影響存在較大的不確定性，導(dǎo)致鹽分對土壤有機氮礦化沒有顯著影響。

鹽漬化會改變土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，進而對土壤硝化過程存在低鹽促進、高鹽抑制的作用[18-19]。本研究的冗余分析結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，水稻土氨氧化細菌的amoA豐度與鹽分呈負相關(guān)關(guān)系，表明鹽分增加抑制了土壤氨氧化細菌功能基因的表達。不過，李明[20]等發(fā)現(xiàn)枸杞園土壤氨氧化古菌對鹽分變化不敏感，表明鹽分對氨氧化細菌和氨氧化古菌的影響存在較大差異。因此，在考慮鹽分對土壤氨氧化過程中，應(yīng)定量區(qū)分鹽分對氨氧化細菌和古菌對土壤硝化過程的相對貢獻。此外，鹽分對不同種植年限水稻土氨氧化細菌的影響存在較大差異。對于種植3年和15年的水稻土，較高鹽分水平下水稻土amoA基因豐度較低，可能抑制了土壤硝化過程。但對于種植40年的水稻土，鹽分對水稻土amoA基因豐度沒有顯著影響。該結(jié)果表明，隨著水稻土逐漸熟化，鹽分對土壤氨氧化細菌的影響程度逐漸降低。水稻是喜銨植物，對于熟化程度較低的水稻土，鹽漬化除了對水稻生長產(chǎn)生脅迫外，還可能抑制土壤硝化速率，不利于水稻利用有機氮分解產(chǎn)生的氮素。因此，在濱海鹽堿灘涂圍墾成農(nóng)田前期，除了種植具有耐鹽能力的水稻外，應(yīng)適當(dāng)增加銨肥輸入量，保證作物產(chǎn)量。

較高的鹽分含量會抑制土壤硝化過程，減少可供土壤反硝化微生物利用的NO3-底物，進而降低土壤反硝化速率[21]。但Zhou等[8]基于meta分析發(fā)現(xiàn)，鹽分對土壤硝化過程以及土壤NO3-含量均沒有顯著影響，可能是土壤中參與氮循環(huán)的相關(guān)微生物存在較大差異，減緩了鹽漬化對土壤反硝化過程的限制作用。本研究結(jié)果表明，鹽分使得種植3年和15年的水稻土氨氧化細菌amoA豐度降低，但并未顯著影響土壤NO3-含量；對于有40年種植歷史的水稻土，鹽分增加使得編碼硝化過程的amoB基因豐度顯著增加，但也使得編碼硝酸鹽還原酶的narG基因豐度增加，進而使得土壤NO3-含量顯著降低。不僅如此，鹽分增加還會抑制硝酸鹽還原產(chǎn)生的亞硝酸鹽氧化過程[17]，導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累，并對水稻生長產(chǎn)生毒害。稻田土壤通常處于淹水環(huán)境，土壤中氧氣不足，更有利于亞硝酸鹽積累。因此，對于熟化程度較高的鹽漬化水稻田，需要適當(dāng)開展排水曬田，減輕亞硝酸鹽污染對水稻生長產(chǎn)生的危害。

土壤鹽漬化會抑制土壤反硝化過程，鹽分過高甚至使得土壤反硝化過程完全終止[17]。有研究發(fā)現(xiàn)鹽分增加會減少沉積物中nirK和nosZ基因豐度，但對nirS基因沒有顯著影響[22]，即鹽分增加會抑制土壤反硝化過程中的亞硝酸鹽和N2O還原過程。而本研究發(fā)現(xiàn)鹽分增加使得nirK和nosZ基因豐度顯著增加，但對nirS基因沒有顯著影響，可能歸因于水稻土中編碼nirS功能基因的微生物活性較高[23]，對鹽分增加具有更高的抵抗力有關(guān)。不同種植年限的水稻土，較高的含鹽量下nosZ基因豐度較高，可通過促進水稻土N2O還原過程而減少N2O排放。因此，在估算鹽漬化稻田土壤溫室氣體排放過程中，需要考慮鹽分對土壤N2O排放的抑制作用。不過，有研究發(fā)現(xiàn)鹽漬化雖然增加了編碼N2O還原酶的nosZ功能基因豐度，但可能通過增加真菌反硝化強度，進而存在較高的土壤N2O排放風(fēng)險[24]。因此，未來需要結(jié)合大田試驗，探究鹽分增加對不同耕作年限水稻土N2O排放的影響，量化真菌反硝化過程對土壤N2O釋放量的貢獻。

4 結(jié)論

1)鹽分對稻田土壤有機氮礦化及土壤NH4+含量的影響受水稻種植年限的影響。對于種植15年和40年的水稻土，鹽分增加使得編碼土壤有機氮礦化的gdhA基因豐度增加，進而提升了土壤NH4+含量；但對于種植3年的水稻土，鹽分對gdhA基因豐度和NH4+含量均沒有顯著影響。

2)鹽分對土壤NO3-含量的影響取決于水稻種植年限。對于種植40年的水稻土，鹽分增加使得編碼NO3-還原酶的narG基因豐度增加，進而使得土壤NO3-含量顯著降低。對于種植3年和15年的水稻土，鹽分對narG基因豐度和NO3-含量沒有顯著影響。

3)對于不同水稻種植年限的土壤，鹽分增加均使得編碼N2O還原酶的nosZ基因豐度顯著增加，可能利于提升水稻土N2O還原強度，進而減少土壤N2O排放。