基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討川芎嗪對急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的保護機制

陳杰 黃石飛 韓業(yè)紅

1杭州市中醫(yī)院外一科，杭州 310021；2浙江省人民醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，杭州 310014

川芎嗪(tetramethylpyrazine)是從傳統(tǒng)中草藥川芎中分離得到的化合物，具有血管生成和血管保護作用以及抗炎、抗氧化等功能，臨床上被長期用于治療心腦血管疾病和炎癥性疾病[1]。近來發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以改善AP引起的胰腺和腸道損傷[2]，通過抑制NF-κB的活化，阻斷炎癥因子釋放和增加細(xì)胞凋亡來減輕AP的嚴(yán)重程度[3]，具有治療AP的潛能，但確切機制尚未明確。本研究借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出川芎嗪治療急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)的靶點，進行功能富集分析和通路富集分析，探討川芎嗪治療ANP的核心靶點及其潛在的分子機制，并進一步在ANP大鼠模型上進行初步驗證，以期為川芎嗪的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供新的思路。

材料與方法

一、川芎嗪作用靶點的獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)，以“2,3,5,6-tetramethylpyrazine”為關(guān)鍵詞檢索川芎嗪的作用靶點，下載其mol2 格式并上傳到PharmMapper網(wǎng)站。靶點種類設(shè)定為Human Protein Targets Only (v2010, 2241)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫對獲得的靶點進行篩選，物種限定為“homosapiens”。

二、ANP相關(guān)靶點的獲取

通過人類疾病信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫CTD(Comparative Toxicogenomics Database)、DisGeNET、GeneCards(The Human Gene Database)、OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)，以“pancreatitis, acute necrotizing”為檢索詞對ANP相關(guān)基因進行檢索篩查并整合，剔除重復(fù)項，獲得ANP相關(guān)的候選靶點。

三、川芎嗪和ANP交集靶點蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

將川芎嗪的作用靶點與ANP的候選靶點上傳至在線韋恩圖，得到川芎嗪和ANP的交集基因。將交集基因?qū)隨TRING(Search Tool for Retrieval of Interaction Genes)數(shù)據(jù)庫以構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction networks, PPI)網(wǎng)絡(luò)，將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，應(yīng)用Network Analyzer插件進一步分析、調(diào)整后作圖，并利用cytoHubba插件篩選PPI的關(guān)鍵靶點。

四、功能富集分析

利用R語言(4.0.3)clusterProfiler包(3.16.1)進行基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。參數(shù)選擇pvalueCutoff=0.05，pAdjustMethod=“BH”，qvalueCutoff=0.05。GO功能富集分析包括3個不同的水平：生物學(xué)過程，細(xì)胞組成和分子功能，根據(jù)P值從小到大選擇前10位。

五、川芎嗪與ANP關(guān)鍵靶點分子對接

將已知的關(guān)鍵靶點與川芎嗪進行分子對接，得到對接親和力，反映其穩(wěn)定性。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB)下載核心蛋白分子結(jié)構(gòu)，從TCMSP下載川芎嗪的結(jié)構(gòu)，將蛋白和川芎嗪結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol 2.5.2和Auto Dock Tools 1.5.6軟件進行分子對接及可視化處理。

六、實驗動物及分組

30只250～350 g相同遺傳背景的SPF級雄性SD大鼠均購自上海斯拉克公司，動物合格證號為SCXK(滬)2017-0005，按照數(shù)字表法隨機分為對照組、ANP組和川芎嗪治療組(川芎嗪組)，每組10只。采用胰膽管逆行注射4%?；悄懰徕c1 ml/kg的方法建立ANP大鼠模型[4-5]。川芎嗪組在制模后5 min內(nèi)經(jīng)腹腔注射川芎嗪注射液10 ml/kg[6]。注射用鹽酸川芎嗪購自平光制藥股份有限公司，溶于100 ml 0.9%生理鹽水，藥物濃度為0.6%。對照組僅經(jīng)尾靜脈注射等容積PBS。

七、胰腺組織病理學(xué)檢查及關(guān)鍵靶點蛋白表達檢測

大鼠于制模后12 h處死，取胰腺組織，常規(guī)固定，石蠟包埋，切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察胰腺組織的病理學(xué)改變。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測胰腺組織表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、胱天蛋白酶3(caspase 3, CASP3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)、B細(xì)胞淋巴瘤樣蛋白1(B-cell lymphoma-2-like protein 1, BCL2L1/Bcl-XL)蛋白的表達?？笶GFR抗體(ab52894)、CASP3抗體(ab184787)、MAPK1抗體(ab109282)和BCL2L1抗體(ab32370)均購自英國ABCAM公司，二抗(PV-6001)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)獲取染色結(jié)果的光密度值。

八、血清生物化學(xué)指標(biāo)檢測

大鼠處死前眼眶取血，2 000 r/min離心(離心半徑9.856 cm)收集血清，-80℃保存。采用ELISA法檢測血清白介素-6(interleukin-6, IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。IL-6、TNF-α試劑盒均購自上海江萊生物公司，按試劑盒說明書操作。

九、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、川芎嗪和ANP的相關(guān)靶點

通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫最終得到川芎嗪的潛在靶點共142個，將靶點名稱上傳到Uniprot數(shù)據(jù)庫，校正靶點名稱并剔除重復(fù)基因，最終得到137個靶點。

從CTD、DisGeNET、GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫分別篩選出ANP相關(guān)基因24 575、62、1 876和150個，合計26 663個；剔除其中關(guān)聯(lián)得分較小的基因，分別篩選出202、62、234和69個相關(guān)度得分較高的基因，經(jīng)合并剔除重復(fù)基因后得到513個高分靶點。

二、川芎嗪和ANP交集靶點基因及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將川芎嗪潛在靶點信息與ANP高分靶點信息取交集，選擇同時存在于川芎嗪潛在靶點信息與ANP高分靶點信息中的靶點基因，得到川芎嗪中與ANP發(fā)病機制相關(guān)的25個作用靶點基因(圖1)。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了川芎嗪和ANP交集的25個作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其中5個關(guān)鍵靶點有相互作用，分別為白蛋白(ALB)、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1，節(jié)點度(degree)值分別為21、18、16、15、14。

圖1 川芎嗪與急性壞死性胰腺炎的共同靶點

三、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

對25個共同靶點基因進行GO功能分析，結(jié)果顯示，生物學(xué)過程主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育(GO：0048608)、生殖系統(tǒng)發(fā)育(GO：0061458)、對抗生素的反應(yīng)(GO：0046677)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)(GO：0062197)和對活性氧的反應(yīng)(GO：0000302)等；細(xì)胞組成主要為囊泡腔(GO：0031983)、膜筏(GO：0045121)、膜微區(qū)(GO：0098857)、分泌顆粒腔(GO：0034774)和細(xì)胞質(zhì)囊泡腔(GO：0060205)等靶蛋白；分子功能主要包括SH2域結(jié)合(GO：0042169)、蛋白酪氨酸激酶活性(GO：0004713)、磷酸酪氨酸殘基結(jié)合(GO：0001784)、蛋白酶結(jié)合(GO：0002020)和核受體活性(GO：0004879)等。

對25個共同靶點基因行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，與ANP的發(fā)展和治療相關(guān)的通路主要包括Ras信號通路(hsa04014)、PI3K-Akt信號通路(hsa04151)、鉑類藥物耐藥(hsa01524)、磷脂酶D信號通路(hsa04072)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(hsa01521)，以及慢性粒細(xì)胞白血病、膀胱癌和黑色素瘤等腫瘤信號通路。

四、川芎嗪與ANP關(guān)鍵靶點分子對接

運用AutoDockTools以半柔性對接方法將川芎嗪與上述關(guān)鍵靶點進行分子對接，得到川芎嗪與ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1的結(jié)合能分別為-5.06、-4.03、-3.74、-3.82、-4.33 kcal/mol，平均結(jié)合能為-4.20 kcal/mol。它們之間分子對接的詳細(xì)模式見圖2。

圖2 川芎嗪與白蛋白(2A)、表皮生長因子受體(2B)、胱天蛋白酶3(2C)、絲裂原活化蛋白激酶1(2D)、B細(xì)胞淋巴瘤樣蛋白1(2E)的分子對接模式圖

五、各組大鼠胰腺組織病理學(xué)改變

對照組大鼠無腹水，胰腺形態(tài)正常，鏡下見胰腺小葉結(jié)構(gòu)完整。ANP組大鼠腹腔內(nèi)有大量血性腹水，胰腺、腸系膜周圍可見散在的鈣化斑，胰腺腫脹、周圍滲出明顯，并可見出血壞死灶；鏡下見胰腺腺體結(jié)構(gòu)較紊亂，小葉間隙明顯增大，腺泡、血管周圍以及腺體間隙均可見中性粒細(xì)胞浸潤。川芎嗪組大鼠腹腔內(nèi)少量腹水，胰腺輕中度腫脹伴周圍少量滲出，鏡下見胰腺小葉間隙略微增大，散在中性粒細(xì)胞浸潤(圖3)。

圖3 對照組(3A)、急性壞死性胰腺炎組(3B)、川芎嗪組(3C)大鼠胰腺組織病理學(xué)改變(蘇木精-伊紅染色 ×200)

六、各組大鼠胰腺組織EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1蛋白表達水平

對照組胰腺組織EGFR、CASP3、MAPK1表達量分別為0.11±0.03、0.20±0.03、0.16±0.03；ANP組分別為0.31±0.04、0.43±0.05、0.33±0.08；川芎嗪組分別為0.24±0.05、0.34±0.06、0.20±0.05。ANP組較對照組顯著升高，川芎嗪組較ANP組顯著降低(P值均<0.01)；對照組、ANP組和川芎嗪組胰腺組織BCL2L1表達量分別為0.19±0.05、0.28±0.06和0.43±0.20，ANP組較對照組顯著升高，川芎嗪組又較ANP組顯著升高(P值均<0.05，圖4)。

圖4 對照組、急性壞死性胰腺炎組、川芎嗪組胰腺組織表皮生長因子受體(4A～4C)、胱天蛋白酶3(4D～4F)、絲裂原活化蛋白激酶1(4G～4I)、B細(xì)胞淋巴瘤樣蛋白1(4J～4L)的蛋白表達(免疫組織化學(xué)染色 ×20)

七、各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平

ANP組大鼠血清IL-6和TNF-α水平均較對照組顯著增高，而川芎嗪組血清IL-6和TNF-α水平均較ANP組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 3組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平

討 論

氣不通是AP的基本病機，通里攻下應(yīng)貫穿治療的始終，在疏肝解郁、清熱化濕、通腑瀉熱、祛瘀通腑、回陽救逆的基本治療原則下，可采用中藥口服、灌腸、外敷和針刺等內(nèi)外治法相結(jié)合的多途徑治療方案[7]。川芎嗪是從傳統(tǒng)中草藥川芎中分離得到的化合物。本研究共獲得25個川芎嗪治療ANP的靶點，其中ALB、EGFR、CASP3、MAPK1和BCL2L1為治療的核心靶點。一般認(rèn)為配受體間相互作用的親和力越強，所需的能量就越少，其發(fā)生作用的可能性就越大。本研究分子對接的平均結(jié)合能為-4.20 kcal/mol，表明川芎嗪與這些關(guān)鍵靶點蛋白均有較好的結(jié)合活性。同時，GO功能富集分析顯示，川芎嗪治療ANP的生物學(xué)過程涉及生殖結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育、對抗生素的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)和對活性氧的反應(yīng)等；KEGG通路富集分析結(jié)果表明，川芎嗪治療ANP的主要通路富集在Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、鉑類藥物耐藥、磷脂酶D信號通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。

MAPK1又稱細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(extracellular signal-regulated kinase 2, ERK2)，作為多種生物化學(xué)信號的整合點，參與多種細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育等過程。有研究表明，MAPK信號通路與重癥急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，通過抑制MAPK信號通路減少腸道炎癥反應(yīng)和菌群失調(diào)，可減輕胰腺組織損傷[8]。本研究結(jié)果顯示，MAPK1蛋白在ANP組大鼠中高表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而川芎嗪組MAPK1表達則較ANP組顯著降低，血清IL-6和TNF-α也顯著降低，說明川芎嗪可以抑制MAPK1的表達及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放，從而減輕ANP后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。

EGFR是ErbB受體家族的成員之一，屬于受體酪氨酸激酶類。ErbB受體信號通過Akt、MAPK以及其他多種通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化和凋亡。在多種類型的惡性腫瘤中，ErbB家族成員及其部分配體通常過表達、擴增或突變，這使其成為重要的治療靶標(biāo)[9]。ANP小鼠存在著EGFR信號的過度激活[10]，F(xiàn)an等[11]研究也發(fā)現(xiàn)EGFR可能在AP的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，可作為AP診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。EGFR配體β細(xì)胞素已被證實對AP小鼠有保護作用，雨蛙素和L-精氨酸不能誘導(dǎo)過表達β細(xì)胞素的轉(zhuǎn)基因小鼠引發(fā)AP[12]。本研究發(fā)現(xiàn)對照組大鼠EGFR蛋白表達水平最低，ANP組表達水平最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)過川芎嗪干預(yù)后，EGFR表達水平則較ANP組明顯降低，推測川芎嗪具有類似β細(xì)胞素的作用，能夠促進胰腺β細(xì)胞新生，在胰腺再生中發(fā)揮一定的作用，對ANP具有保護性作用，可作為治療AP的常規(guī)藥物。

細(xì)胞凋亡參與AP感染性并發(fā)癥的發(fā)生和進展，與ANP多器官功能障礙有關(guān)，因而，控制細(xì)胞凋亡可能是改善ANP臨床預(yù)后的有效策略[13]。CASP3是一種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)的執(zhí)行階段起著核心作用，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和炎癥的信號通路[14]。BCL2L1/Bcl-XL則是Bcl-2家族的一種抗凋亡蛋白，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一[15]。Loo等[16]在研究人類多能干細(xì)胞分化為胰腺細(xì)胞的過程中觀察到Bcl-XL的表達上調(diào)及caspase 3的相應(yīng)下調(diào)，調(diào)節(jié)Bcl-XL的表達水平可以顯著改善胰腺細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)ANP組大鼠CASP3蛋白表達水平較對照組顯著升高，經(jīng)川芎嗪治療后，其表達水平則較ANP組顯著降低；而BCL2L1蛋白表達水平在經(jīng)過川芎嗪治療后進一步顯著升高，說明川芎嗪可以促進抗凋亡蛋白Bcl-XL表達增多，抑制caspase 3的水解，阻斷酶解級聯(lián)反應(yīng)，進而對抗胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，緩解胰腺炎的進展，并可能促進胰腺細(xì)胞再生。

綜上所述，川芎嗪可以通過激活EGFR、MAPK1等多種信號通路，減輕ANP后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，增強諸如BCL2L1等抗凋亡基因的表達，阻斷CASP3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡半胱天冬酶解級聯(lián)反應(yīng)，對?；悄懰徕c誘導(dǎo)的ANP大鼠胰腺組織起保護性作用，為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了新的思路。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明陳杰：研究操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、經(jīng)費支持；黃石飛：研究操作、論文撰寫、數(shù)據(jù)整理；韓業(yè)紅：研究指導(dǎo)、論文修改、數(shù)據(jù)整理