上海郊區(qū)豬戊型肝炎病毒分子流行病學(xué)調(diào)查

周佳明,陳 岡,司伏生,于瑞嵩,陳冰清,謝春芳,李 震,董世娟?

(1 上海市金山區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,上海 201540;2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市種豬育種工程中心,上海 201106)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的通過消化道感染的急性病毒性肝炎,主要通過污染的水和食物經(jīng)糞-口傳播,也可經(jīng)血液、母嬰傳播[1-2]。 人群中戊型肝炎的病死率較甲型、乙型、丙型和丁型肝炎高,青壯年戊肝病死率可達(dá)1%—2%,患病孕婦的病死率高達(dá)21%[3],給人類健康造成了嚴(yán)重威脅。 研究證實(shí),HE 是人畜共患傳染病[4],HEV 可跨種間傳播[5-7],多種動(dòng)物是HEV 的重要宿主[8-9],且豬是公認(rèn)的HEV 重要儲(chǔ)存宿主和傳染源,國內(nèi)外均有豬HEV 傳染人類的報(bào)道[10]。 HEV 有1 個(gè)血清型和4 個(gè)基因型。 基因1 型、2 型只感染人,而3 型、4 型為人畜共患型,可感染人和多種動(dòng)物。 基因1 型主要流行于西亞、我國新疆等地區(qū)及非洲的部分地區(qū);基因2 型流行于中美洲墨西哥等國,基因3 型最初流行于歐洲、北美以及新西蘭,近年來也開始在亞洲的國家和地區(qū)流行,如日本、韓國、中國等。 基因4 型主要在亞洲各國和地區(qū)流行。 在我國,人感染的HEV 基因型包括1 型、3 型和4型[11],豬場(chǎng)流行的HEV 主要為3 型和4 型[12]。

HEV 在我國豬群中廣泛存在,Zhou 等[13]對(duì)我國不同地區(qū)的1 768 頭商品豬血清樣本進(jìn)行流行病學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)HEV 抗體總陽性率達(dá)到67.14%(四川62.75%、福建67.03%、湖北62.50%、安徽62.81%、江西73.73%、寧夏73.1%、甘肅70.81%)。 Ning 等[12]對(duì)上海郊區(qū)豬場(chǎng)糞便樣本進(jìn)行HEV 分子流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)26%的樣本為HEV 陽性。 紀(jì)方曉等[14]對(duì)廣東不同豬場(chǎng)的豬膽汁樣本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)HEV 的陽性率為6.8%。 為了解上海郊區(qū)豬場(chǎng)豬戊型肝炎的最新流行狀況,本研究對(duì)上海郊區(qū)部分豬場(chǎng)進(jìn)行HEV 分子流行病學(xué)調(diào)查和流行毒株的遺傳進(jìn)化分析,以期為HEV 的防控和公共衛(wèi)生安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采集上海郊區(qū)3 個(gè)豬場(chǎng)豬糞便樣本共180 份,其中2 月齡仔豬糞便樣本60 份,5—6 月齡育肥豬糞便樣本60 份,母豬糞便樣本60 份。 糞便樣品用滅菌的PBS 制成10% 糞便懸液,震蕩混勻,于4 ℃、12 000 r∕min 離心10 min,收集上清,置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2 主要試劑

病毒RNA 提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;一步法高效RT-PCR 試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠DNA 回收試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品;E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室制備保存;Clone JET PCR Cloning Kit 載體為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物

利用巢氏PCR 引物擴(kuò)增ORF2 基因的部分片段,長度為189 bp。 所用引物序列為外側(cè)引物:H1(5’-CTGTTTAAYCTTGCTGACAC-3’) 和 H2 (5’-WGARAGCCAAAGCACATC-3’); 內(nèi) 側(cè) 引 物 H3 (5’-GACAGAATTGATTTCGTCG-3’)和H4(5’-TGYTGGTTRTCRTAATCCTG-3’)。

1.4 病毒總RNA 抽提

按照病毒RNA 快速純化試劑盒說明書進(jìn)行操作,抽提的RNA 溶解在30 μL RNase-free 的DEPC 水中,并保存于-80 ℃冰箱。

1.5 ORF2 基因擴(kuò)增

ORF2 基因擴(kuò)增采用巢氏RT-PCR 反應(yīng)進(jìn)行,首先利用一步法高效RT-PCR 試劑盒擴(kuò)增HEV ORF2 基因。 一步法總反應(yīng)體系為25 μL:2 ×One Step Mix 12.5 μL,One Step Enzyme Mix 1.25 μL,外側(cè)引物H1、H2 各1 μL,RNA 9.25 μL。 反應(yīng)條件為:50 ℃30 min,94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃50 s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。 利用第一輪PCR 產(chǎn)物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:2 ×Taq PCR Mix 6.25 μL,內(nèi)側(cè)H3、H4 各0.5 μL,DEPC 水2.25 μL,cDNA 3 μL。 反應(yīng)條件為:94 ℃3 min;94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃40 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

1.6 PCR 產(chǎn)物克隆、序列測(cè)定和比較分析

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,克隆至pJET 1.2∕blunt 載體中,轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆進(jìn)行PCR 鑒定,提取質(zhì)粒,送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。 將測(cè)定結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,鑒定基因型;分別在經(jīng)鑒定為基因3 型和4 型的樣本中選擇序列有差異的代表性樣本(樣本按照豬場(chǎng)所在區(qū)名的首字母+陽性樣本的順序號(hào)命名)與GenBank 中登錄的34 條HEV 的ORF2 基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析,并利用DNAstar 軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞便樣品HEV ORF2 基因檢測(cè)

180 份糞便樣本經(jīng)PCR 擴(kuò)增后,28 份樣本擴(kuò)增出189 bp 的特異性條帶,與預(yù)期目的片段大小相符。將28 份陽性樣本的ORF2 基因進(jìn)行序列分析,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn),23 份樣本為基因4 型,5份為基因3 型。 圖1 為3 份代表性樣品(從基因3 型和基因4 型的樣本中選取)的電泳分析。 180 份糞便樣本的HEV 總陽性率為15.6%(表1),其中50—60 日齡豬糞便中檢測(cè)到19 份陽性,陽性率為31.7%;5—6 月齡豬糞便中檢測(cè)到9 份陽性,陽性率為15.0%;母豬糞便樣本中未檢測(cè)到HEV 陽性。

表1 豬糞便中HEV RNA 的PCR 檢測(cè)結(jié)果Table 1 PCR detection results of HEV RNA in pig feces

2.2 ORF2 部分基因序列測(cè)定及進(jìn)化樹分析

從28 份陽性樣本中選取4 份基因4 型的樣本(FX01、FX03、JS01、FX04 毒株)、1 份基因3 型的樣本(FX06 毒株)擴(kuò)增的ORF2 序列與GenBank 中參考毒株序列(表2)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。 結(jié)果表明:本試驗(yàn)所檢測(cè)的FX01、FX03、JS01、FX04 毒株與基因4 型參考毒株SAAS-FX17 的序列同源性高達(dá)96.3%;FX06 毒株與基因3 型參考毒株SAAS-JDY5 的序列同源性高達(dá)97.9%。

表2 HEV 參考毒株的信息Table 2 Information of HEV reference strains

2.3 ORF2 基因的同源性分析

圖2 HEV ORF2 基因部分毒株的遺傳進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ORF2 gene of some HEV strains

同源性分析發(fā)現(xiàn),5 個(gè)毒株(FX01、FX03、FX04、FX06、JS01)的核苷酸同源性為80.9%—98.4%,其中基因4 型的4 個(gè)毒株(FX01、FX03、FX04、JS01)核苷酸同源性為96.3%—98.4%,與基因4 型參考毒株的核苷酸同源性為91.5%—96.3%;基因3 型毒株FX06 與其他4 個(gè)基因4 型毒株的核苷酸同源性為80.9%—83%,與基因3 型參考毒株的核苷酸同源性為90.4%—97.9%。

對(duì)本試驗(yàn)的參考毒株序列與代表性毒株序列進(jìn)行核苷酸同源性分析表明:1 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為95.8%—100%,與2 型、3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分別為83.6%—87.8%、84.1%—88.4%、83.6%—88.4%;2 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為87.3%—100%,與3 型、4 型毒株的核苷酸同源性分別為81.5%—86.8%、82.5%—86.2%;3 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為90.5%—100.0%,與4 型毒株的核苷酸同源性為82.0%—86.2%;4 型組內(nèi)毒株的核苷酸同源性為88.4%—100.0%。

3 討論

戊型肝炎病毒是人病毒性肝炎的重要病原之一,全球每年超過百萬人感染,被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為影響發(fā)展中國家的重要公共衛(wèi)生問題[15]。 動(dòng)物HEV 感染宿主范圍廣、種類多、變異快,目前已在豬、雞、兔、駱駝、牛、羊等動(dòng)物中獲得了不同動(dòng)物的HEV 分離株[16]。 豬是主要的病毒儲(chǔ)庫,是人戊型肝炎的主要傳染源之一,我國豬HEV 的流行情況復(fù)雜,存在感染率高、同一地點(diǎn)不同基因型重復(fù)污染、與多種病原共存的現(xiàn)象[17]。 目前,全世界范圍內(nèi)把HEV 分成4 個(gè)基因型,本研究團(tuán)隊(duì)于2007 年在上海郊區(qū)豬場(chǎng)首次發(fā)現(xiàn)我國大陸存在HEV 基因3 型毒株[18],為戊型肝炎的防控提供了重要的病原信息,而且分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)HEV 的陽性率為26%[12]。 2009 年,周錦萍等[19]對(duì)上海51 個(gè)豬場(chǎng)1 699 份豬糞便樣本進(jìn)行HEV RNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HEV 陽性率為11.83%。

近幾年,鮮有對(duì)上海地區(qū)豬HEV 感染情況的文獻(xiàn)報(bào)道。 為了解近期上海地區(qū)豬HEV 流行情況,本研究對(duì)上海郊區(qū)的3 個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)一個(gè)豬場(chǎng)的HEV 感染率為30%,且具有基因3 型和基因4 型HEV 共存的現(xiàn)象,3 型的感染率為5.6%,4 型的感染率為24.4%,與2008 年于水生等[20]的調(diào)查結(jié)果基本一致,基因3 型HEV 與基因4 型競爭感染中仍舊處于劣勢(shì)。 另外2 個(gè)豬場(chǎng)各45 份樣本中,只發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)豬場(chǎng)1 份為基因4 型的HEV,另一個(gè)豬場(chǎng)中沒有HEV 感染。 本次調(diào)查的豬場(chǎng)間感染率差別大,通過對(duì)豬場(chǎng)的管理和衛(wèi)生情況調(diào)查發(fā)現(xiàn),感染率低的豬場(chǎng)是規(guī)模化豬場(chǎng),豬場(chǎng)管理更完善,并設(shè)有糞污處理設(shè)施,排泄物能及時(shí)清除,衛(wèi)生條件較好,在一定程度上減少了易感豬群傳播感染。

雖然感染豬沒有明顯的肝炎臨床癥狀,但肝臟部位有不同程度的病變[21],對(duì)于相關(guān)生產(chǎn)指標(biāo)有負(fù)面影響,給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。 豬肉是人類主要的肉食品來源之一,豬的肝臟HEV 相關(guān)抗原的陽性檢出率高[21],必然會(huì)對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在威脅,應(yīng)予以關(guān)注,加強(qiáng)豬肉、豬肝食品衛(wèi)生宣傳管理。 建議豬場(chǎng)提高管理水平,重視豬場(chǎng)消毒衛(wèi)生及糞便的無害化處理,以降低HEV 的感染,這些措施也在本研究中零感染的豬場(chǎng)得到了印證。

本研究中,FX01、FX03、FX04、JS01 毒株為基因4 型,與參考毒株SAAS-FX17 的核苷酸同源性為95.2%—96.3%;FX06 毒株屬于基因3 型,與參考毒株SAAS-JDY5 的核苷酸同源性為97.9%。 上述2 個(gè)參考毒株分別為本研究團(tuán)隊(duì)于2009 年、2012 年分離的毒株,并進(jìn)行了全基因序列測(cè)定[22-23]。 同源性分析顯示,本研究中的毒株與10 年前分離于上海的毒株遺傳關(guān)系最近。