高效液相色譜法測定植物油料油脂中生育酚含量

張瑜，王雪妍，汪雪芳，戚欣，馬飛，喻理，張良曉,2*，李培武,2

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(武漢), 湖北 武漢，430062) 2 (湖北省洪山實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070)

生育酚是一類重要的脂溶性維生素，包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚，其體內(nèi)的抗氧化活性為：α-生育酚>β-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚。生育酚廣泛存在于植物油、豆類、堅(jiān)果等食品中，具有改善脂質(zhì)代謝、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、抗衰老和抗癌等功能。中國營養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦居民維生素E的膳食參考攝入量成年人為14 mg/d。人體缺乏生育酚會(huì)引發(fā)生育功能和免疫力下降、代謝失常、機(jī)體衰老等癥狀。ALSHIEK等[1]的研究表明生育酚可改善糖尿病患者的血管功能，RENGARAJ等[2]研究了維生素E對家禽繁殖能力的影響，結(jié)果表明家禽飲食中適量的維生素E可以顯著保護(hù)雄性禽類的精子質(zhì)量和雌性家禽產(chǎn)蛋質(zhì)量。HE等[3]研究發(fā)現(xiàn)膳食中補(bǔ)充50～100 mg/kg的維生素E能顯著改善動(dòng)物的生長和腸道性能。此外，補(bǔ)充維生素E還能顯著增加腸道褶皺的高度和黏膜的厚度。LEESON等[4]研究了青壯年血漿中維生素E，總抗氧化狀態(tài)和血管功能的關(guān)系，結(jié)果顯示年輕時(shí)通過飲食攝入達(dá)到的維生素E濃度和總抗氧化狀態(tài)都與血管內(nèi)皮功能或動(dòng)脈擴(kuò)張性有關(guān)[4]。

食用植物油是居民攝入生育酚的重要來源。油料和食用油中生育酚的分析方法主要包括高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、比色法、電化學(xué)測定法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等。彭祖茂等[5]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測植物油中生育酚、生育三烯酚、植物甾醇、β-胡蘿卜素和角鯊烯等14種營養(yǎng)成分的方法，樣品需要經(jīng)過皂化處理，采用石油醚提取濃縮和梯度洗脫。ZHANG等[6]采用超聲輔助皂化、液液萃取，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時(shí)測定食用油中葉黃素、生育酚、豆甾醇、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素及番茄紅素等8種生物活性物質(zhì)的方法。FENG等[7]報(bào)告了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜生物傳感器用于檢測和定量植物油中的α-生育酚。在以上方法中，液相色譜法作為國家標(biāo)準(zhǔn)方法應(yīng)用范圍最廣，主要包括正向液相色譜法和反向液相色譜法。其中，正相液相色譜法操作簡單，僅需提取油脂后正己烷溶解過膜后即可上機(jī)檢測；反相液相色譜法普適性更廣，但樣品處理復(fù)雜，需皂化、提取、洗滌和濃縮，且方法穩(wěn)定性差、有機(jī)試劑用量大[8-11]。因此，建立前處理簡單高效的反相高效液相色譜法以測定油料油脂中生育酚含量對提高檢測效率和結(jié)果準(zhǔn)確度具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇，賽默飛世爾科技有限公司；異丙醇，德國默克兩合有限公司；BHT2,6-二叔丁基對甲酚(butylated hydroxytoluene，BHT)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

生育酚標(biāo)準(zhǔn)品：α-生育酚(純度≥96%)、β-生育酚(1.0 mg/mL)、γ-生育酚(純度≥96%)、δ-生育酚(純度≥90%)，Sigma aldrich。所有溶劑均為HPLC級。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1200(微盤自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent1200柱溫箱 SL、Agilent1200二極管陣列檢測器 SL、Agilent1200二元泵 SL、Agilent1200高性能自動(dòng)進(jìn)樣器 SL、Poroshell 120 SB-C18液相色譜柱),美國安捷倫公司；AUY 220電子天平，日本島津公司；RephiLe PURIST UV超純水機(jī)，上海樂楓生物科技有限公司；DTC-15 J超聲波清洗機(jī)，鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司；L550臺(tái)式低速大容量離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Kylin-bell 旋渦混合器 VORTEX-5，其林貝爾儀器制造有限公司；15 mL具塞離心管,50 mL具塞離心管，美國Corning公司；Transferpette?S微量移液器，德國BRAND公司；1 mL無菌注射器，武漢市王冠醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；0.22 μm有機(jī)系濾膜，美國Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 植物油料樣品處理

稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)油料樣品，于15 mL離心管中，加5 mL異丙醇，加入0.1 g BHT，渦旋混合器渦旋10 min，50 ℃超聲提取30 min，再一次用渦旋混合器渦旋10 min，4 500 r/min離心5 min，過0.22 μm 有機(jī)系濾膜，待測。

1.3.1.2 植物油樣品處理

稱取0.5 g(精確到0.000 1 g)植物油樣品于15 mL離心管中，異丙醇定容至5 mL，加入0.1 g BHT，渦旋混合器渦旋10 min，0.22 μm的有機(jī)系濾膜，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制5 mg/mL的α-生育酚、5 mg/mL的β-生育酚、5 mg/mL的γ-生育酚和5 mg/mL的δ-生育酚的異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用異丙醇稀釋并配制成1 mg/mL的4種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋至為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于棕色瓶中避光低溫保存。

1.3.3 色譜條件

Poroshell 120 SB-C18液相色譜柱(安捷倫公司)：柱溫30 ℃，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=90∶10,等度洗脫，流速0.75 mL/min，紫外檢測波長294 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 料液比的優(yōu)化

采用傳統(tǒng)方法測定食品中的生育酚的反相液相色譜法，一般要經(jīng)過皂化、提取、洗滌、濃縮等步驟，過程繁瑣、耗時(shí)久。正相液相色譜方法直接正己烷提取即可檢測[12]，但正相液相色譜系統(tǒng)不如反相液相色譜系統(tǒng)使用普遍。如反相液相色譜法，也能將樣品提取溶劑溶解后直接檢測，樣品處理過程簡單快速。

常見的提取生育酚的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇、正己烷、正庚烷、丙酮、甲醇-丙酮、叔丁基甲基醚等，考慮到提取效率高、綠色環(huán)保、不易揮發(fā)穩(wěn)定等因素。異丙醇可以與植物油互溶，提高提取效率，避免損失[13]。對于固體物料，先進(jìn)行渦旋超聲提取，再離心處理，最后取上清液上機(jī)。甲醇和乙醇雖然也可以作為生育酚的提取溶劑，但是甲醇與乙醇和植物油不互溶，造成提取效率低下，而且與甲醇、乙醇相比，異丙醇較穩(wěn)定不易揮發(fā)。因此，選取異丙醇作為提取溶劑。

異丙醇溶液可以溶解食用油，也常用作油脂行業(yè)中棉籽油的萃取劑。稱取0.5 g樣品于離心管內(nèi)，用異丙醇溶解，定容至1、2、5、8、10 mL。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)提取劑定容體積小于5 mL時(shí)，稀釋體積不足，提取效率低，4種生育酚的回收率均低于80%。當(dāng)定容體積為5 mL 時(shí)，4種生育酚的回收率最高。繼續(xù)加大稀釋倍數(shù)，提取劑定容體積增大到8 mL和10 mL時(shí)，4種生育酚的回收率下降。因此，選擇異丙醇定容至5 mL。

圖1 料液比對生育酚提取效率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of tocopherol

2.1.2 超聲溫度

由于提取速率快、溶劑消耗低，超聲輔助提取已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的提取[14]。利用超聲振動(dòng)的方法，打破植物細(xì)胞壁，使溶劑快速地進(jìn)入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含有的有機(jī)成分盡可能地完全溶于有機(jī)溶劑中，得到多成分混合提取液，超聲波已被用于從包括食品中抗氧化劑的提取。本研究對超聲溫度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置了20、30、40、50、60 ℃ 5個(gè)溫度梯度進(jìn)行條件優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，超聲有利于固體油料中生育酚的提取，當(dāng)溫度達(dá)到40、50、60 ℃時(shí)，4種生育酚的提取率較高，當(dāng)超聲溫度為50 ℃時(shí)，4種生育酚的回收率最大。因此，選擇超聲溫度為50 ℃。

圖2 超聲溫度對生育酚提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction efficiency of tocopherol

2.1.2 抗氧化劑用量

維生素E油料油脂中主要的抗氧化劑之一，在空氣中易氧化。為了避免在提取過程中生育酚的氧化損失，參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26635—2011加入抗氧化劑BHT。BHT是食品工業(yè)常用的合成抗氧化劑，用作食品添加劑、制藥、石油產(chǎn)品、橡膠工業(yè)。大量研究表明，含有二叔丁基苯酚基團(tuán)的化合物具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種活性。通過將過氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫來進(jìn)行自動(dòng)氧化反應(yīng)[15-19]。本研究對BHT用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入BHT可提高檢測方法的回收率，且抗氧化劑BHT用量為0.1 g時(shí)4種生育酚的回收率最高。因此，選擇BHT加入量為0.1 g。

圖3 抗氧化劑的用量對生育酚提取效率的影響Fig.3 Effect of antioxidant quality on tocopherol extraction efficiency

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

在高效液相色譜分析中，分離效果很大程度上取決于色譜柱的填料。4種生育酚結(jié)構(gòu)相似、極性接近，傳統(tǒng)的C18色譜柱難以實(shí)現(xiàn)β-生育酚和γ-生育酚基線分離。Poroshell 120色譜柱具有高柱效、高分離度的特點(diǎn)，對復(fù)雜基質(zhì)的樣品具有穩(wěn)定的高性能。本研究采用的Poroshell 120色譜柱粒徑為2.7 μm，由1.7 μm直徑的實(shí)心核和0.5 μm厚的多孔外層構(gòu)成。這種多孔層和實(shí)心核限制了擴(kuò)散距離，提高了分離速度，窄粒徑分布提高了柱效和分離度，可有效分開β-生育酚和γ-生育酚。

2.2.2 流動(dòng)相優(yōu)化

本研究采用檢測最常用的反相高效液相色譜系統(tǒng)，分別用V(甲醇)∶V(乙腈)=50∶50、V(甲醇)∶V(水)=95∶5、V甲(醇)∶V(水)=90∶10、V(甲醇)∶V(水)=85∶15、V(甲醇)∶V(水)=80∶20做流動(dòng)相進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的上機(jī)檢測。甲醇是強(qiáng)洗脫劑，其含量越高，流動(dòng)相的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)，可縮短檢測時(shí)間，但甲醇相比例高會(huì)導(dǎo)致β-生育酚與γ-生育酚或γ-生育酚與α-生育酚無法基線分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在流動(dòng)相為V甲(醇)∶V(水)=90∶10，流速0.75 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，等度洗脫10 min，紫外檢測波長294 nm條件下，4種生育酚能夠得到基線分離，4種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品的峰圖如圖4所示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的質(zhì)量濃度都是20 μg/mL。

圖4 四種生育酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.4 Chromatogram of four tocopherols

2.3 線性關(guān)系與方法檢出限

精確配制5、10、20、50、100 μg/g 5個(gè)濃度梯度的4種生育酚混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)前面優(yōu)化好的液相方法，在流動(dòng)相為V甲(醇)∶V(水)=90∶10，流速為0.75 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，等度洗脫10 min，紫外檢測波長294 nm條件下將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析。4種生育酚的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表1。根據(jù)3倍和10倍信噪比確定4種生育酚化合物的檢測限和定量限。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的檢出限分別是0.16、0.21、0.20、0.22 μg/g。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚的定量限分別是0.53、0.68、0.66、0.72 μg/g，均低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法(GB/T 5009.82—2016)。分析結(jié)果表明這4種生育酚化合物的相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999 2、0.999 4、0.999 3和0.999 8，說明這4種化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系好。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear equation，linear ranges，correlation coefficients (R2), limit of detections (LODs) and limit of quantifications (LOQs) of target compounds

2.4 方法重現(xiàn)性、回收率與精密度

本研究分別在菜籽油樣品中加入1、10、100 μg/g 3種不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，算得的濃度減去空白樣品中生育酚的濃度計(jì)算方法的回收率。α-生育酚的回收率為92%～95%，β-生育酚的回收率為87%～101%，γ-生育酚的回收率為99%～109%，δ-生育酚的回收率為95%～98%。進(jìn)而，對方法精密度進(jìn)行考察，包括日內(nèi)精密度和日間精密度。精密度是對同一個(gè)菜籽油提取和測定3次，并連續(xù)做3 d，計(jì)算結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，日內(nèi)和日間檢測結(jié)果方法RSD均小于15%，本方法具有較好的準(zhǔn)確性與精密度。

2.5 方法應(yīng)用

將該方法應(yīng)用于大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、棕櫚油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油、亞麻籽油、山茶油等10種主要植物油和油菜籽、芝麻、紫蘇等油料中的生育酚含量測定。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，大豆油的總生育酚含量最高，為971.86 mg/kg，葵花籽油中α-生育酚含量最高；而棕櫚油、橄欖油、葡萄籽油中生育酚的含量較低。以上結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道植物油中生育酚含量相符[7,20-21]。YANG等[22]綜述了不同形式的生育酚在營養(yǎng)和藥理水平上的人類和實(shí)驗(yàn)室防癌活性的最新研究結(jié)果，α-生育酚是動(dòng)物體內(nèi)維生素E的主要形式, 在實(shí)現(xiàn)維生素E的基本抗氧化功能方面具有最高的活性, 由于氧化應(yīng)激參與腫瘤的發(fā)生, α-生育酚的防癌活性已被廣泛研究。

表2 方法的回收率和精密度(n=3)Table 2 Recoveries and precision of the method(n=3)

表3 實(shí)際樣品中生育酚的含量及組成 單位：mg/kg

3 結(jié)論

本文建立了油料中生育酚的反相高效液相色譜的檢測方法。用異丙醇做提取溶劑直接溶解植物油或油料樣品，采用超聲方法提高油料中生育酚，與國標(biāo)方法比較，減少了皂化、提取、洗滌和濃度等步驟，方法操作簡單；相比正己烷、甲醇、乙醇、丙酮等溶劑相比，本方法采用異丙醇提取效率更高，提高了提取效率和回收率。同時(shí)，減少了有機(jī)試劑的用量，更加綠色環(huán)保。方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，本方法可在10 min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)4種生育酚的完全基線分離，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的檢出限分別是0.16、0.21、0.20、0.22 μg/g，定量限分別是0.53、0.68、0.66、0.72 μg/g，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 2，回收率為87%～109%，精密度為1.88%～9.89%。該方法操作簡單、檢測時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確，為油料油脂中生育酚檢測提供重要技術(shù)支撐。