不同采收月份龍腦樟葉揮發(fā)油的成分分析及含量測定

崔 露 曾慶錢 馮 銳 鄧 婕 崔媛媛 李 璇

（廣東省中藥研究所，廣東 廣州 510653）

龍腦樟Cinnamomum caraphora(L.) Presl是20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)的樟科樟屬植物樟中的一種新化學(xué)類型，是我國天然冰片（右旋龍腦）來源最主要的藥用植物資源之一，解決了我國天然冰片常年依靠進(jìn)口的問題。天然冰片具有開竅醒神，清熱止痛的功能。2020年《中國藥典》（一部）中收錄含冰片中成藥有170多個(gè)，天然冰片較冰片的安全性高，其中四味珍層冰硼滴眼液（天然冰片）、復(fù)方熊膽滴眼液、障翳散、夏天無滴眼液等眼部用藥規(guī)定只能使用天然冰片。近幾年我國對于天然冰片研發(fā)不斷深入，目前天然冰片已經(jīng)能夠用于日化用品和藥品中。隨著應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，我國天然冰片需求持續(xù)增長，出口量也在增長，市場潛力巨大。

湯行昊等發(fā)現(xiàn)9-11月是龍腦樟枝葉快速生長期，12月進(jìn)入穩(wěn)定期。9-12月龍腦樟生物量及揮發(fā)油得率最高，適宜龍腦樟的采收。本課題組首次研究了這四個(gè)月份龍腦樟葉揮發(fā)油的成分及相對含量的變化情況，測定了右旋龍腦、樟腦和異龍腦三個(gè)指標(biāo)成分的含量。本研究首先采用水蒸氣蒸餾提取了9-12月的龍腦樟葉揮發(fā)油并計(jì)算得率，再采用GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析提取物，利用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對含量；最后通過GC-MS外標(biāo)對照品法測定了各月份揮發(fā)油中右旋龍腦、樟腦、異龍腦的含量，為龍腦樟葉揮發(fā)油成分分析和合理采收提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料、試劑與儀器

1.1 材料

從韶關(guān)市紅梨村龍腦樟種植基地采收的9月下旬、10月下旬、11月下旬、12月下旬的龍腦樟鮮葉。

1.2 儀器與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津，GCMS-TQ8040）、萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BSA 224S-CW）、1000μL移液槍（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，eppendorf）、調(diào)溫電熱套（上海弘懿儀器設(shè)備有限公司）、變色硅膠干燥器、圓底燒瓶、球形冷凝管、揮發(fā)油提取器、量筒、容量瓶、燒杯、錐形瓶、滴管、坩堝、微孔濾膜過濾器0.45 μm。

對照品右旋龍腦（天然冰片）( 中國食品藥品檢定研究院，批號： 111688-201602，純度為≥99.6% )，異龍腦（中國食品藥品檢定研究院，批號： 111512-201904，純度≥98.4%），樟腦（中國食品藥品檢定研究院，批號： 110747-202011，純度為≥98.8%）；丙酮（色譜純）、乙酸乙酯（分析純），純水。

2.方法

2.1 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油的提取

2.1.1 準(zhǔn)備龍腦樟葉

先將龍腦樟鮮葉用清水洗凈，在室溫下晾干表面水分后，剁碎備用。

2.1.2 龍腦樟葉揮發(fā)油的提取

取四個(gè)月下旬的龍腦樟鮮葉，按“2.1.1”項(xiàng)下方法準(zhǔn)備龍腦樟葉，每月各3份，每份100g，置于5L圓底燒瓶中，加水2L，電熱套加熱溫度設(shè)置在100℃-110℃，蒸餾至揮發(fā)油不再增加（約2h）。本研究提取揮發(fā)油的溫度在100℃-110℃條件下，因?yàn)樵摐囟认聯(lián)]發(fā)油得率較高，超過120℃會(huì)導(dǎo)致冰片脫氫或裂解。停止加熱后，待冷卻后開啟提取器下端活塞，將水放出，用適量乙酸乙酯溶解揮發(fā)油并轉(zhuǎn)移到坩堝中，待乙酸乙酯揮干后，再放入硅膠干燥器中干燥后稱重，計(jì)算揮發(fā)油得率。揮發(fā)油得率=揮發(fā)油重量/龍腦樟葉重量*100%。

2.2 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

2.2.1 供試品溶液制備

每次精密稱取龍腦樟揮發(fā)油提取物10mg，置于10mL量瓶中，用丙酮溶解定容，用微孔濾膜過濾，作為供試品溶液進(jìn)行GC-MS分析。

2.2.2 GC-MS分析

GC條 件：InertCap WAX (30m×0.25mm×0.25μm)色譜柱；初始溫度60℃，保持2 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流比為20:1。MS條件：EI離子源溫度為230℃，電子轟擊能量為70 eV，溶劑延遲4 min；質(zhì)量掃描范圍（m/z）33～500，采集模式為全掃描。色譜-質(zhì)譜接口溫度：250℃。各分離組分采用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院NIST 2014及NIST 2014s標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索與定性，采用峰面積歸一化法確定揮發(fā)油組分的相對含量。

2.3 外標(biāo)對照品法測定揮發(fā)油中指標(biāo)成分含量

2.3.1 對照品溶液制備

精密稱取右旋龍腦、樟腦、異龍腦對照品適量加丙酮制備成濃度為4.572mg/mL、1.407mg/mL、1.518mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別精密吸取適量體積的右旋龍腦、樟腦、異龍腦的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液后加入10mL容量瓶中，用丙酮定容制成濃度為90.54μg/ml、98.49μg/ml，1.518μg/ml的C對混合對照品溶液。

圖1 對照品和供試品溶液的GC色譜。A．混合對照品溶液；B．供試品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備

取龍腦樟葉揮發(fā)油約1mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3.3 指標(biāo)成分含量測定

2.3.3.1 色譜條件

GC條件：InertCap WAX（30m×0.25mm×0.25μm）；初始溫度60℃，保持2 min，以5℃/min升至250℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為氦氣（純度≥99.999%）；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL，分流比20:1。MS條件：EI離子源溫度為230℃，電子轟擊能量為70eV，溶劑延遲10min；采用離子檢測（SIM）模式。色譜-質(zhì)譜接口溫度：250℃。

2.3.3.2 方法學(xué)考察

取“2.3.1”項(xiàng)下制備的混合對照品溶液，按“2.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算右旋龍腦、樟腦、異龍腦的峰面積和保留時(shí)間的RSD均＜2%，表明儀器精密度良好。取“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液6份，按“2.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算右旋龍腦、樟腦、異龍腦的峰面積和保留時(shí)間的RSD均＜2%，表明該方法重復(fù)性良好。取“2.3.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，按“2.3.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別于0，2，4，8，12，24h進(jìn)樣測定，計(jì)算右旋龍腦、樟腦、異龍腦的峰面積和保留時(shí)間的RSD均＜2%，表明供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3.3 校正因子f計(jì)算

取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定對照品峰面積（Ai），計(jì)算校正因子，

f -校正因子；C對-對照品溶液中目標(biāo)物濃度；Ai-對照品溶液每次進(jìn)樣的目標(biāo)物峰面積；-對照品溶液多次進(jìn)樣的目標(biāo)物峰面積平均值；n-對照品溶液進(jìn)樣次數(shù)。目標(biāo)物指右旋龍腦、樟腦和異龍腦。

2.3.3.4 供試品含量測定

取不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油供試品溶液，按“2.3.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，重復(fù)測定3次。計(jì)算供試品中右旋龍腦、樟腦和異龍腦的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X，結(jié)果見表6。

表6 龍腦樟葉揮發(fā)油中指標(biāo)成分的含量測定

X-目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)%；A供-供試品進(jìn)樣的目標(biāo)物峰面積；M-供試品取樣量；溶解體積-丙酮定容10mL。

3.結(jié)果與分析

3.1 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油得率結(jié)果

根據(jù)2.1.2測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1），11月的揮發(fā)油得率最高，揮發(fā)油得率的排列順序?yàn)?1月（1.70%）＞10月（1.66%）＞9月（1.61%）＞12月（1.55%），揮發(fā)油含量從9月開始增加，11月達(dá)到最高，12月開始下降。

表1 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油得率

1 100 1．70 1．70 10月1．66 1．58 2 100 1．65 1．65 3 100 1．64 1．63 11月1 100 1．66 1．66 1．70 1．99 2 100 1．72 1．72 3 100 1．74 1．77 12月1 100 1．40 1．40 2 100 1．56 1．56 3 100 1．45 1．45 1．47 1．55

3.2 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油成分分析結(jié)果

按2.2.1方法制備不同月份揮發(fā)油的供試品溶液，在2.2.2條件下進(jìn)樣分析，測定結(jié)果見圖2、表2-表5。10月和11月的揮發(fā)油化學(xué)成分相對較少，分別為11個(gè)和13個(gè)，9月和12月的揮發(fā)油成分均有16個(gè)。這四個(gè)月份揮發(fā)油最主要成分是右旋龍腦，峰面積占比達(dá)到80%以上，其他主要成分還有樟腦、甲酸龍腦酯、乙酸龍腦酯、桉油烯醇，這5種成分的峰面積分別占到總峰面積的96.4%、99.15%、99.29%和95.13%。10月和11月的右旋龍腦的相對峰面積占比基本相同，相對含量約達(dá)95.9%，其次是9月（91.87%），12月（83.82%）最低。12月的甲酸龍腦酯與乙酸龍腦酯峰面積占比分別為4.42%、4.42%，二者合起來高達(dá)8.84%，顯著高于9月（3.02%）、10月（2.36%）和11月（2.00%）。

圖2 不同月份龍腦樟葉揮發(fā)油的GC-MS色譜。A． 9月份；B． 10月份；C． 11月份；D． 12月份。

表2 9月份龍腦樟葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析

9 17．316 C10H18O 右旋龍腦 91．87 10 17．592 C15H24 β-芹子烯 0．56 11 23．450 C15H24O 石竹烯氧化物 0．86 12 24．630 C15H24O 葎草烯環(huán)氧化物 1．27 13 24．812 C15H26O 反式-橙花叔醇 0．15 14 26．399 C15H24O 桉油烯醇 0．47 15 28．858 C15H26O 十氫二甲基甲乙烯基萘酚 0．19 16 30．574 C15H22O α-香附酮 0．19

表3 10月份龍腦樟葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析

表4 11月份龍腦樟葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析

表5 12月份龍腦樟葉揮發(fā)油成分的GC-MS分析

15 28．914 C15H26O 十氫二甲基甲乙烯基萘酚 0．27 16 30．639 C15H22O α-香附酮 0．13

3.3 供試品中指標(biāo)成分含量的結(jié)果

根據(jù)2.3.3.4測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同月份的龍腦樟葉揮發(fā)油中右旋龍腦含量順序?yàn)?1月（94.23%）＞10月（92.94%）＞12月（85.71%）＞9月（81.41%），其 中，11月的龍腦樟葉揮發(fā)油的右旋龍腦含量最高為94.23%；樟腦含量順序?yàn)?月（0.48%）＞11月（0.32%）＞12月（0.25%）＞10月（0.24%）；異龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在0.02%和0.03%左右，含量極低。

4.討論

龍腦樟以其葉片的精油含量最高，是枝的3-5倍，因此在制備龍腦樟提取物料時(shí)，不同月份龍腦樟枝葉重量比例的差異會(huì)直接影響揮發(fā)油得率，所以本研究將龍腦樟鮮葉作為實(shí)驗(yàn)對象，可減少實(shí)驗(yàn)誤差。本研究在相同條件下提取了這四個(gè)月份下旬的龍腦樟鮮葉揮發(fā)油，減少操作誤差，每個(gè)月的揮發(fā)油提取率RSD均＜2%。通過分析這四個(gè)月龍腦樟葉揮發(fā)油成分的種類及相對含量的差異，發(fā)現(xiàn)10月和11月的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量較9月和12月的少，且右旋龍腦的相對含量最高（面積歸一化法）約95.9%，說明10-11月龍腦樟生成次生代謝產(chǎn)物更單一，右旋龍腦的生物合成途徑更強(qiáng)。這四個(gè)月份的主要化學(xué)成分較相似，除右旋龍腦外，樟腦、甲酸龍腦酯、乙酸龍腦酯、桉油醇的含量也相對較高。該5種成分的峰面積分別占到每月總峰面積的96.4%、99.15%、99.29%和95.13%。其中，12月的甲酸龍腦酯和乙酸龍腦酯的相對含量明顯高于前3個(gè)月，分別達(dá)到4.42%、4.42%，表明該月甲酸龍腦酯和乙酸龍腦酯的生物合成量增加，可就該現(xiàn)象進(jìn)行下一步研究。

從這四個(gè)月份下旬的龍腦樟葉揮發(fā)油得率和指標(biāo)成分（右旋龍腦、樟腦、異龍腦）的含量測定結(jié)果來看，11月下旬采收的揮發(fā)油得率（1.77%）和右旋龍腦含量（94.23%）均最高，為最佳采收期；右旋龍腦含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞80%，樟腦含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＜1%，異龍腦含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.02%-0.03%之間。熊科元等采用GC-MS法也檢測到3年生的龍腦樟枝葉揮發(fā)油中含少量異龍腦，峰面積占比為1.90%，因此，本研究檢測到龍腦樟葉揮發(fā)油中含有極少量異龍腦的實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常。