銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠催醒的作用

孫 睿， 王振紅， 謝欣怡

(1.江蘇省人民醫(yī)院溧陽分院麻醉科，江蘇省溧陽市 213300；2.南京市第一醫(yī)院麻醉科，江蘇省南京市 210000)

隨著各類手術(shù)和無痛診療技術(shù)的不斷發(fā)展，全身麻醉的應(yīng)用范圍也越來越廣泛[1]。右美托咪定是臨床常用的麻醉藥物，屬于高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑，盡管右美托咪定在實踐中體現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值，但術(shù)后對患者循環(huán)、呼吸的抑制作用無法立即恢復(fù)正常，需要采取必要手段使患者盡快蘇醒，以減少相關(guān)并發(fā)癥[2]。阿替美唑是α2-腎上腺素能受體的拮抗劑，具有高效性、高特異性和高專一性的特點，但其臨床應(yīng)用仍需要更多的安全性研究[3]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中分離純化的提取物，具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)、增強記憶等生理活性[4]。本研究旨在探討銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠催醒作用及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

32只昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2019-0001。銀杏葉提取物滴劑(德國威瑪舒培博士藥廠)，右美托咪定(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，阿替美唑(美國輝瑞動物保健品有限公司)，Ca2+ATP酶、Mg2+-ATP酶、一氧化氮(nitric oxide,NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，cGMP)ELISA試劑盒(上海一基生物試劑有限公司)，Orexin A、Orexin B、β-actin蛋白一抗(美國Abcam)。

1.2 動物分組與處理

取32只昆明種小鼠隨機分為對照組、阿替美唑組、銀杏葉提取物低劑量組(低劑量組)及銀杏葉提取物高劑量組(高劑量組)，每組8只；各組小鼠腹腔注射1 mg/kg右美托咪定，90 min后分別注射2 mg/kg阿替美唑、50 mg/kg及100 mg/kg銀杏葉提取物，對照組以生理鹽水替代。

1.3 鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評估

參照Granholm等[5]評分標(biāo)準(zhǔn)，于右美托咪定給藥后90、95、120及180 min，對小鼠進行鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分，其中鎮(zhèn)靜評分從自主體位(0～4分)、對聲音刺激的反應(yīng)(0～3分)、下頜及舌張力(0～3分)方面進行評估，總分值越高表明鎮(zhèn)靜效果越好；用鉗夾鼠爪進行鎮(zhèn)痛評分(0～3分)，分值越高表明鎮(zhèn)痛效果越好。

1.4 蘇醒時間記錄

以小鼠翻正反射消失持續(xù)時間為蘇醒時間。翻正反射消失評估標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)3次仰臥后5 s無法恢復(fù)站立，翻正反射恢復(fù)評估標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)3次仰臥后可恢復(fù)站立[6]。

1.5 取材

各組小鼠蘇醒并完成鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評估后斷頭處死，迅速取出腦組織，放入生理鹽水制備組織勻漿液，2 000 r/m離心10 min，分離上清液凍存待測。

1.6 腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性、NO、NOS及cGMP含量檢測

采用比色法，檢測各腦區(qū)Ca2+、Mg2+-ATP酶、NO及NOS含量，采用ELISA法檢測cGMP含量，蛋白定量后，以每小時每毫克組織蛋白中ATP產(chǎn)生的1 mol無機磷的量為一個ATP酶活力單位。

1.7 腦組織Orexin A和Orexin B蛋白表達檢測

采用蛋白印跡法檢測腦組織中Orexin A和Orexin B蛋白表達，提取腦組織總蛋白，定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入封閉液中室溫孵育2 h，再分別加入Orexin A、Orexin B、β-actin蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃下孵育過夜，次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的蛋白二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，最后暗室中曝光顯影，結(jié)果用Image J軟件進行灰度值定量，計算目標(biāo)蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析與處理，計量資料采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分的影響

右美托咪定麻醉90 min時，各組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；麻醉給藥95、120及180 min時，與對照組比較，阿替美唑組和高劑量組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分均降低(P<0.05)，且麻醉給藥95、120及180 min時，阿替美唑組和低劑量組鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分的影響 單位：分

2.2 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠蘇醒時間的影響

對照組、阿替美唑組、低劑量組及高劑量組小鼠蘇醒時間分別為(90.56±11.84) min、(24.35±5.58) min、(83.62±10.62) min、(42.68±7.14) min，各組蘇醒時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組比較，阿替美唑組和高劑量組蘇醒時間縮短，且阿替美唑組蘇醒時間短于高劑量組(P<0.05)。

2.3 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的影響

與對照組比較，阿替美唑組和高劑量組Ca2+、Mg2+-ATP酶活性升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組Ca2+、Mg2+-ATP酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表2)。

表2 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的影響 單位：mol Pi/(mg·h)

2.4 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織NO/cGMP信號通路的影響

與對照組比較，阿替美唑組和高劑量組NO、NOS活性及cGMP水平升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組NO、NOS活性及cGMP水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表3)。

表3 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織NO/cGMP信號通路的影響

2.5 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的影響

與對照組比較，阿替美唑組和高劑量組OrexinA和OrexinB蛋白表達明顯升高(P<0.05)，阿替美唑組和低劑量組OrexinA和OrexinB蛋白表達的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;圖1和表4)。

圖1 小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的表達

表4 銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠腦組織Orexin系統(tǒng)的影響

3 討 論

高齡、電解質(zhì)紊亂、麻醉藥物、體溫過低等因素均可引起患者全麻后蘇醒延遲[7]。臨床使用藥物催醒存在一定的不良反應(yīng)，需要探索高效、安全的催醒手段。銀杏葉提取物是目前應(yīng)用最為廣泛的植物藥提取物之一，含有黃酮類、萜類內(nèi)酯、有機酸等多種活性成分，常用于心腦血管疾病的治療[8]。近期研究表明，銀杏葉提取物對患者全身麻醉后認(rèn)知功能障礙具有防治作用[9]。同時，本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)，對右美托咪定麻醉小鼠注射銀杏葉提取物后可加快小鼠的蘇醒，但具體機制尚不清楚。蘇醒延遲是全身麻醉常見的并發(fā)癥，本研究以不同劑量銀杏葉提取物處理右美托咪定麻醉小鼠，發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物可明顯降低麻醉小鼠的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛評分，顯著縮短其蘇醒時間。

ATP酶是一類能將ATP水解為二磷酸腺苷和磷酸根離子的酶，普遍存在于活細胞內(nèi)，參與物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞及維持細胞膜完整等過程[10]。Ca2+、Mg2+-ATP酶是體內(nèi)的鈣離子泵，可維持細胞內(nèi)低含量的游離Ca2+，其活性水平反映出線粒體功能和能量代謝水平[11]。據(jù)報道，麻醉過程中，麻醉藥物可引起腦組織突觸體Ca2+、Mg2+-ATP酶活性的變化，引起突觸內(nèi)Ca2+含量變化，釋放突觸前異質(zhì)性神經(jīng)遞質(zhì)，阻滯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮麻醉性鎮(zhèn)痛作用[12]。本研究結(jié)果顯示，注射銀杏葉提取物后腦組織Ca2+、Mg2+-ATP酶活性明顯提高，有利于維持神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+含量低穩(wěn)態(tài)，從而降低右美托咪定的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛效果，縮短小鼠蘇醒時間。

NO/cGMP信號通路是胞內(nèi)重要的信號通路，參與多種生理過程，如細胞生長、神經(jīng)傳遞、肌肉收縮等[13]。NO/cGMP信號通路與中樞神經(jīng)通路的興奮性與抑制性密切相關(guān)，神經(jīng)細胞內(nèi)NO、cGMP含量升高可引起興奮性，維持機體清醒狀態(tài)[14]。本研究中，高劑量銀杏葉提取物可提高小鼠腦組織中NO、NOS活性及cGMP水平，這可能也是銀杏葉提取物促進麻醉小鼠蘇醒的潛在途徑之一。

腦內(nèi)睡眠和覺醒系統(tǒng)對于睡眠和覺醒的產(chǎn)生與維持有重要作用，神經(jīng)肽Orexins作為覺醒系統(tǒng)的主要成分，由下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生，還可參與機體攝食、能量代謝、免疫功能等生理調(diào)控[15]。Orexins系統(tǒng)的激活有助于麻醉蘇醒和疼痛控制[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，高劑量銀杏葉提取物組OrexinA和OrexinB蛋白表達量升高，表明銀杏葉提取物可能通過促進Orexins系統(tǒng)，發(fā)揮催醒作用。雖然阿替美唑的催醒效果最好，但銀杏葉提取物也能縮短蘇醒所用時間，且其耐受性良好，具有較高的應(yīng)用價值。

綜上所述，銀杏葉提取物對右美托咪定麻醉小鼠具有催醒作用，可能與提高Ca2+、Mg2+-ATP酶活性、促進NO/cGMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Orexin系統(tǒng)有關(guān)，這為臨床催醒藥物的選擇提供了新的思路。